INTRODUCCIÓN

La “escaldadura” es una enfermedad foliar de la cebada (Hordeum vulgare L.) y de otros miembros de la familia de las Poáceas, causada por el hongo Rhynchosporium secalis (Lehnackers y Knogge, 1990; Shipton, 1974; Zaffarano et al., 2006). En ambientes y años húmedos y frescos la “escaldadura” representa un factor de alta importancia económica en dicho cultivo (Beer, 1991; Shipton, 1974), ya que no solo disminuye el potencial de rendimiento, sino que afecta significativamente el calibre del grano de cebada con la consecuente pérdida de calidad comercial del grano, que en casos severos queda excluido del estándar de comercialización como grano cervecero. Esto origina, además, una disminución del valor económico de este. En Argentina, esta enfermedad puede producir daños de hasta un 10-15%. Su presencia está más limitada al sur de la región pampeana y el avance de los síntomas se produce casi exclusivamente hasta el estado de encañazón. Sin embargo, en años fríos y en variedades susceptibles la “escaldadura” puede avanzar hasta la hoja bandera (Carmona et al., 2011) y afectar una importante área de producción.

Los primeros estudios de herencia de la resistencia de cultivares de cebada frente a R. secalis fueron realizados hace 80 años por Mackie (1929). Desde entonces varios genes de resistencia (genes Rrs) han sido identificados y mapeados. Existen cuatro loci mayores para resistencia, el complejo Rrs1 sobre el cromosoma 3H que cuenta con, al menos, 11 alelos conocidos (Bjørnstad et al., 2002), el locus Rrs2 sobre el cromosoma 7HS (Schweizer et al., 1995), el Rrs13 sobre el cromosoma 6HS (Abbott et al., 1995; Genger et al., 2003b) y el locus Rrs15 sobre el 2HS (Schweizer et al., 2004). El mapeo fino del Rrs2 mostró que dicho gen se encuentra dentro de un intervalo de 0,8 cM entre los marcadores 693M6_6 y P1D23R sobre el extremo distal del cromosoma 7HS de cebada. Estos estudios se realizaron utilizando una población F₂ de mapeo biparental conformada por las variedades Atlas (resistente) y Steffi (susceptible). Hanemann et al. (2009) realizaron estudios de secuenciación sobre el gen Rrs2 en poblaciones de mapeo con las variedades Atlas y Steffi. En dichos estudios encontraron ocho SNPs (Single Nucleotide Polimorfism) asociados con el fenotipo de resistencia para “escaldadura”, los cuales fueron convertidos en marcadores moleculares para el diagnóstico de las respuestas frente a Rhynchosporium secalis; algunos de estos marcadores están desarrollados para técnicas de pirosecuenciación y otros como marcadores CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence). Aplicando las técnicas mencionadas dichos autores caracterizaron molecularmente 30 variedades de cebada entre las que se encontraban Abysinian (Rrs2-), Atlas68 (Rrs2-), Hudson (Rrs2-), Pioneer (Rrs2-), Triton (Rrs2-), Digger (Rrs2+), Escaldadura15 (Rrs2+), Forrest (Rrs2+), Ossiris (Rrs2+), Pewter (Rrs2+), entre otras. Si bien en este grupo de genotipos se correlacionó la presencia de los alelos de resistencia con una respuesta favorable, ninguna de estas variedades se encuentra difundida en la zona de producción agrícola de cebada de Argentina.

Durante la campaña 2015 en Argentina se sembraron 1.467.421 ha con cebada cervecera (SIIA, 2016) de las cuales el 39% fueron ocupadas por el cultivar Andreia, el 34% por el cultivar Shakira y el 10% por el cultivar Scarlett (Cattáneo, 2016). Sin embargo, hasta la campaña 2012 casi el 90% de la superficie sembrada con cebada correspondía al cultivar Scarlett, lo cual generaba un alto riesgo a nivel sanitario (Cattáneo, 2013). En los últimos años, la superficie sembrada con los cultivares Shakira y Andreia fue aumentando, en desmedro de la superficie ocupada por Scarlett (SIIA, 2016). Entre las razones que fundamentan su incremento vale mencionar que ambos cultivares poseen altos potenciales de rendimiento, alta estabilidad en relación con el tamaño del grano y un excelente desempeño en la industria maltera (Moreyra et al., 2015). Las variedades Shakira y Andreia son de origen belga y fueron inscriptas en el Registro Nacional de Cultivares de Argentina en el año 2007 y 2011, respectivamente (INASE, 2016). La variedad Shakira proviene del cruzamiento de los cultivares Pewter (Rrs2+) x Prestige (INASE, 2016), mientras que la variedad Andreia proviene del cruzamiento de ((MarniexCetac1/42)xBarke)xLOCH.1992 (Cattaneo, 2017).

Teniendo en cuenta lo antes expuesto, el objetivo de este trabajo fue validar el gen Rrs2 involucrado en la resistencia para la enfermedad “escaldadura”, utilizando las variedades Shakira y Andreia ampliamente difundidas en Argentina; y determinar si el marcador desarrollado sobre dicho gen puede ser aplicado en selección asistida en los programas de mejoramiento de cebada donde se utilicen dichos fondos genéticos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Este estudio se inició con la generación de una población de 158 líneas endocriadas recombinantes (RIL). Esta población deriva del cruzamiento de las variedades comerciales Andreia y Shakira, las cuales presentan respuestas contrastantes frente a la enfermedad “escaldadura”. La variedad Andreia es susceptible a dicha enfermedad, mientras que Shakira es resistente. Además, Shakira posee el alelo de resistencia para el gen Rrs2, mientras que Andreia posee el alelo de susceptibilidad para dicho gen. Sin embargo, ambos materiales comparten ciertas características como nivel de rendimiento elevado y óptima calidad comercial e industrial.

El cruzamiento artificial entre Andreia y Shakira fue realizado durante la campaña 2011. Las líneas segregantes fueron estabilizadas genéticamente mediante el método de selección de semilla única (SSD). Se completaron dos ciclos de cultivo por año para lograr un alto nivel de endocría de las líneas en un período corto. Una vez estabilizadas las líneas fueron caracterizadas fenotípicamente según su nivel de resistencia a “escaldadura” y genotípicamente para el gen Rrs2.

Caracterización fenotípica del material vegetal

Las 158 líneas endocriadas y sus genotipos parentales Andreia y Shakira fueron evaluados bajo condiciones de campo durante la campaña 2014 en las localidades de Bordenave (S 37º 45´ 39.78´´ O 63º 03´ 39.70´´), Coronel Suárez (S 37º 35´ 45.13´´ O 62º 05´ 12.04´´) y Balcarce (S 37º 45´ 45.84´´ O 58º 18´ 6.45´´) pertenecientes a la región pampeana sur de Argentina, donde la “escaldadura” es una enfermedad endémica. Se sembraron surcos de 1,5 m de largo espaciados a 30 cm entre sí donde se dispusieron 20 g de semilla en cada uno. Los parentales Andreia y Shakira fueron sembrados cada 50 surcos de líneas, es decir, que en cada ambiente se sembraron 3 surcos de cada parental. Las fechas de siembra para las localidades de Bordenave, Coronel Suárez y Balcarce fueron: 20/06/2014, 27/06/2014 y 17/06/2014 respectivamente. La infección con el patógeno R. secalis se realizó de forma natural sin la aplicación de inóculo artificial.

La caracterización de la respuesta frente a la enfermedad escaldadura para cada línea, incluidos los parentales, fue realizada en el estadio de encañazón del cultivo, mediante una exhaustiva observación de la reacción de los genotipos frente al patógeno. Dicha respuesta fue cuantificada mediante una escala del 1 al 3, donde 1 eran líneas que no presentaban síntomas de la enfermedad, 3 eran líneas que presentaban síntomas en la mayoría de las hojas, cubriendo un elevado porcentaje de estas y 2 eran casos intermedios donde las líneas presentaban síntomas, pero menos severos que en el caso anterior (figura 1). Esta escala se basa en una combinación entre la incidencia y la severidad de los síntomas generados por la enfermedad y es utilizada de rutina en los programas de mejoramiento de cebada cervecera en INTA.

Figura 1Escala de tres valores utilizada para la caracterización fenotípica de la población objetivo y sus parentales. 

Caracterización molecular del material vegetal

Se realizó la extracción de ADN total de las 158 líneas y de ambos genotipos parentales siguiendo el método de Dellaporta modificado (Dellaporta et al., 1983). Para tal fin se sembraron 10 semillas de cada material en macetas de 2,5 L con tierra fértil. Estas fueron mantenidas en condiciones de invernáculo hasta su germinación. Posteriormente, se tomaron hojas de 5 plántulas para utilizar como material de partida para la extracción de ADN.

La caracterización molecular se realizó aplicando el marcador CAPS desarrollado por Hanemann et al. (2009). Se amplificó mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) un fragmento del gen Rrs2 de 428 pares de bases (pb) utilizando los siguientes oligonucleótidos: PRrs2 Forward (ACGAAC TCAAGGTGGTGGAC) y PRrs2 Reverse (TGTTGAGCTCCTGGCTTTCT). Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un volumen final de 25 µL, los cuales contenían 100 µM de cada dNTPs (Inbio, Highway), 200 nM de cada oligonucleótido, 50 ng de ADN genómico, 1,5 mM de MgCl (Inbio, Highway), 1 unidad de Taq polimerasa (Inbio, Highway) y 1x de buffer (50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,4). La amplificación enzimática fue realizada con un termociclador marca Biorad, modelo MyClycler y consistió de una desnaturalización inicial a 94 ºC durante 5 minutos, seguida de 30 ciclos de: 94 ºC durante 30 segundos, 56 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 30 segundos. Posteriormente, se realizó una extensión final a 72 ºC durante 5 minutos .

La secuencia del fragmento amplificado sobre el gen Rrs2 consta de un polimorfismo de nucleótido simple (SNPs) el cual discrimina el alelo que confiere resistencia a “escaldadura” (Hanemann et al., 2009). Este cambio en la secuencia del fragmento amplificado forma parte de un sitio de corte para la enzima de restricción BcnI la cual reconoce el sitio de corte en el alelo que no confiere resistencia frente a la enfermedad. Es decir, los fragmentos de 480 pb, provenientes del alelo de susceptibilidad, tratados con la enzima BcnI, se dividen en dos fragmentos (128 bp y 352 bp); mientras que los fragmentos de 480 pb, provenientes del alelo de resistencia, no son reconocidos por dicha enzima (Hanemann et al., 2009).

Las reacciones de restricción se llevaron a cabo en un volumen final de 20 µL que contenían 15 µL del producto de amplificación, 3 unidades de la endonucleasa BcnI (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany) y 1x del buffer de reacción. Las muestras fueron incubadas durante 2 h a 37 ºC . Los fragmentos amplificados y digeridos fueron separados mediante electroforesis en geles de agarosa (Conda, Pronadisa Agarose D1 Low EEO) 1%, TAE 1x, teñidos con el colorante SybrSafe (Invitrogen, Molecular Probes) y visualizados bajo luz ultravioleta. De esta manera se registró, para cada muestra, la presencia o ausencia de los alelos de resistencia (Rrs2+) o susceptibilidad (Rrs2-) para el gen Rrs2 de cebada.

Análisis estadístico de los datos

Se realizó un test de Chi cuadrado (χ ²) al 5% de significación para corroborar que la segregación observada de los alelos del gen Rrs2 en la población RIL no se desviaba significativamente de la segregación esperada para un gen mayor en este tipo de población (segregación = 1:1).

Para determinar el efecto de ambos alelos (Rrs2+ y Rrs2-), la respuesta promedio de las líneas con el alelo de resistencia frente a “escaldadura” se comparó con la respuesta promedio de las líneas con el alelo de susceptibilidad, dentro de cada ambiente y entre ambientes. Para cada ambiente se promediaron las respuestas de los parentales en los tres surcos de evaluación. Se realizó un análisis de la varianza simple (ANAVA) cumpliendo con los supuestos de este tipo de análisis univariado y para comparar las medias de los tratamientos se utilizó el método de la mínima diferencia significativa (MDS), solo cuando la prueba F del análisis de varianza indicó diferencias significativas. En todas las pruebas se utilizó un nivel de significancia de 5%. Para el análisis de los datos obtenidos se utilizó el paquete estadístico INFOSTAT (Di Rienzo et al., 2016).

RESULTADOS

El marcador CAPS sobre el gen Rrs2 resultó polimórfico entre los parentales Shakira y Andreia (figura 2). Shakira presentó el alelo de resistencia del gen Rrs2 mientras que Andreia presentó el alelo de susceptibilidad.

Figura 2Perfil molecular del marcador CAPS sobre el gen Rrs2. 

Analizando la caracterización molecular de las 158 líneas pertenecientes a la población RIL, se observó que 85 líneas portaban el alelo de resistencia para el gen Rrs2 (Rrs2 +), mientras que las restantes 73 líneas portaban el alelo de susceptibilidad para dicho gen (Rrs2 -) (tabla 1). La distribución alélica del gen Rrs2 en la población se ajustó a la correspondiente segregación esperada (p > 0,3).

Tabla 1Caracterización de los materiales según presencia del alelo de resistencia (Rrs2+) y susceptibilidad (Rrs2-) para el gen Rrs2. 

En la caracterización fenotípica, los parentales Shakira y Andreia presentaron respuestas altamente contrastantes en los tres ambientes de evaluación. Las líneas mostraron diversas respuestas frente al patógeno, sin embargo, fue posible ubicar a cada línea dentro de las categorías 1, 2 o 3, según el nivel de síntomas de escaldadura que presentaban en cada uno de los tres ambientes. La tabla 2 muestra los resultados promedio obtenidos en la caracterización fenotípica tanto de los parentales como de las líneas que presentaron el alelo Rrs2+ y Rrs2- para cada ambiente de evaluación.

Tabla 2Caracterización promedio por ambiente (Bv: Bordenave, Bc: Balcarce, Cs: Coronel Suárez) de las líneas portando los alelos de resistencia y susceptibilidad para el gen Rrs2. 

Por un lado, al analizar la varianza de los valores promedio de respuesta para los tres ambientes, se determinó que no existen diferencias significativas (p>0,05) entre las líneas que portan el alelo de resistencia (Rrs2+) y la variedad Shakira. Por otro lado, tampoco se encontraron diferencias significativas (p>0,05) al analizar la respuesta de las líneas que portan el alelo de susceptibilidad (Rrs2-) y la variedad Andreia. Sin embargo, ambos grupos de líneas difieren entre sí, de la misma manera que lo hacen las variedades usadas como parentales (figura 3).

Figura 3Niveles de respuesta promedio de los genotipos evaluados para los tres ambientes de caracterización fenotípica. Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05). 

DISCUSIÓN

En publicaciones anteriores se ha comprobado que el gen Rrs2 confiere resistencia a la enfermedad “escaldadura” en el cultivo de cebada (Hanemann et al., 2009; Bi-Fu, 2012; Walters et al., 2012). Sin embargo, estos trabajos se han llevado a cabo utilizando materiales que no han sido difundidos en Argentina. De la misma manera, dichos trabajos han sido realizados en ambientes con condiciones agroecológicas diferentes a las que poseen las principales zonas de producción de Argentina. Estas cuestiones hacen necesaria la evaluación de materiales elite frente a dicha enfermedad.

En el presente trabajo se evaluaron las dos variedades más difundidas en Argentina según su comportamiento frente a “escaldadura”, las cuales resultaron ser ampliamente contrastantes en los tres ambientes explorados en este estudio. Utilizando como genotipos parentales a dichas variedades se creó una población RIL de 158 líneas puras las cuales fueron caracterizadas fenotípica y molecularmente. Por una parte, según el test de χ ² los alelos del gen Rrs2, en dicha población, segregan con la frecuencia esperada para un gen simple (segregación 1:1). Tanto las líneas caracterizadas como Rrs2+ cómo la variedad Shakira (la cual presenta el alelo de resistencia del gen Rrs2) presentaron valores fenotípicos bajos (1,08–1,17) y además, similares entre sí en los tres ambientes de evaluación. Estos resultados indican que dicho alelo sería el responsable de la resistencia frente al patógeno Rhynchosporium secalis, para los genotipos estudiados. Por otra parte, los individuos caracterizados como Rrs2- y la variedad Andreia (la cual presenta el alelo de susceptibilidad) presentaron valores elevados dentro de la escala fenotípica (2,26-2,48), lo cual indica que estos genotipos carecen de genes de resistencia efectivos para dicha enfermedad.

Estos resultados indican que el gen Rrs2 de cebada sería responsable de conferir resistencia frente a escaldadura en el cultivar Shakira, uno de los más difundidos en Argentina.

La principal aplicación de los marcadores moleculares en el mejoramiento vegetal está asociada directamente con la eficiencia de selección de genotipos con caracteres deseables. La identificación de marcadores asociados a caracteres de importancia agronómica es el primer paso en el desarrollo de la selección molecular, pero existen varios requisitos que hacen efectiva la real utilización de estos marcadores en planes de mejoramiento (Langridge et al., 2001). Es importante destacar que el marcador debe ser capaz de detectar polimorfismos entre y dentro de las líneas o variedades utilizadas en dichos programas. En este sentido, el marcador CAPS desarrollado sobre el gen Rrs2 (Hanemann et al., 2009) fue polimórfico entre las variedades elite Shakira y Andreia; y mostró ser eficaz en la selección de líneas derivadas del cruzamiento entre ambos materiales. Estos resultados, indican que dicho marcador podría ser utilizado en planes de mejoramiento que utilicen fondos genéticos derivados de la variedad Shakira para la selección de individuos portando alelos de resistencia a la enfermedad “escaldadura”. Además, este tipo de marcadores es de fácil aplicación, codominante y altamente objetivo con un costo relativamente bajo. Estas características lo convierten en una herramienta interesante para los programas de mejoramiento de cebada que cuenten con la asistencia de laboratorios de selección asistida por marcadores moleculares.

Por último, este trabajo representa la primera caracterización a nivel fenotípico y molecular de genotipos de cebada cervecera utilizados ampliamente en sistemas de producción agrícola en las principales zonas agroecológicas de Argentina.