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PUNTOS CLAVE
Conocimiento actual
• [ 18F]FLT, (3´-desoxi-3´-[ 18F]fluorotimidina), es un radio trazador derivado de la droga citostática azidotimidina (AZT), que permite llevar a cabo una imagen molecular de la fase S del ciclo celular.
• Éste es un radiofármaco de reciente introducción al uso clínico diagnóstico en el país y en la región.
Contribución del artículo al conocimiento actual
• Utilizando un modelo animal en primate no humano demostramos que [18F]FLT presenta una biodistribución acorde a publicaciones internacionales.
• Se realizó el cálculo dosimétrico y se extrapoló a huma nos.
• Sobre la base del presente estudio se inicia la fase clínica de utilización de [18F]FLT en seres humanos en comparación con [ 18F]FDG.
Los linfomas no-Hodgkin (LNH) han experimentado un notable aumento de su incidencia en las últimas décadas, la cual se incrementa con la edad. Se estiman 0.3 casos (entre los 35 y 39 años) y 26.6 casos (entre los 80 y 84 años) cada 100 000 habitantes por año. Varios subgrupos clínico-patológicos integran esta neoplasia linfoproliferativa hematológica, siendo el linfoma difuso de células grandes B (LDCGB) el más frecuente (35%), del cual se calcula el diagnóstico de aproximadamente 1200 casos por año en Argentina1,2. Aunque el LDCGB tiene una elevada tasa de curación con inmunoquimioterapia (rituximab-CHOP), un 30%-40% de los enfermos recaen o son refractarios a esa modalidad terapéutica3. Para este grupo de pacientes, las opciones curativas son limitadas.
La heterogeneidad en cuanto a la respuesta terapéu tica es el reflejo de una diversidad biológica que no está claramente expresada al inicio de la enfermedad. Por lo tanto, es necesario desarrollar sistemas pronósticos que tengan valor predictivo evolutivo en cuanto a la supervivencia.
En el linfoma Hodgkin, PET-TC forma parte de los nue vos algoritmos diagnósticos y de valoración de respuesta al tratamiento como método eficaz para evaluar super vivencia y pronóstico de la enfermedad, ya sea a través del PET-TC interino (IPET) con 2-[18F]fluoro-2-desoxi-D-glucosa ([18F]FDG) como también del PET-TC al final de la terapéutica4,5. En el LDCGB es controvertido el uso de esta herramienta diagnóstica a la hora de evaluar la respuesta a los tratamientos con inmunoquimioterapia, dado que se ha visto una alta tasa de falsos positivos debido a la presencia de captaciones metabólicas en focos linfoideos fisiológicos reactivos, no permitiendo éstos la discriminación entre la persistencia y/o recaída de la enfermedad6. Debido a esta falta de especificidad, el PET-TC con [18F]FDG no permite predecir y/o valorar el grado de respuesta al tratamiento, si bien es superior a los métodos tomográficos convencionales para evaluar la respuesta temprana7.
Una molécula prometedora a usar in vivo es la 3´-desoxi-3´-[18F]fluorotimidina ([18F]FLT), un radio traza dor derivado de la droga citostática azidotimidina (AZT), que permite llevar a cabo una imagen molecular de la fase S del ciclo celular permitiendo así, trazar la prolifera ción celular8. Siendo este radiofármaco de relativamente reciente introducción al país y no habiendo encontrado antecedentes publicados de su uso en la región (tanto en fase clínica como preclínica), consideramos de rele vancia valorar su utilización llevando a cabo el presente estudio. Sobre la base de un estudio en un modelo ani mal en primate no humano se demostró que presenta una biodistribución acorde a lo publicado en humanos. Se valoró asimismo la dosimetría correspondiente, ex trapolándose los resultados para seres humanos bajo condiciones de aplicabilidad en la práctica clínica.
Materiales y métodos
El desarrollo del presente estudio contó con aprobaciones del Comité de Ética del Centro de Educación Médica e Investiga ciones Clínicas (CEMIC) y del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL) de CEMIC; con notificación a la Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica (ANMAT) y aceptación del uso de radioisótopos en animales por parte de la Autoridad Regulatoria Nuclear (ARN). La conservación de los primates en cautiverio en la institución se ajusta a las normas del National Research Council, Institute for Laboratory Animal Research (NRC/ILAR)9. Los procedimientos adhirieron a los principios rectores internacionales básicos aplicables a las investigaciones biomédicas con animales elaborados por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas, Organización Mundial de la Salud, en el año 1985 y a la Declaración de Basilea del año 201010.
Se realizó la experiencia en 2 primates Sapajus cay, machos, adultos jóvenes, nacidos en cautiverio en el bioterio de CEMIC: animal #1 (tatuaje N° 195), nacido el 11/08/1996, edad 20 años, peso 2.9 kg y animal #2 (tatuaje N° 185), nacido el 19/03/1994, edad 22 años, peso 3.7 kg. Ambos animales guardaron ayuno por 12 horas. La inducción anestésica se llevó a cabo en la jaula individual de cada animal, con una dosis de ketamina de 15 mg/kg para su traslado y preparación en el quirófano de la colonia. El mantenimiento de la anestesia para el estudio PET-TC se realizó mediante mezcla de oxí geno 2.5% y sevoflurano 2% a través de tubo endotraqueal.
Para la adquisición de las imágenes se utilizó un equipo PET-TC (marca: Philips, modelo: Gemini 64 TF) con tecno logía de medición de tiempo de vuelo (TOF) y algoritmo de reconstrucción LOR 3D RAMLA. Se ubicó cada animal en cama inclinada en decúbito dorsal, posición de Trendelenburg, con los brazos extendidos y se colocaron gasas humedecidas sobre los ojos. Luego de la adquisición de la tomografia com putarizada (TC) se realizó la administración de la actividad a través de un catéter colocado en la vena femoral izquierda y simultáneamente se dio inicio a la adquisición PET. El volumen inyectado fue de 1 ml y la actividad de 15.4 MBq (0.417 mCi) para el animal #1 y 17.7 MBq (0.479 mCi) para el animal #2. La duración de los estudios fue de aproximadamen te 70 minutos en total desde el momento de la inyección del radiofármaco. Para cada animal se planificó un estudio dinámi co consistente en 99 adquisiciones temporalmente contiguas y cuya duración varió entre 3 segundos, para los primeros dos minutos, y 5 minutos para las últimas adquisiciones, cubriendo un lapso total de 45 minutos. En esta adquisición dinámica, la camilla permaneció en una posición fija de tal modo que el campo de visión axial del PET (18 cm) cubriera el tórax y el abdomen de los animales. A continuación, se realizó una adquisición estática de cuerpo entero.
Tanto las imágenes correspondientes a la tomografía axial computada como las obtenidas por tomografía de emisión de positrones fueron procesadas con el software PMOD11. A partir de la TC se delimitaron manualmente los volúmenes de interés (VOI, por volume of interest) correspondientes a las siguientes estructuras: riñones, pulmones, hígado, corazón y médula. Para el caso de la médula ósea se seleccionó un volumen dentro de una región vertebral con mayor captación, cuidando de minimizar el efecto de volumen parcial. Se obtuvieron así los datos correspondientes al número de cuentas y a la concentración de actividad en función del tiempo para cada volumen de interés. La actividad total en cada órgano se obtuvo como el producto de dicha concentración por el correspondiente volumen del VOI (hipótesis de distribución homogénea del radiofármaco en el órgano), salvo para la médula ósea. En este caso, como el volumen del VOI fue de 0.91 cm3, se estimó el volumen total a partir de la masa de la médula ósea activa (50 g) dada en la tabla de la sección 9.2.15 de la publicación ICRP 8912 considerando un humano recién nacido (3.5 kg) y una densidad de 1 g/cm3.
El cálculo dosimétrico se basó en el esquema MIRD (por Medical Internal Radiation Dosimetry)13 aplicando los datos de la adquisición dinámica PET. Los detalles del formalismo del cálculo se encuentran desarrollados en el apéndice. En este trabajo se consideró la médula ósea como órgano blanco, es decir, el órgano sobre el cual se calculará la dosis absorbida media; los órganos considerados como fuentes de radiación fueron la misma médula ósea (consideración de autoirradiación), riñones, pulmones, hígado y corazón (cf. expresión [5] del apéndice). Adicionalmente, y a partir de las mediciones realizadas sobre tales órganos, se estimó la contribución del resto del cuerpo sin discriminación de otros órganos o estructuras. La actividad acumulada normalizada en los órganos -τf definida en [4]- se determinó a partir del análisis de la curva de concentración de actividad en función del tiempo en los VOIs definidos para cada uno de ellos. Durante el lapso del estudio dinámico, la integral en [4] se determinó como el área bajo la curva de los 99 datos utilizan do el método de integración trapezoidal. A partir del último punto medido se calculó la integral suponiendo solamente decaimiento físico de 18F (período de semidesintegración: 109.7 minutos). Esta suposición de ausencia de remoción biológica es una aproximación conservadora para la esti mación de la dosis. Para la determinación de los factores S se utilizó la expresión [2] en la cual, para el decaimiento de 18F, consideramos una suma sobre dos tipos de radiación: un positrón con energía promedio de 250 keV y fracción de emisión 0.967 y un fotón de 511 keV por cada positrón (2 fotones en el caso de autoirradiación)14. Los respectivos coeficientes φi(rb ← rf)/mb se obtuvieron por interpolación lineal de los datos disponibles en el sitio web de RADAR (The Radiation Dose Assessment Resource) para el modelo newborn masculino de masa 3.5 kg15,16.
Finalmente se realizó una estimación de la dosis media que recibiría la médula ósea de un adulto humano por ex trapolación del resultado obtenido en el animal #1 aplicando la metodología descripta por Stabin17. Para ello se extrapoló la actividad acumulada normalizada en cada órgano fuente utilizando los datos de masas del modelo de hombre adulto de la publicación ICRP 8912. Los factores de conversión de dosis se calcularon de manera análoga a lo realizado para los animales, pero utilizando los coeficientes φi(rb ← rf)/mb correspondientes al modelo de adulto15. Con la actividad nor malizada extrapolada y los nuevos coeficientes S se estimó la dosis aplicando la expresión [5].
La radiosíntesis de [18F]FLT se realizó de forma au tomatizada en una plataforma Trasis AllinOne (Trasis S.A., Bélgica) de 36 válvulas con 18F proveniente de un ciclotrón Cyclone 18 (IBA, Bélgica) y blancos líquidos de alta corriente Stracotek. La producción de [18F]FLT se basa en una reacción de sustitución nucleofílica por el (F-18) fluoruro seguida por desprotección de dos pasos mediante la adaptación del protocolo publicado por Martin y col.18. Brevemente, luego de concentrar en un cartucho de intercambio iónico, se eluye el [18F]fluoruro al reactor con una solución de agua/acetonitrilo de bicarbonato de tetrabutilamonio. El eluido se evapora a sequedad antes de que el precursor de nosilato se transfiera al reactor. La reacción de marcado se lleva a cabo a 90 °C durante 5 minutos. Los grupos protectores se escinden posteriormen te mediante hidrólisis ácida a 95 °C durante 10 minutos. A continuación, el producto se purifica mediante extracción en fase sólida (SPE), se formula en tampón citrato y se filtra en condiciones estériles.
Resultados
El proceso de síntesis de [18F]FLT resultó en un rendi miento radioquímico, sin corrección por decaimiento, del (10.5 ± 1.5) % (n = 15) y una pureza radioquímica superior al 98 %. El tiempo total de síntesis, desde la transferencia de fluoruro [18F] hasta el final de la formulación, fue de aproximadamente 45 minutos.
De los dos primates incluidos en el estudio general, solo se presentan aquí los resultados correspondientes al ani mal #1 ya que un incidente de infiltración durante la admi nistración del radiofármaco al segundo animal no permitió realizar un apropiado análisis cuantitativo. En la Figura 1 se muestra un corte tomográfico coronal representativo de la biodistribución de [18F]FLT en el animal denominado #1 obtenida a los 60 minutos postinyección. En la Figura 2 se muestra la concentración de actividad en función del tiempo obtenida para los diversos órganos de interés a lo largo de las 99 adquisiciones correspondientes al estudio dinámico. A partir de estos datos, de los volúmenes de los órganos involucrados y de las correspondientes extrapolaciones temporales se calculó (según [4]) la actividad acumulada A’f, y la actividad acumulada normalizada τf, cuyos resul tados se muestran en la Tabla 1.
Fig. 1 Cortes coronales de cuerpo entero de la distribución de [18F]FLT en el primate Sapajus cay utilizado para los cálculos dosimétricos. Izquierda: imagen PET; derecha: fusión PET-TC
Fig. 2 Curvas de concentraciones actividad en función del tiempo para los órganos analiza dos. Los segmentos que unen los puntos medidos sólo se dibujan con el objeto de tener una guía visual de los datos
Los factores S para 18F calculados para los diversos órga nos fuente y teniendo como blanco a la médula, se muestran en la Tabla 2. A partir de los mismos, de los factores τf y de la actividad administrada A0 = 15.4 MBq, se determinó (según [5]) que la dosis media recibida por la médula fue de 0.13 mGy. Se tiene entonces que la estimación de la dosis media recibida por la médula por unidad de actividad administrada fue de 8.7 μGy/MBq. La extrapolación al modelo de hombre adulto arrojó un valor de 32 μGy/MBq para la estimación de la dosis por unidad de actividad.
Discusión
Hasta donde hemos podido indagar, no hemos encontrado otros estudios, en la comunidad científica local, en donde se evalúe preclínicamente el radiofármaco [18F]FLT, cuya incorporación a la comunidad médica local se ha realizado en los últimos años. Se observa que la biodistribución en el primate no humano, luego de aproximadamente 1 hora postinyección fue la esperada, acorde a lo publicado en seres humanos19. En ese sentido se obtuvo una acumu lación destacada en médula ósea, hígado y riñones.
El fino muestreo temporal del estudio dinámico permitió, por un lado, observar detalles de rápida variación en la cinética de captación del fármaco y, por el otro, realizar el cálculo de la actividad acumulada en los órganos de interés de forma precisa en el lapso de duración del estudio, mini mizando las incertezas asociadas al cálculo dosimétrico.
Las curvas de actividad en función del tiempo (Fig. 2) muestran captación instantánea en hígado, pulmones y, como era esperable, en corazón. La alta simetría de la captación en los órganos pares (riñones y pulmones), ma nifestada en las respectivas curvas de actividad en función del tiempo y en las actividades acumuladas normalizadas (Tabla 1), nos aseguran la ausencia de sesgos asociados a la adquisición o al procesamiento de las imágenes.
La Figura 2 muestra también que sería deseable exten der -con los recaudos necesarios respecto de la seguridad de los animales- la duración del estudio dinámico con el fin de describir mejor la etapa de liberación del radiofármaco, especialmente para la médula ósea y el hígado. De esta manera se podría tener una mejor determinación de las actividades acumuladas absoluta y normalizada y disminuir el efecto de la sobreestimación de la dosis al suponer elimi nación de la actividad únicamente por decaimiento físico. Este es uno de los motivos por los cuales los resultados de la Tabla 1 se presentan con solo dos cifras significativas.
En la determinación de la dosis a la médula ósea, además de las incertezas asociadas al cálculo de la actividad acumulada en cada órgano, existen las que resultan de las aproximaciones del esquema MIRD utilizado. Una de ellas es la suposición de distribución uniforme del radiofármaco dentro de los órganos de interés. Sin embargo, la aproximación más importante realizada en este estudio fue la de asimilar la anatomía de los animales, en ausencia de un modelo más apropiado, a la de un humano de similar masa corporal. Por este motivo se utilizó el modelo de humano recién nacido (newborn) para el cálculo de los factores S. Cabe mencionar que en este trabajo no pudo realizarse una estimación precisa de la contribución dosimétrica producida por la acumulación y eliminación de radiactividad en la vejiga ya que, en el estudio dinámico, no fue posible incluirla dentro del campo de visión de la cámara PET. Por este motivo, la componente de irradiación asociada a lo que se definió como “resto del cuerpo” se encuentra sobreestimada.
En el presente estudio se estimó la dosis media absor bida en la médula ósea del animal con el fin de evaluar la mielotoxicidad del radiofármaco en aplicaciones diagnós ticas. El resultado de dosis media por unidad de actividad administrada es de 8.7 μGy/MBq. Para la actividad de 15.4 MBq administrada al animal #1 (0.143 mCi/kg), la dosis calculada fue de 0.13 mGy.
La extrapolación de los resultados al modelo de hombre adulto arroja un valor de dosis por unidad de actividad de 32 μGy/MBq. A partir de esta magnitud es entonces po sible realizar una estimación de la dosis absorbida por la médula ósea multiplicando por la actividad administrada. Por ejemplo, para una actividad típicamente administrada en un estudio diagnóstico de 370 MBq (10 mCi), la dosis absorbida en la médula ósea da como resultado 12 mGy. Considerando para la médula un umbral de mielotoxici dad de 2 Gy20,21, se observa que las dosis alcanzadas en estudios diagnósticos son casi 200 veces menores a este valor. Se hace notar, sin embargo, que éste es un resulta do general que resulta relevante desde el punto de vista de la protección radiológica ya que no corresponde a una determinación efectuada sobre un paciente específico.
En conclusión, el radiofármaco [18F]FLT fue exitosa mente sintetizado en un laboratorio nacional y aplicado a un estudio dosimétrico en primates no humanos. Sobre la base del presente estudio se inició la fase clínica de utilización de [18F]FLT en seres humanos y un estudio de comparación con [18F]FDG (Fig. 3). Este último es útil en LDCGB para evaluar respuestas al tratamiento, pero no tiene valor predictivo en cuanto a discriminar entre subtipos biológicos con perfiles evolutivos diferentes. La disociación o coincidencia en la captación y distribución entre ambos radiotrazadores puede ser expresión de subtipos con comportamiento biológico diferente. Este dato, complementado con determinaciones inmunohisto químicas al momento del diagnóstico, puede determinar estrategias terapéuticas diferentes.
Fig. 3 Mujer de 52 años con LNH difuso a células grandes B. PET-TC basal con [18F]FDG y [18F]FLT (izquierda y derecha, respectivamente). Se puede observar la heterogeneidad en la distribución del radiotrazador en la adenopatía inguinal derecha, observándose otra imagen ganglionar subcentimétrica inguinal derecha.
