BIOQUÍMICA Y FARMACIA

Parámetros Fisicoquímicos e Isotermas de Adsorción de Hojas de Especies Silvestres de Maytenus ilicifolia Martius

Physicochemical Parameters and Adsorption Isotherms of wild species of Maytenus ilicifolia Martius Leaves

 

Gabriela Pergher^1,*, Miguel E. Schmalko², Gabriela A. De Battista¹

¹ Modulo de Farmacia y Bioquimica,
² Modulo de Ingenieria, Facultad de Ciencias Exactas, Quimicas y Naturales, Universidad Nacional de Misiones, Avda. Mariano Moreno 1375, CP 3300, Posadas, Misiones, Argentina.
* E-mail: gpergher@fceqyn.unam.edu.ar

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Resumen

Maytenus Ilicifolia Martius (Celastraceae) es una especie nativa en la Provincia de Misiones. Con sus hojas secas se preparan diferentes infusiones y con el objeto de estandarizar las mismas se estudiaron sus parametros fisicoquimicos e isotermas de adsorcion. El contenido de humedad de equilibrio fue medido usando un metodo gravimetrico estatico, a humedades relativas y temperaturas en un rango de 11,0% a 80,3% y de 30 .C a 60 .C respectivamente. Los modelos matematicos de Guggenheim-Anderson-de Boer (GAB), Chung-Plost, Halsey modificado, Oswin modificado, Henderson modificado y Halsey fueron utilizados para ajustar los datos experimentales. Los ensayos de cenizas totales, perdida por secado y extractos acuosos cumplen con Farmacopea Brasilera. Los valores optimos obtenidos por TLC para los triterpenos fueron con la fase movil cloroformo-benceno con Rf de 0,23, 0,38, 0,57, 0,80 y 0,96. Los datos experimentales de adsorcion exhiben una curva sigmoidea Tipo II. Los mejores ajustes se obtuvieron con la ecuacion de GAB.

Palabras clave: Parametros fisicoquimicos; Isotermas de adsorcion; Maytenus Ilicifolia; Modelos matematicos.

Abstract

Maytenus ilicifolia Martius (Celastraceae) is a native species in the Province of Misiones. With its leaves, different types of infusion are prepared, and in order to standarize them physicochemical parameters and adsorption isotherms were studied. The equilibrium moisture content was measured using a gravimetric static method, at relative humidities and temperatures in the range of 11.0% to 80.3% and from 30 °C to 60 °C respectively. Mathematical models of Guggenheim-Anderson-de Boer (GAB), Chung-Plost, modified Halsey, modified Oswin, modified Henderson and Halsey were tested to fit the experimental data. Total ashes, loss of mass and water extract values were in accordance with Brazilian Pharmacopea. The optimum values for triterpenes obtained by TLC with the mobile phase chloroform-benzene were with Rf 0.23, 0.38, 0.57, 0.80 and 0.96. The experimental adsorption data exhibited a sigmoidal curve type II. Best fitting adsorption isotherms were obtained with the GAB equation.

Keywords: Physicochemical parameters; Absorption isotherms; Maytenus Ilicifolia; Mathematical modelling.

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Introducción

Maytenus Ilicifolia Martius (Celastraceae) es una especie nativa que crece en la Provincia de Misiones, clasificada dentro de árboles bajos y arbustos, y es conocida con el nombre vulgar de: “congorosa”, “cangorosa” y en Brasil con el nombre de: “espinheira santa”, “cancorosa”, “cancerosa”, “maiteno”, “espinheira-divina” ^[1]. Las hojas de Maytenus ilicifolia están codificadas en la Farmacopea Brasilera ^{[2, 3]} bajo la denominación de “Espinheira santa”; descriptas como inodoras, con sabor suave y ligeramente astringente. Esta especie vegetal no ha sido incluida en la farmacopea oficial en nuestro país. Las hojas de Maytenus ilicifolia fueron utilizadas para fines medicinales por los indígenas y por la población no indígena de la región Sur de Brasil, Argentina, Paraguay y Uruguay. Existen antecedentes de mezclas de las hojas con la Yerba Mate (10% al 15%) y su comercialización en Brasil ^[4].

Figura 1: Maytenus ilicifolia Martius, planta silvestre de la zona sur de la Provincia de Misiones.

Aloízio França (1920), informó sobre el éxito de las acciones terapéuticas de Maytenus ilicifolia en el tratamiento de la úlcera ^[5]. Carlini y Frochtengerten (1988), demostraron que cuanto mayor es el tiempo de tratamiento mayor es su gastroprotección; sin embargo se indican que pueden observarse alteraciones en el pH gástrico ^[6]. Se evaluó la actividad antioxidante mediante la reducción del radical 2,2-diphenyl-pycryl hydrazyl (DPPH) en infusiones de drogas vegetales de Maytenus ilicifolia comercializadas en Brasil donde se encontró una enorme variabilidad; cinco de las nueve muestras presentaron muy buena actividad antioxidante ^[7]. Asimismo, se demostró que las hojas secadas a 40 ºC poseen mayor actividad antioxidante respecto de las demás temperaturas (rango 40 ºC a 80 ºC) utilizando el mismo método espectrofotométrico. Estos resultados fueron coincidentes con los obtenidos utilizando el método de Folin Denis ^[8].
La presencia de metabolitos fenólicos tales como los flavonoides, taninos y triterpenos podrían explicar el uso de algunas especies de Maytenus como droga antiulcerogénica ^{[9, 10, 11, 12]}. Por otro lado también se evaluó la eficacia de extractos conteniendo triterpenos y polifenoles (taninos condensados y flavonoides) como antiinflamatorio, anticonceptivo y en lesiones gástricas, como protector y cicatrizante ^[10]. También se reportan antecedentes sobre el aislamiento de compuestos triterpénicos con actividad citotóxica in vitro y analgésica ^[13]. Estudios realizados sobre extractos hidroalcohólicos liofilizados no evidenciaron alteraciones morfológicas del sistema reproductivo, ni efectos embriotóxicos después de la administración oral ^[13]. Para su conservación las hojas de las especies vegetales deben tener un bajo contenido de humedad o de actividad de agua. Estas dos propiedades se relacionan mediante las isotermas de sorción. Las mismas aportan información sumamente valiosa para predecir cambios potenciales en la estabilidad biológica del material, permitiendo determinar la máxima humedad que el mismo puede ganar o perder durante el secado o almacenamiento ^[1]. El contenido de humedad final del producto debe tener un valor que le permita ser estable durante un tiempo prolongado. La estabilidad microbiológica se obtiene a valores de actividad de agua (aw) menores a 0,6 ^[14].
Para correlacionar los datos de isotermas de sorción en hojas de plantas aromáticas y medicinales se aplicaron ecuaciones empíricas, semi-empíricas o teóricas ^{[1 ,15 ,16, 17]}. Otros autores estudiaron las isotermas de sorción de hojas de Maytenus ilicifolia cultivadas en Brasil, determinando el contenido de humedad de equilibro según las condiciones indicadas en la AOAC, (1990). En el análisis de los resultados de las isotermas de adsorción no ha sido descripto el modelo de GAB en su forma original de tres parámetros. El modelo de Chung-Pfost fue el que mejor ajustó a los datos experimentales para las isotermas de adsorción ^[1]. En el presente trabajo de investigación se estudiaron a los fines de su estandarización algunos parámetros fisicoquímicos y las isotermas de adsorción en hojas de Maytenus ilicifolia de especies silvestres de la región.

Materiales y Métodos

Muestras: Hojas de Maytenus ilicifolia recolectadas de árboles que crecen en forma silvestre en la zona sur de la Provincia de Misiones. la determinación y evaluación taxonómica de la especie se encuentra bajo el Registro de coleccionista Nº 1239 (30/06/04) en el Herbario de la Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales de la Universidad Nacional de Misiones.
Tratamiento de las muestras: las ramas con hojas fueron sometidas a diferentes procesos de secado: artificial (muestra 1), expuestas al sol por 2 semanas en origen y luego secadas en estufa a 50 ºC por 24 horas y natural (muestra control), al aire libre y a la sombra por 72 horas. Luego del secado se seleccionaron manualmente las hojas y se almacenaron en frascos de vidrio de color ámbar.
Ensayos fisicoquímicos: se realizaron las determinaciones de porcentaje de pérdida por secado, contenido de cenizas totales y de extractos solubles, según lo codificado en la Farmacopea Argentina 7º edición, (2003) ^[18]. Las especificaciones establecidas en la Farmacopea Brasilera  ^{[2, 3]} se utilizaron como valores de referencia. Se efectuaron cromatografías en capa fina a extractos de acetato de etilo (terpenos) ^[12]. Se evaluaron dos sistemas de solventes (cloroformo-benceno, 1:1 y metanol-benceno, 1:9) utilizando cromatofolios de Sílica Gel 60 GF254 (Merck®), frente de solvente 15 cm. El revelado de las placas se realizó con anisaldehído-sulfúrico: bajo luz UV a 365 nm ^[19]. La presencia de taninos en ambas muestras fue determinada con el reactivo de Cl3Fe y gelatina, según lo codificado en Normas IRAM Nº 37518 ^[20].
Isotermas de adsorción: se realizaron a la muestra 1 utilizando el método gravimétrico estático. El contenido de pérdida por secado inicial de la muestra, determinado según FA 7º edición fue de 7,1% p/p en base seca. Se colocaron muestras por triplicado, en recipientes herméticos que contenían soluciones salinas saturadas y se almacenaron a temperatura constante durante 15 días. Las soluciones salinas utilizadas fueron: LiCl, MgCl2, Mg(NO3)2, NaBr, NaNO3, NaCl y KBr en un rango de aw comprendido entre 0,110-0,803 en orden creciente ^[21]. Los procesos de adsorción fueron repetidos para temperaturas de 30 ºC, 40 ºC, 50 ºC y 60 ºC ± 2 ºC. El contenido de humedad de equilibrio se determinó por pérdida de masa según la norma IRAM 20503, (1995) ^[22]. Los datos obtenidos fueron analizados con las pruebas de Dixon para detectar valores atípicos (outlier).
Modelos matemáticos: Las ecuaciones utilizadas para ajustar los datos de adsorción se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1: Modelos matematicos aplicados a datos de isotermas de sorcion en hojas de Maytenus ilicifolia.

Métodos estadísticos: la estimación de los parámetros de cada modelo fue determinada por análisis de regresión no lineal, aplicando el método de los mínimos cuadrados con el programa StatGraphics Plus, Versión 5.1. La calidad de los ajustes se analizó evaluando el coeficiente de determinación (R2), el error medio relativo, expresado como porcentaje (E%), la raíz cuadrada del error cuadrático medio (RMSE), la prueba de Chi cuadrado (χ2) y los gráficos de residuales ^{[23, 15]}.

Resultados y Discusión

En el ensayo de pérdida por secado y cenizas totales de las muestras estudiadas (Tabla 2) para las condiciones de secado propuestas se observaron diferencias significativas; sin embargo ambas muestras cumplen con los requerimientos farmacopeicos de no contener más del 8% p/p, para ambos ensayos ^{[2, 3]}. El análisis estadístico sobreestima los resultados con respecto a los límites establecidos en los códigos farmacopeicos. Respecto al secado del material vegetal, la Organización Mundial de la Salud recomienda para las plantas medicinales temperaturas inferiores a 60 ºC, evitando pérdida de material volátil y degradación de principios activos ^[24].

Tabla 2: Parametros poblacionales y estadigrafo t (comparacion de medias).

Con respecto al ensayo de extracto acuoso no se observaron diferencias significativas al comparar las medias muestrales. Si bien este ensayo no se encuentra codificado en Farmacopea; podría considerarse para hallar una relación entre la extracción de solubles y las condiciones de secado. El perfil cromatográfico óptimo obtenido para los extractos de hojas de Maytenus ilicifolia conteniendo triterpenos, fue con el sistema de solventes cloroformo/ benceno (Figura 2). Los valores de Rf obtenidos fueron de 0,23, 0,38, 0,57, 0,80 y 0,96.

Figura 2: Cromatograma de extractos de terpenos. M1: muestra secado artificial, M4: muestra secado natural.

Los ensayos cualitativos de detección de taninos fueron positivos con los reactivos de cloruro férrico y gelatina (Figura 3). Los resultados de la valoración del contenido de humedad de equilibrio, expresados en porcentaje peso en peso en base seca (% p/p b.s.) (Tabla 3) indican que la temperatura y la humedad relativa tienen un efecto significativo sobre los valores experimentales obtenidos.

Figura 3: Reaccion positiva de extractos acuosos de M. ilicifolia con solucion de tricloruro ferrico y gelatina (muestra 1 y muestra control).

Tabla 3: Resultado experimental de la valoracion de contenido de humedad de equilibrio para adsorcion en hojas de Maytenus ilicifolia a diferentes temperaturas y humedades relativas.

El efecto de la temperatura sobre el contenido de humedad de equilibrio de las hojas de Maytenus ilicifolia fue consistente con los resultados observados en estudios realizados sobre hojas de la misma especie ^[1]. Tendencias similares fueron reportadas en plantas aromáticas y medicinales ^[17], como así también para materiales alimenticios ^[16]. El coeficiente de determinación más elevado (R2 promedio = 97,44) (Tabla 4) fue obtenido con el modelo de GAB. Este modelo fue capaz de describir los 97,4% de la variación de los datos de contenido de humedad experimentales debido al efecto de la temperatura en un intervalo de 30ºC a 60ºC y/o humedad relativa decimal de 0,110 a 0,803.

Tabla 4: Parametros estimados, coeficientes de determinacion y de Chi-cuadrado, y errores en los ajustes de los modelos de Isotermas de adsorcion en hojas de M. ilicifolia.

En general, valores mayores de R2 y valores pequeños de error medio relativo, asociados a distribuciones al azar en los gráficos de residuales indican buenos ajustes ^[1]. Por otro lado también, valores de error por debajo del 10% indican ajustes adecuados para fines prácticos ^[23]. Los modelos de GAB, Oswin modificado y Halsey cumplirían con esta condición; mientras que el modelo de Chung-Pfost y el de Halsey modificado no la cumplen a la temperatura de 60 ºC. El modelo de Henderson modificado arrojó los valores más elevados de error medio relativo (E%promedio = 39,86%). Los valores de Chi-cuadrado más bajos o aquellos que tienden a cero, se consideran los óptimos ^[15]. Al evaluar los modelos de GAB, Oswin modificado, Halsey modificado y Halsey no se encontraron diferencias significativas entre los valores predichos por cada modelo y los datos experimentales en esta investigación. En particular, el factor χ2 de comparación a la temperatura de 60 ºC para el modelo de Chung-Pfost, arrojó un valor de magnitud muy alejada de la media; este modelo podría no ser aplicable a la mencionada temperatura o estar relacionado a otra variable. Asimismo, los valores obtenidos para el modelo de Henderson modificado indicaron que las diferencias fueron significativas para todas las temperaturas estudiadas. Los datos experimentales obtenidos a 60 ºC no pudieron ser ajustados con la ecuación de Halsey.

Figura 4: Graficos de los modelos de isotermas de adsorcion de hojas de Maytenus ilicifolia a diferentes temperaturas. Δ t=30 .C, * t=40 .C. □ t=50 .C, . t=60 .C.

Figura 5: Graficos de los modelos de isotermas de adsorcion de hojas de Maytenus ilicifolia a diferentes temperaturas. Δ t=30 .C, * t=40 .C. □ t=50 .C, . t=60 .C.

Las isotermas responden a una curva sigmoidal Tipo II, típica de las isotermas de sorción de muchos productos higroscópicos ^{[15, 23,1]}. Al evaluar el efecto de la temperatura sobre los resultados del contenido de humedad de equilibrio se observa que las isotermas de adsorción de las hojas de Maytenus ilicifolia muestran una significativa disminución en la cantidad de agua absorbida para un aumento de la temperatura, a humedad relativa constante. Los resultados del efecto de la temperatura sobre las isotermas de adsorción de las hojas fueron consistentes con los obtenidos por Cordeiro et al., (2006) para muestras provenientes de plantas cultivadas ^[1]. Las curvas exhiben un comportamiento diferente para todos los modelos testeados a la temperatura de 60 ºC, se observa un entrecruzamiento entre las isotermas de adsorción. Ésto podría atribuirse a cambios estructurales y/o químicos de la muestra, producidas por temperaturas más elevadas que podrían modificar su adsorción. Los valores del contenido de humedad de equilibrio de los productos biológicos dependen de la temperatura y de la humedad relativa del aire, de la especie o variedad del producto. También influyen la madurez fisiológica, la historia del producto y la manera en que se obtuvo el equilibrio (adsorción o desorción). En general se recomienda una humedad relativa de cámara del 60% como límite superior para evitar el crecimiento de microorganismos ^[1]. El modelo de Guggenheim-Anderson-de Boer (GAB) de tres parámetros fue el que mejor describió la relación entre el contenido de humedad de equilibrio y la actividad de agua en las condiciones experimentales ensayadas. Considerando una actividad de agua de 0,6, los contenidos de humedad límites calculados fueron 10,0%, 9,7%, 9,5% y 7,7% p/p en base seca respectivamente para las temperaturas de 30 ºC, 40 ºC, 50 ºC y 60 ºC. Para temperaturas de secado de 60ºC [24] se proponen contenidos de pérdida de peso no mayores al 8%. Este valor es coincidente con las especificaciones definidas, para esta especie vegetal, por la FB 5º ed., (2010) ^[3]. Si bien, los resultados experimentales admiten estos máximos de humedad sería importante investigar la posible influencia en la variación química que pudiesen modificar las propiedades de la especie vegetal. El modelo de Chung-Pfost fue el segundo que mejor describió los datos experimentales. Al analizar el conjunto de datos, en el rango de temperatura comprendido entre 30 a 60 ºC, se obtuvieron los mejores ajustes (Tabla 5 y Figura 6) con el modelo de Chung Pfost. En trabajos previos Cordeiro et al, (2006) llegaron a la misma conclusión para muestras provenientes del cultivo.

Tabla 5: Parametros estimados, coeficientes de determinacion y errores en los ajustes de cinco modelos de Isotermas de sorcion, en hojas silvestres de Maytenus ilicifolia.

 

Figura 6: Graficos de superficie de respuesta y valores de distribucion de residuales de las ecuaciones de Chung Pfost (A), GAB (B), Oswin modificado (C), Halsey modificado (D) y Henderson modificado (E) ajustados a isotermas de adsorcion de hojas de Maytenus ilicifolia.

Con el modelo de Chung-Pfost, para una temperatura de secado de 40 ºC y una aw de 0,6 se requeriría un contenido de humedad del 9,8% p/p.

Conclusiones

Las muestras estudiadas cumplimentaron los requisitos de la Farmacopea Brasilera para los parámetros fisicoquímicos ensayados. Los datos experimentales de adsorción exhiben una curva sigmoidea Tipo II, típica de la mayoría de los productos biológicos. El modelo matemático de ChungFost fue el que mejor ajustó los datos experimentales, para la relación entre el contenido de humedad de equilibrio y la actividad de agua de las hojas de Maytenus ilicifolia Martius.

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Recibido: 12/02/2015.
Aprobado: 30/07/2015.