INVESTIGACIÓN

Matriz para ingenieria de tejido oseo: modificacion superficial con zinc Estudio preliminar

 

Cristian Martinez*, Daniel Olmedo** y Andres Ozols^#

*Facultad de Odontología, Universidad Nacional de Cuyo,
**Facultad de Odontología, Universidad de Buenos Aires,
^#Facultad de Ingeniería, Universidad de Buenos Aires

Correspondencia: Dr. CRISTIAN MARTINEZ cm10_10@hotmail.com

Recibido el 26-5-2013.
Aceptado luego de la evaluación el 3-9-2013.

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Resumen

El objetivo del presente trabajo es desarrollar un metodo de sintesis de matrices para ingenieria de tejidos, capaces de acelerar los procesos reparativos y disminuir el riesgo de infeccion, destinadas a cirugias reconstructivas que involucren el tejido oseo. A este fin se emplea la fase mineral de hueso bovino, la hidroxiapatita, conservando su estructura tridimensional. Esta se obtiene a partir de un proceso de lavado quimico, seguido de un proceso termico que elimina todos los componentes organicos. Esta matriz es modificada superficialmente con oxido de zinc (ZnO), elemento reconocido por su accion en diversos procesos biologicos y su accion antibacteriana. El procedimiento involucra la intrusion de dispersiones de ZnO en solucion de alcohol-1,2,3 propanotriol, efectuadas en un bano termico y el ulterior sinterizado a alta temperatura. El grado de fijacion y la concentracion del Zn sobre la matriz de hidroxiapatita se determinan por medio de microscopia electronica y espectrometria en energias. La difraccion de rayos X muestra que la incorporacion de los iones de Zn en la superficie forma fosfatos de Zn. El original proceso desarrollado permite modificar, en forma sencilla, injertos oseos sinteticos, otorgando capacidad antibacteriana y osteoproliferativa al sustrato osteconductor.

Palabras clave: Ingeniería de tejidos; Hidroxiapatita; Matrices; Zinc.

Abstract

Scaffold for bone tissue engineering: superficial modification with zinc. Preliminary study

The aim of this study is to develop a method of matrix synthesis for tissue engineering, capable of accelerating reparative processes and reducing the risk of infection, destined to reconstructive surgeries involving bone tissue. For this purpose the bovine bone mineral phase, hydroxyapatite, was used while retaining its dimensional structure. This is obtained from a chemical wash process followed by a thermal process that removes the entire organic components. This matrix is superficially modified with zinc oxide (ZnO), element known for its action in various biological processes and its antibacterial action. The procedure involves the intrusion of ZnO dispersions in alcohol solution-1,2,3-propanetriol, made in a thermal bath and the subsequent high temperature sintering. The degree of attachment and the Zn concentration on the hydroxyapatite matrix is determined by electron microscopy and energy spectrometry. X-ray diffraction shows that the incorporation of Zn ions in the surface forms Zn phosphates. The developed original process allows modifying in a simple way synthetic bone grafts, by providing antibacterial and osteoproliferative properties to the osteoconductive substrate.

Key words: Tissue engineering; Hydroxyapatite; Scaffolds; Zinc.

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Introducción

La regeneracion osea involucra una serie de complejos e intrincados eventos biologicos que implican senales moleculares, factores de crecimiento y celulas en el sitio de la lesion.¹ La ingenieria de tejidos para este fin utiliza matrices degradables (scaffolds) para promover la regeneracion del hueso. Estas matrices deben poder ser reemplazadas por el tejido del huesped, deben ser porosas para permitir la vascularizacion y no deben producir una respuesta inmunogenica en el paciente.² La hidroxiapatita (HA; Ca₁₀[PO₄]₆[OH]₂) es un biomaterial ampliamente utilizado para reemplazo del tejido oseo, debido a su excelente biocompatibilidad.² Este fosfato de calcio es el elemento constituyente inorganico principal del tejido oseo y, a su vez, es el reservorio mas importante de calcio y fosforo del organismo. Una matriz biodegradable basada en este biomaterial, con macro y microporosidad interconectadas similares a las del tejido oseo, otorga un microambiente adecuado para su vascularizacion y la ulterior regeneracion del tejido.³ El zinc (Zn) es conocido por sus propiedades antibacterianas y es un elemento metalico indispensable para la proliferacion celular y el remodelado de la matriz extracelular. ^4-7 La evidencia actual sostiene que el Zn desempena un papel importante en la mineralizacion:^8-13 actua como catalizador de las metaloproteinasas de la matriz para su remodelado, induce a la apoptosis a los osteoclastos maduros e inhibe su formacion, y estimula la proliferacion de osteoblastos. ^6-7 Estas propiedades convertirian al Zn en un elemento que aceleraria el proceso reparativo del tejido oseo. Los antecedentes referidos motivan este trabajo preliminar, que propone la sintesis de una matriz de estructura tridimensional modificandola superficialmente con Zn. La tecnica propuesta involucra la intrusion de una dispersion organica de particulas de ZnO en la matriz, a fin de lograr su anclaje superficial y, luego, fomentar la union quimica del compuesto con la HA mediante un proceso de tratamiento termico a alta temperatura (sinterizado).

Materiales y métodos

Fabricación de las matrices
La preparacion de las matrices se realizo a partir de hueso esponjoso fresco de 5 cabezas femorales bovinas, que fueron cortadas en cubos de 15 x 10 x 10 mm³. Se prepararon 50 piezas para ser divididas posteriormente en cinco grupos de acuerdo con la temperatura de sinterizado (900, 1000, 1100 y 1200°C) y un grupo sin tratamiento. Las muestras fueron sometidas a secuencias reiteradas de lavados con soluciones acuosas de acido acetico y peroxido de hidrogeno al 1% (en peso) en agua bidestilada (Quimica Oeste, Argentina) y enjuagues en agua bidestilada pura, a fin de desengrasar y evitar la fijacion de hemoglobina al hueso. Estas piezas fueron secadas en estufa y llevadas a un horno electrico (ORL, Argentina) para el pirolizado lento (10°C/min) de los restos organicos bajo flujo de aire, hasta alcanzar 900°C, temperatura mantenida durante 2 horas, hasta obtener cubos de hueso blanco y libre de cualquier mancha de color (Fig. 1).

Figura 1. Micrografia de la matriz natural de hidroxiapatita, microscopia electronica de barrido, aumento x300. Margen superior derecho: Imagen macroscopica con las dimensiones de la matriz. Debajo: Espectro resultante del analisis elemental con espectrometria dispersiva en energia, donde se evidencia la presencia de calcio y fosforo, elementos constituyentes de la hidroxiapatita.

Preparación de la dispersión con partículas de ZnO
Se prepararon 500 ml de una dispersion de particulas ZnO, de tamano inferior a 2 μm (Anedra, Argentina) y concentracion del 2% (en peso), en una solucion organica, constituida por una solucion de 50% (en peso) de propanotriol (C₃H₈O₃) (Saporiti, Argentina) y agua bidestilada (Quimica Oeste, Argentina). La homogeneidad y la estabilidad de la dispersion fueron mantenidas un vaso de precipitado por medio de un agitador magnetico (Decalab, Argentina) a 100 rpm y a 90°C.

Preparación de la matriz funcionalizada
Las matrices de HA fueron inmersas en una solucion de acido fosforico (Quimica Oeste, Argentina) al 30% durante 20 segundos, a fin de generar una superficie mas reactiva (con enlaces quimicos libres), y enjuagadas en agua bidestilada (para eliminar los fosfatos solubles). Luego, las matrices fueron inmersas en la dispersion de particulas de ZnO, que es mantenida a 90°C bajo agitacion, durante 20 segundos. Finalmente, los cubos fueron secados en estufa y sometidos a calentamiento lento (5°C/min), hasta las temperaturas de sinterizado a 900, 1000, 1100 y 1200°C en aire, donde permanecieron durante 2 horas.

Microestructura, composición química local y análisis de fases
La microestructura y la composicion quimica local fueron analizadas por medio de un microscopio electronico de barrido (Philips 505, Alemania) y con un espectrometro de rayos X (EDX, EDAX 9100, Alemania), respectivamente. Las fases cristalinas de las matrices modificadas superficialmente fueron determinadas por difraccion de rayos X (XRD, Rigaku, Japon), empleando radiacion de CuKá (ë = 0,1542 nanometros) con filtro de Ni, utilizando un goniometro vertical con un angulo de barrido 2è de 20-70° y con un paso de 0,2°.

Resultados

Las observaciones de las matrices en el microscopio electronico de barrido exhiben un tamano de poro de hasta 350-500 μm, integrando una estructura tridimensional de porosidad interconectada. Los grupos de matrices sinterizadas a 900, 1000, 1100 y 1200°C no muestran diferencias sustanciales en la incorporacion y distribucion, relativamente uniforme, de las particulas con Zn de acuerdo con las comparaciones efectuadas con microscopia electronica de barrido con la muestra sin tratamiento termico. La concentracion promedio de Zn, medida por espectrometro de rayos X, en varias regiones de 100 x 100 μm² de cada tipo de matriz resulta (1,01 } 0,11)% (en peso) (Fig. 2). Sin embargo, la diferencia entre las muestras sinterizadas con la no sinterizada radica en la capacidad de fijacion de las particulas al sustrato de la matriz. El tratamiento termico logra este objetivo por medio de la reaccion en estado solido del ZnO con la HA, formando un compuestos identificados como fosfatos de Zn hidratado [Zn₃ (PO₄)2.4H₂O] y no hidratado [Zn₃ (PO₄)₂], ademas de la matriz de HA, de acuerdo con el analisis de difraccion de rayos X efectuado sobre las matrices de cada una de las temperaturas de sinterizado (Fig. 3). Esto marca una diferencia con las matrices no sinterizadas, que solo exhiben el ZnO sobre la matriz de HA.

Figura 2. Micrografia de la pared de la matriz tridimensional de hidroxiapatita para ingenieria de tejido oseo. Se observa la distribucion uniforme de las particulas de ZnO, microscopia electronica de barrido, aumento x1000. Margen superior izquierdo: Espectro resultante del analisis elemental con espectrometria dispersiva en energia, que evidencia la presencia de calcio, fosforo y zinc sobre la superficie

Figura 3. Difraccion de rayos X, donde se puede evidenciar la formacion de compuestos hidratados y no hidratados de fosfato de zinc sobre la superficie de la matriz para ingenieria de tejido oseo. Margen superior derecho: Microscopia electronica de barrido, aumento x500. Se observan las matrices modificadas en la superficie. Margen derecho al centro: Espectro resultante del analisis elemental con espectrometria dispersiva en energia, que evidencia la presencia de calcio, fosforo y zinc.

Discusión

El metodo propuesto permitio lograr una distribucion relativamente uniforme de las particulas con Zn sobre las paredes de los poros de la matriz para ingenieria de tejidos, garantizando su union quimica con el sustrato. El sinterizado ha permitido la formacion de una nueva fase, el fosfato de Zn [Zn₃ (PO₄)₂] o su forma hidratada [Zn₃ (PO⁴)₂.4H²O], conocida como hopeita o parahopeita,^14,15 que es anclada en la superficie de la matriz, preservando la arquitectura y la estructura cristalina de la HA. Estos fosfatos son perfectamente biocompatibles, solubles en medio fisiologico¹⁶ y cuentan con una disponibilidad biologica mayor que la alcanzada con procesos de sintesis quimica, que incorporan al Zn dentro de la estructura cristalina de la HA, y no en la superficie. Esta caracteristica limita seriamente la disponibilidad biologica de los iones Zn⁺², debido a la conocida baja solubilidad de la HA en el organismo.
La sintesis quimica se basa en la coprecipitacion de precursores de iones de Ca⁺², PO₄ ^-3 y Zn⁺², proceso que depende del pH, la temperatura y el tiempo de reaccion en soluciones acuosas,15-18 donde el Zn⁺² entra en la celda cristalina de la HA por medio de la sustitucion de iones de Ca⁺² por iones de Zn⁺² (energeticamente desfavorable y del orden de 0,01% molar) y la ocupacion de vacancias de Ca⁺².¹⁷ Los procesos de sintesis quimica solo permiten la obtencion de productos granulados sin estructura porosa. Esto es diferente de lo que ocurre con el sinterizado, donde se produce una reaccion quimica de estado solido, que favorece la union quimica del Zn⁺² a los iones PO₄ ^-3, mediada por la difusion atomica y la descomposicion termica parcial de la HA. Esta reaccion ocurre solo en los cristales superficiales de la matriz, preservando la estructura porosa tridimensional, lo que resulta ventajoso desde el punto de vista biologico.
El metodo de sinterizado, ademas, permite ajustar la concentracion de Zn, la cual depende de la preparacion de la dispersion. En la elaboracion de la matriz modificada superficialmente, se obtuvo una concentracion de Zn (1,01 } 0,11)% (en peso). En los procesos quimicos, en cambio, la concentracion de Zn esta limitada por la estequiometria de la HA, caracterizada por una fraccion molar de Ca/P proxima a 1,67. De este modo, la incorporacion de Zn en la fraccion molar (Ca+Zn)/P conduciria a un contenido molar de Zn inferior al 11,6%,^17,18 que equivale a un maximo de 2,5% en peso de la HA. La importancia de la concentracion radica en que, segun esta, variara su efecto biologico. Concentraciones inferiores al 1,5% permiten la diferenciacion de osteoblastos y su proliferacion, mientras que su incremento produce citotoxicidad en el tejido.^19,20
En la actualidad, no hay productos comerciales que expresen estas caracteristicas, por lo que estos resultados muestran un proceso efectivo de sintesis haciendo uso de un material de origen natural, abundante en nuestro pais, que provee un sustrato adecuado, a bajo costo. El paso futuro implicaria el ensayo biologico que corrobore la potencialidad de esta matriz para ingenieria de tejidos.

Conclusión

El presente trabajo demostro la capacidad de implementar, en forma sencilla, un metodo de sintesis de matrices tridimensionales, modificadas con Zn, con potenciales propiedades osteoconductoras, antimicrobianas y aceleradoras del proceso reparativo del tejido oseo. Este resultado es alentador a la hora de proponer un material de reemplazo oseo que disminuya el riesgo de infeccion y tenga una elevada bioactividad, en comparacion con los biomateriales disponibles en la actualidad.

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