EDITORIAL

Nanotecnología, microchips y microarreglos

Las técnicas analíticas convencionales han experimentado en la última década una sustancial modificación por la instrumentación analítica miniaturizada.
Las ventajas están vinculadas principalmente a la reproductibilidad de los datos obtenidos, al corto tiempo empleado en el análisis, a la mínima cantidad de muestra utilizada, a la mejoría en la automatización e integración con la tecnología de los microfluidos y a la incorporación comercial de la instrumentación disponible para el análisis de muestras biológicas.

Microelectroforesis capilar

El fraccionamiento de proteínas sobre papel de filtro representó en su momento el intento más rudimentario de la electroforesis en los microcanales de fluidos presentes entre las fibras de papel. El advenimiento de los geles de agarosa, almidón y poliacrilamida significó para el área analítica de las proteínas, péptidos y bases de nucleótidos uno de los últimos avances tecnológicos en la investigación.
Pero la incorporación de la cromatografía líquida, la electroforesis capilar y sus modificaciones al campo de los microfluidos ha significado el gran aporte para la separación de ARN, ADN y el estudio de células por citometría de flujo.

Microchips

La firma Agilent Tecnologic ha desarrollado varios microchips constituidos por dos láminas de plástico de 4 cm por 4 cm adosadas entre sí, en cuyo interior se han gravado microcanales que unen 16 cavidades; en dos de ellas se ubican los reservorios de buffer y del líquido de lavado, y en el resto, las muestras; en un canal central principal se efectúa la separación electroforética por conexión a una fuente de alta tensión y luego se produce la lectura de las sustancias separadas por espectrofotometría o por fluorescencia inducida por láser (LIF).
Esta firma ha desarrollado distintas variedades de sistemas en microchips para el análisis de proteínas, con control automático de calidad, tamaño y cuantificación para el análisis de proteínas entre 5-50 kD y otro entre 14-200 kD. La separación se realiza en 45 minutos y permite la identificación de 10 proteínas. La resolución del buffer permite separar como si se tratara de un gradiente en gel de poliacrilamida.
La sensibilidad equivale a la detección de una concentración de proteínas del orden de 20-200 ng/mL por la coloración Cromassie no coloidal.
Las aplicaciones más comunes están relacionadas a la expresión de proteína, purificación, monitoreo de la calidad Q.A. (calidad analítica) y control de Q.C. (control de calidad), determinando la integridad o degradación de las proteínas.
También se han desarrollado otras variantes para el estudio de ADN y ARN.

Chip ADN
Es un chip que permite el análisis con elevada resolución de los productos de las reacciones de PCR y determina en forma precisa el diámetro y concentración de cada fragmento. Empleando florescencia inducida por láser (LIF) es posible detectar fragmentos de ADN de 0,5 ng. Se aplica a la detección de bandas muy débiles superpuestas a otras muy gruesas. Consume solamente 1 uL de muestra.

Chip ADN - 1.000
Permite el análisis de pequeños productos de PCR, y otros productos de múltiples separaciones de PCR y de reacciones de enzimas de restricción y pequeños plásmidos.

CHIP ADN – 7.500 y 12.000
Permite el análisis de pequeñas fracciones que en la electroforesis en gel no se colorean y que a veces se superponen a los grandes fragmentos; con estos chips es posible su resolución.

MICROCHIP para el control de ARN

ARN – 600
Identifica la degradación de ARN total y del ARNm; su sensibilidad es del orden de los picogramos. Una variante permite comparar diferentes protocolos donde las muestras se marcan antes de la hibridación para el estudio con los microarreglos (microarrays).
El software permite la superposición de los diferentes protocolos, lo que facilita la optimización de los procedimientos de hibridación.

Chips para citometría de flujo
El sistema ha sido diseñado para que en los microcanales, los microfluidos y las células allí contenidas, se desplacen por el movimiento electrocinético. Se utiliza para separar células vivas (coloreadas con calceína) de células muertas (coloreadas con anexina V). Se diferencian por fluorescencia inducida por láser que permite separar ambas poblaciones.
Lo expuesto permite vislumbrar el gran desarrollo de los microchips por microelectroforesis capilar para el estudio de ADN, ARN y poblaciones celulares diversas.

Microarrays - microarreglos

En la época en que Watson y Crick descubrieron la doble hélice del ADN (ácido desoxirribonucleico) faltaba conocer su vinculación de bases unitarias, adenosina, citosina, timina y guanina en todas las áreas de la vida.
Sin embargo, con el conocimiento de 30.000 genes fue posible crear un cuadro de la relación de dichos genes con la complejidad de la vida humana.
La respuesta sobre las variaciones secuenciales y las interacciones de genes conocidos, de unos sobre otros, así como la identificación de la interacción de genes desconocidos ha permitido tener una definición sobre habilidades predictivas del comportamiento genético.

Genoma: Secuencia del Saccharomyces cerevisae
La secuencia completa del Saccharomyces ha permitido disponer de información sobre varios organismos aplicable a la salud en humanos.
Fue éste el primer organismo eucariota cuya secuencia se conoció completamente: 12 megabases (Mb). En el caso del genoma humano el total de su información comprende 3.2 gigabases (Gb). El rápido crecimiento de este microorganismo permite su fácil manipulación genética. Los silicogenes (depósitos, por litografía sobre láminas de cuarzo, de secuencias de ADN) fabricados facilitan la predicción genética a través de la comparación con bases de datos disponibles; a su vez, muchos procesos de expresión son los mismos que tienen lugar en los organismos superiores.
A partir de la función y de la dinámica de la actividad genómica del S. cerevisae, se ha obtenido importante información acerca de las variaciones genéticas, replicación, colección de mutantes, ARNm y expresión de proteínas, interacción proteína-proteína y actividades bioquímicas.

Transcriptoma
Es el estudio de la expresión genética, obtenida por la recolección global de información que han aportado los laboratorios de investigación y que ha sido comparada y seleccionada; los datos globales han sido obtenidos aplicando técnicas diversas que incluyen microchips de ADN, microchips de oligonucleótidos y análisis serial de la expresión génica (SAGE), cada uno con sus ventajas y limitaciones.
Las técnicas empleadas son distintas y complejas en cuanto a la realización e interpretación de resultados.
El ARNm complementario que es expresado por un organismo lo es de forma dinámica y los cambios ocurren bajo diferentes condiciones. Existen técnicas que permiten conocer los resultados de la transcripción:
• Electroforesis bidimensional en gel
El fraccionamiento bidimensional en gel permite la separación de proteínas por carga y en segunda dimensión por diámetro del poro.
• Espectroscopia de masa
Esta técnica ha permitido proveer información exacta sobre la masa de moléculas complejas y pueden ser identificadas cantidades extremadamente variadas de proteínas así como el espectro de sus fragmentos, lo que induce a suponer con gran aproximación los aspectos tridimensionales.

Microarreglos (microarrays)
Se utilizan para la medición de la abundancia de transcripción de ARNm; generalmente existen métodos diferentes para medir los fragmentos.

Transcripción de ADN
Los ácidos nucleicos son investigados por hibridación y existen dos tipos de arreglos.
• Microarreglos de oligonucleótidos
Un tipo de estos sistemas es manufacturado por Affimetrix y es conocido como GENE CHIPS; contiene cientos o miles de oligonucleótidos sintéticos con 25 bases de longitud sobre un soporte sólido, sintetizados in situ y coloreados con cromóforos. Cada gen es generalmente presentado ante más de 15 oligonucleótidos de ADN y ARN y los fragmentos son marcados antes de su hibridación. La estimación cuantitativa de la abundancia de la transcripción puede ser obtenida directamente por el promedio de todas las sondas a lo largo de un gen.
• Microarreglos de ADN
Este procedimiento se basa en moléculas de doble cadena de ADN que han sido obtenidas por PCR. Corresponden a cada secuencia genómica de cADN que han sido depositadas sobre láminas de vidrio. Usualmente contienen una sonda por gen. Por razones técnicas, la información que es obtenida por microarreglos da una concentración relativa por una transcripción cuando se comparan dos condiciones experimentales.
Las muestras de dos corridas son marcadas con diferentes colorantes y el pool también, para observar la hibridación competitiva.

Expresión génica por análisis serial (SAGE)
La identificación y la transcripción cuantitativa de secuencias de bases no es una predicción de prioridad de gen. Generalmente se emplea una secuencia de 15 bp (pares de bases) aislada de una determinada enzima de restricción 3' final de cADN (ADN complementario). Estos tags son trozos que contienen suficiente información genética como para identificar la transcripción de donde proviene el tag. Los 15 bp tags son concatenados y amplificados por PCR clonada y secuenciada. La abundancia de transcripción es estimada por el conteo de la ocurrencia de cada SAGE tags.

Disponibilidad de sistemas para el conocimiento de la expresión génica

GENE-CHIPS® es la marca de un arreglo de sondas para la medida cuali-cuantitativa de los niveles de expresión del gen en los modelos de organismos.
Adicionalmente, la expresión de los microarreglos puede ser adjudicada como la secuencia de un organismo y puede ser incorporada al programa de bases de datos CUSTOM ExpressTM. Cada gen o EST es interrogado en una expresión de un arreglo de sondas de oligonucleótidos.
Así se han estructurado GENE-CHIPS conteniendo más de 54.000 sondas que representan mucho más de 47.400 transcripciones derivadas de 39.000 genes humanos.
Así se disponen de GENE-CHIPS del genoma humano, con diversas transcripciones adecuadas a la investigación que se requiera. En la siguiente lista es posible tener una visión de la variedad de GENE-CHIPS disponibles para el genoma humano, genoma de ratón, bovino, canino, rata, organismos inferiores como plantas, arabidopsis Thalia, V. vinífera, para el estudio de las vides y sus posibles alteraciones por efectos de stress biótico o abiótico.
Otros microarreglos han sido desarrollados en diversos campos, el de mayor relevancia por su trascendencia económica es el microarreglos para la soja, para la detección de variedades transgénicas y para identificar las acciones de hongos y nematodes.

Dr. Juan M. Castagnino
Director
Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana