1. INTRODUCCIÓN

Según el ^DAMA (2004), “en el Distrito Capital, el Bosque Altoandino se encuentra en el rango altitudinal de 2.800 a 3.000 m s. n. m., se caracteriza por la disminución de altura de los árboles y se diferencia del bosque andino porque tiene un estrato arbóreo y una mayor cobertura de los estratos arbustivos y herbáceas. Allí es posible encontrar bosques altos y bajos”. El encenillal típico (vegetación característica de este tipo de bosque), es una consociación de encenillos (Weinmannia tomentosa) con gaque (Clusia sp.), cucharo (Myrsine sp.) y chusque (Chusquea sp.) como principales subdominantes. Entre algunas de las coberturas presentes, se encuentra el “bosque de laderas altas de encenillo (W. tomentosa) y canelo (Drimys granadensis) entre los 3.200 y 3.400 m, localizado típicamente en Monserrate, San Francisco y Santa Fe” (^{DAMA, 2000}).

En Colombia la deforestación es el principal disturbio antrópico que afecta a todos los ecosistemas terrestres y algunos costeros. Ante esta situación, el manejo de ecosistemas a través de conservación y restauración ecológica toma fuerza cada día, como solución para revertir procesos de degradación de ecosistemas y pérdida acelerada de biodiversidad (^{Vargas, 2011}). En la región andina la práctica agropecuaria ha ascendido a los pisos alto andino y de páramo, y ha originado nuevos frentes de colonización y alterado así, los ecosistemas de las laderas cordilleranas (^{FAO, 2002}). Para abordar en cierta medida la problemática mencionada, el programa de investigación en Manejo de especies vegetales de la Región Capital, liderado por la Subdirección Científica del Jardín Botánico de Bogotá José Celestino Mutis (JBB), dentro de las estrategias de conservación ex situ de los recursos fitogenéticos, contempla el desarrollo de estudios en propagación (sexual e in vitro). Esta línea de investigación, fundamenta las actividades del Sistema Integrado de Propagación (SIP) y el desarrollo del proyecto Biodiversidad andina al plato de todos, financiado por Colciencias.

Drimys granadensis, conocida como canelo de páramo, es una especie nativa que se encuentra en la región biogeográfica de los Andes, se distribuye desde el centro de México hasta el norte de Perú y su estado de conservación no ha sido evaluado aún. En Colombia se encuentra en los departamentos de Antioquia, Boyacá, Caldas, Caquetá, Cauca, Cundinamarca, Huila, Nariño, Norte de Santander, Putumayo, Quindío, Risaralda, Santander (^{Bernal et al., 2015}). Crece en formaciones vegetales de bosque montano bajo (b-MB) y bosque muy húmedo montano bajo (bmh-MB) - ^{Cantillo et al. (2007)}. ^{Según Finegan (1993)} y ^{Cantillo et al. (2007)}, esta es una especie heliófita durable que requiere de sombra en sus primeras etapas de desarrollo. Todas las partes de la planta son aromáticas y de sabor picante (^{Bartholomäus et al., 1998}), se reproduce por semillas y estacas (^{Cantillo et al., 2007}), tiene diversos usos alimenticios, industriales, medicinales, ornamentales (^{CAR, 2012}) y sus aceites esenciales poseen metabolitos activos que son usados como sustancias insecticidas (^{Cicció, 1997}).

Las semillas de D. granadensis L. f. se desarrollan al interior de frutos simples, secos, indehiscentes en forma de cápsula. Su color es verde cuando se encuentra en óptimo estado (etapa de fructificación) y café-verdoso cuando las semillas están deterioradas. Pasado el tiempo de fructificación las semillas caen al suelo alrededor del árbol madre, y allí la cápsula se rompe para dar inicio a una nueva fase de propagación sexual. Los frutos varían de tamaño (entre 0.5 y 1.6 mm aproximadamente), y el número de semillas contenidas en cada fruto oscila entre 1 y 3 en frutos de tamaño menor, y entre 3 y 10 en frutos de tamaño mayor a 1.5 cm ^{Cantillo et al., (2007)}. Esta especie ha sido incluida en Vademécum de Plantas Medicinales de Colombia por el Ministerio de la Protección Social (2004), por su actividad farmacológica y sus propiedades analgésicas y antiinflamatorias, siendo útiles las hojas y la corteza. La familia Winteraceae no dispone aún de información de condiciones de almacenamiento (^{Royal Botanical Gardens - Kew, 2008}).

Según ^{Castañeda-Garzón (2014)}, los resultados de las pruebas de calidad de semillas en D. granadensis L.f. procedente de Choachí (Cundinamarca, vereda Agua Dulce), el porcentaje de pureza es 93,18 %, el peso promedio de semillas es 0,14 gr, el contenido de humedad es 39,70 %, la viabilidad al corte es 96,65 % y el porcentaje de germinación promedio es 47 % en sustratos (arena y turba) y del 16 % en papel absorbente (pruebas de germinación controlada, 4 muestras de 50 semillas). Se tiene conocimiento que las semillas de color negro son las que exhiben germinación, siendo éste un indicador fisiológico de la semilla de D. granadensis.

Con respecto a la propagación sexual de D. granadensis, ^{Castañeda-Garzón (2014)} afirma que el porcentaje de germinación de material proveniente de Choachí (Cundinamarca) es cercano al 43 % al emplear tratamientos pregerminativos fitohormonales de giberelina A3 (1000 y 2000 ppm) y sembrar en turba (100 %) o arena (100 %) bajo un porcentaje de sombra del 30%, corroborando y complementando los aportes hechos por ^{Castañeda et al. (2007)}. El autor menciona que el momento óptimo para la colecta de semillas se presenta cuando el fruto tiene una coloración verde y se encuentra en el árbol; aspecto corroborado al consultar los resultados obtenidos por ^{Cantillo et al., (2007)}.

Con el objetivo de evaluar de manera preliminar la respuesta de la especie D. granadensis ante el uso de métodos de reproducción sexual e in vitro, tratamientos de desinfección, pregerminativos y sustratos, se desarrolló el presente estudio que contempló como fases de trabajo la recopilación de información secundaria y la prospección, el seguimiento fenológico y la identificación de fuentes semilleras candidatas (FSC) en áreas circundantes a la Región Capital, la recolección y el acondicionamiento de material vegetal, el establecimiento de ensayos de germinación en condiciones de invernadero e in vitro, el seguimiento de la germinación y el análisis de los resultados.

El presente manuscrito no profundiza aspectos relacionados con parámetros de vigor, viabilidad, morfometría de semillas y biometría de plantas, ya que estos análisis son desarrollados por el equipo del banco de semillas del Jardín Botánico de Bogotá (JBB), que posteriormente entregará resultados para la especie. El alcance del presente estudio permite identificar el poder germinativo de las semillas de D. granadensis en condiciones de invernadero e in vitro y su potencial uso por parte de comunidades del Distrito Capital, como uno de los aspectos contemplados a desarrollar en el marco del proyecto “Biodiversidad Altoandina al plato de todos”.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

Ensayos de germinación tradicional

De acuerdo con los resultados obtenidos por ^{Marquinez-Casas et al. (2009)}, ^{Castañeda et al. (2007)} y ^{Pérez-Martínez (2012)}, se establecieron varios ensayos de germinación en el invernadero de la Subdirección Científica del JBB (fotoperiodo 12/12 y sombra 30 %), bajo diseños experimentales completamente al azar (excepto por dos ensayos debido a la poca disponibilidad de material vegetal), que incluyeron como factores de análisis: fuentes semilleras candidatas, sustratos y tratamientos pregerminativos. Los sustratos empleados fueron arena (AR), lombricompost (LBC), turba (TU), tierra negra (TN) y cascarilla de arroz (CA). En tanto que como tratamientos pregerminativos se evaluó el uso de fitohormonas (GA₃ 0, 1.000, 2.000 y 4.000 ppm), el almacenamiento en frío (4 °C), la inmersión en agua fría (IAF) y caliente (IAC, a punto de ebullición), y/o la estratificación en frío a 4 °C entre arena de río e hidratación (EFAH) (Tabla 1). Todos los ensayos fueron establecidos en germinadores plásticos y bajo malla polisombra (30 %) debido a la efectividad de la misma sobre la propagación sexual en condiciones de invernadero, informada por ^{Castañeda et al. (2007)}. En invernadero la temperatura promedio fue de 15,72 °C y la humedad relativa promedio del 76,70 %; el periodo máximo de registro de germinación (emergencia de plántulas) en los ensayos fue de 193 días.

Tabla 1. Ensayos de propagación sexual en D. granadensis. 

Ensayos de germinación in vitro

Paralelamente, se indujo la germinación in vitro de semillas provenientes de la misma procedencia. El experimento se realizó en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales de la Subdirección Científica del JBB. En la etapa de desinfección, las semillas se sumergieron en una solución de detergente neutro (extran®, 2 %) durante 15 min. Después se realizaron 3 enjuagues con agua microfiltrada estéril, se continuó con la inmersión en hipoclorito de sodio al 5,25 % durante 1, 3, 5 y 7 min (TD1, TD2, TD3 y TD4, respectivamente) y se finalizó con la aplicación tres enjuagues con agua microfiltrada estéril. Las semillas fueron sembradas en el medio de cultivo ^{Murashige y Skoog (1962)}, con reducción de sus sales minerales y vitaminas en un 50 % (MS ½). Como suplementos se emplearon: myo-inositol (0.1 gr/l), carbón activado (2 gr/l), sacarosa (15 gr/l) y agar (5 gr/l). La unidad experimental fue de 1 semilla por tubo de ensayo y se manejaron 5 repeticiones por tratamiento de desinfección. La evaluación del porcentaje de contaminación se realizó una semana después de la siembra. Para el proceso de germinación in vitro, las semillas fueron desinfectadas de acuerdo con el esquema que brindó los menores niveles de contaminación y se sometieron un tratamiento pregerminativo relacionado con remoción de la testa (R), siembra directa (S) o estratificación fría a 16 ºC durante 1 mes, en recipiente oscuro (E). Posteriormente, se llevó a cabo la siembra de semillas en los medios de cultivo descritos en la Tabla 2. En total, fueron evaluados 18 tratamientos de germinación (Tabla 3). La unidad experimental correspondió a una semilla en un frasco de cultivo. Se sembraron 6 repeticiones para cada uno de los tratamientos de germinación. Los frascos se ubicaron en la sala de incubación en total oscuridad, con un rango de temperatura entre 19 y 27 °C. El registro de la variable porcentaje de germinación se realizó cada 7 días durante 3 meses. Se consideró la semilla germinada cuando hubo emisión de la radícula. Los ensayos experimentales empleados para la desinfección y germinación fueron completamente al azar.

Tabla 2. Medios de cultivo para la siembra de semillas de D. granadensis. 

Tabla 3. Tratamientos para inducir la germinación in vitro en D. granadensis. 

R, S y E están relacionados con el tratamiento pregerminativo aplicado, correspondiente a remoción de la testa (R), siembra directa (S) o estratificación fría a 16 ºC durante 1 mes en recipiente oscuro (E), respectivamente. M1, M2, M3, M4, M5 y M6 corresponden a los medios de cultivo empleados para la siembra, descritos en la Tabla 2.

Análisis estadístico

El análisis de los datos obtenidos en el periodo de evaluación de la germinación (promedio de 6 meses para propagación sexual y 3 meses para propagación in vitro) se abordó inicialmente por medio del análisis exploratorio (excel), a partir del cual se obtuvieron las curvas de germinación y crecimiento por ensayo. Seguidamente, se llevó a cabo el análisis estadístico (univariado) para los ensayos establecidos bajo diseños experimentales, por medio de los programas estadísticos PAST 2.17 (^{Hammer y Harper, 2006}), SAS 9.1 y R, previa verificación del cumplimiento de los parámetros de distribución de la variable y de distribución normal. El análisis de varianza se realizó con un nivel de confianza del 95 %, se contrastaron las hipótesis planteadas para cada procedimiento y se complementó con el test de Tukey.

3. RESULTADOS

Ensayos de germinación tradicional

El uso de giberelina A₃ tuvo un efecto variable en la germinación de D. granadensis. El uso de la fitohormona en concentraciones de 2.000 y 1.000 ppm, es favorable en materiales procedentes de Choachí, sin embargo, se observan diferencias al emplear diferentes sustratos (Figura 1). El análisis de varianza (ANOVA) demostró diferencia significativa para la variable porcentaje de germinación (PG) de D. granadensis (p ≤ 0,05) en el ensayo cinco. La prueba de Tukey (α = 0,05), el tratamiento testigo produjo efectos que presentan diferencia estadística con respecto a todos los demás tratamientos evaluados.

Figura 1. Porcentaje promedio de germinación de D. granadensis al emplear fitohormonas. AR (Arena), TU (Turba); TN (tierra negra), CA (Cascarilla de arroz). * Tratamiento estadísticamente significativo (p ≤ 0,05) y Tukey (α = 0,05). 

Los ensayos para evaluación preliminar del efecto de los tratamientos de inmersión en agua, estratificación y sustrato, denotan que la inmersión en agua fría, estratificación en frío-húmedo y el uso de tierra negra como sustrato, en material proveniente de Choachí (Cundinamarca), son favorables para la germinación. Sin embargo, el uso de TN (50 %) y LBC (50 %), arroja los mayores valores (Figura 2).

Figura 2. Porcentaje promedio de germinación de D. granadensis al emplear otros tratamientos pregerminativos. T (Testigo), IAF (Inmersión en agua fría), IAC (Inmersión en agua caliente), EFAH (estratificación en frío a 4°C, entre arena de río e hidratación), SEF (almacenamiento en frío a 4° C, sin sustrato e hidratación), TN (tierra negra), TU (Turba), LBC (Lombricompost), AR (Arena). 

Ensayos de germinación in vitro

Para los tratamientos de desinfección con TD1 y TD2 (hipoclorito de sodio al 5,25 %, con inmersión de 1 y 3 min) la contaminación fue del 60 %. Ésta se redujo al 20 % empleando los tratamientos de desinfección TD3 y TD4 (hipoclorito de sodio al 5,25 %, con inmersión de 5 y 7 min). Al realizar análisis de varianza para la variable porcentaje de contaminación, se encontró que los tratamientos de desinfección no presentan diferencias significativas (P = 0,3909). Sin embargo, teniendo en cuenta los mayores niveles de desinfección y el menor tiempo de inmersión del explante, se destaca el tratamiento TD3 (hipoclorito de sodio al 5,25 %, con inmersión de 5 min) como el más apropiado. En el proceso de establecimiento, 12 semanas después de la siembra in vitro, la germinación fue nula en todos los tratamientos, excepto en el T1 (R+M1), en donde se observó, al término del tiempo de evaluación, emergencia de la radícula en un 16,6 % de las semillas sembradas. Al realizar el ANOVA, no se encontraron diferencias significativas (P = 0,4660).

4. DISCUSIÓN

La evaluación de los ensayos de germinación (vía tradicional) establecidos para la especie D. granadensis, dejan ver que en general, el porcentaje de germinación (PG) del material proveniente de Choachí (Cundinamarca) es superior (42,67 %) al emplear el tratamiento pregerminativo de giberelina A3 (2000 ppm) y sembrar en turba (100 %), bajo un porcentaje de sombra del 30 %. No obstante, bajos las mismas condiciones de sombra y de sustrato, el tratamiento testigo alcanzó valores altos de germinación (41,33 %). En contraste, en sustrato de arena (100 %) y sombra del 30 %, el mayor valor de germinación se obtuvo en el tratamiento de giberelina A3 (1000 ppm). Lo anterior, revela un posible efecto del sustrato en la germinación de D. granadensis, que sugiere ser evaluado posteriormente. Estos resultados difieren con los obtenidos por Castañeda et al. (2007) y ^{Cantillo et al. (2007)} al evaluar material procedente de la Reserva Forestal de San Cristóbal (Cerros Orientales), al observar mayores valores de germinación ante el uso de giberelina A3 (1000 y 2000 ppm).

En los ensayos de propagación sexual (en invernadero) de D. granadensis en los cuales se combinó la evaluación de fitohormonas y sustratos, los valores más altos de germinación se obtuvieron en turba 100 % (PG 42,67 %) y arena 100 % (PG 32 %) empleando giberelina A₃ como tratamiento pregerminativo. En contraste, la inmersión de las semillas en agua (tratamiento testigo) presentó los mayores PG, al emplear como sustrato la composición de tierra negra-cascarilla (70% - 30 %); en estas condiciones, se obtuvo un PG de 24 % y 16,17 % en semillas procedentes de Choachí y de 7,33 % en las semillas procedentes de Bogotá. Al revisar los PG obtenidos en los ensayos en los cuales se contemplaron de manera independiente y como tratamientos: la inmersión de las semillas, la estratificación y el sustrato, los mayores valores de PG para semillas procedentes de Choachí, se observan al sembrar en tierra negra-cascarilla 70- 30 % (12,50 %, inmersión en agua fría), tierra negra-turba 50 % - 50 % (32 %, estratificación frío-húmedo), tierra negra-lombricompost 50 % - 50 % (63,5 %, estratificación frío-húmedo) y tierra negra (12 %). Lo anterior, revela de manera preliminar, diferencias en la germinación de D. granadensis de acuerdo al sustrato empleado.

Estos resultados corroboran lo mencionado por ^{Niembro y Fierros (1990)}, al afirmar que “la germinación de las semillas se encuentra fuertemente influida por las características físico-químicas del sustrato empleado, ya que puede favorecer o entorpecer la germinación”. Aunque en el presente estudio, no se registraron las características físico-químicas de los sustratos utilizados, se observa una posible fuente de variación por parte de esta variable, que sugiere evaluarse posteriormente, afín de identificar el mejor sustrato a emplear para la propagación de D. granadensis. La obtención de menores valores de PG en la composición de sustrato de tierra negra-cascarilla (70 % - 30 %) con respecto al uso de otros sustratos, podría deberse a lo mencionado por ^{Sampaio et al. (2008)}, quienes afirman que “aquellos sustratos asociados con la presencia de cascarilla de arroz y fibra de coco, realizan poco aporte nutricional en cuanto a nitrógeno y fósforo, para un buen desarrollo de plántulas”. El uso de lombricompost, podría ser más favorable para D. granadensis debido a su aporte orgánico.

El efecto del sustrato en la germinación y desarrollo, ha sido evaluado en algunas especies forestales (^{Aparicio-Rentería et al., 1999}), frutales (^{Andrade-Rodríguez et al., 2008}; ^{Méndez Natera et al., 2009}) y hortalizas (^{Araméndiz-Tatis et al., 1999}), identificando una variación en la incidencia de los mismos, debida a las características de las especies y la composición de sustratos. Esto se ha observado al usar sustratos como arena, aluvión, cascarilla de arroz, fibra de coco, lombriabono y gallinaza para Solanum melongena (^{Araméndiz-Tatis et al., 1999}); arena, suelo y bagazo para Psidium guajaba (^{Méndez Natera et al., 2009}); turba, vermicompuesto, tierra de hoja, fibra de coco, aserrín y agrolita para Carica papaya (^{Andrade-Rodríguez et al., 2008}) y arena de mina, tierra de monte y agrolita para Pinus patula, Pinus montezumae y Pinus pseudostrobus (^{Aparicio-Rentería et al., 1999}). Los resultados obtenidos en el presente estudio dejan ver que algunas combinaciones de factores internos y externos inciden en la germinación de D. granadensis, corroborando lo expuesto por ^{Abraham de Noir y Ruiz de Riberi (1995)}, quienes indican que para “que se produzca la germinación es necesaria la interacción de factores externos (sustrato, temperatura, humedad, aireación e iluminación), y de factores internos o propios de la semilla (viabilidad y latencia)”. Lo anterior, denota la necesidad de desarrollar estudios en los cuales se evalúen diferentes combinaciones de factores, con el objetivo de identificar los mejores métodos de propagación de la especie.

Según ^{Ramos (2002)}, la dispersión de semillas registrada en esta especie, está relacionada con la densidad de árboles adultos y la tendencia aparente para D. granadensis, es la germinación inmediata de las semillas en el sitio. La reproducción sexual constituye el principal método de propagación en la mayor parte de los casos (^{Toogood, 2000}), sin embargo, está condicionada por la disponibilidad de semilla, que es “influenciada por la fenología de las especies y por la producción estacional de las semillas” (^{Penhalver y Matovani, 1997}). Por esta razón, se sugiere integrar estos resultados, con el desarrollo de estudios de seguimiento fenológico y caracterización temporal de lluvia de semillas en los sitios de estudio y en aquellos en los cuales se registra la presencia de la especie, como por ejemplo el páramo El Granizo (Monserrate), el pantano de Martos (Guatavita) y el Cerro de Mamapacha (Boyacá)-^{Ramos (2002)}, ^{Rodríguez-Santamaría et al., (2006)} y ^{Avella-M. et al., (2014)}; sitios de interés para la conservación. Esto permitirá enriquecer los bancos de germoplasma (colecciones de campo) de la especie, como medida de conservación ex situ.

En el estudio se observó que el inicio de la germinación de D. granadensis es, en promedio, superior a los 60 días (condiciones de invernadero). Para las semillas procedentes de Choachí, los mayores valores de germinación (41,33 y 42,67 %) se obtuvieron al emplear turba (100 %) como sustrato e inmersión de semillas en agua y en giberelina A₃ (2000 ppm) durante un periodo de 24 horas. Sin embargo, se observa que la inmersión en agua (tratamiento testigo) favorece igualmente la germinación de las semillas al emplear sustratos (tierra negra 70 % y cascarilla 30 %). Los resultados de la evaluación preliminar de tratamientos de estratificación en semillas procedentes de Choachí, se observa que la germinación es superior al emplear la estratificación en frío y húmedo a 4 °C (entre arena de río e hidratación por 30 días) y sembrar en sustrato de tierra negra y lombricompost (50:50).

En general, las semillas almacenadas en seco (4 °C), presentaron menores porcentajes de germinación; resultados que dejan abierta la hipótesis que la especie presente latencia morfofisiológica, ya que otros autores (^{Figueroa et al. 1996}, ^{Figueroa y Jaksic 2004}) han identificado que Drimys winteri J. R. Forst. & G. Forst, exhibe latencia fisiológica y morfológica en sus semillas y el tratamiento para inducir la germinación es la estratificación fría. Para algunas especies con probable latencia fisiológica (^{Godines y Flores, 2000}), el uso los tratamientos de estratificación térmica, incide favorablemente en la germinación.

El estudio desarrollado por ^{Abreu et al. (2005)} en Drimys brasiliensis Miers, en el que se evalúa la combinación de sustratos (papel filtro, arena y vermiculita) y estratificación (30, 60 y 90 días) a diferentes temperaturas (17, 25 y 30 °C) en cámara de germinación (20-30 °C), asociadas a características morfológicas del embrión, denotan que “el tratamiento pregerminativo de estratificación promueve el desenvolvimiento embrionario, superando la dormancia de sus semillas”. El autor afirma que “D. brasiliensis, por ser una especie andina, no necesita desarrollar mecanismos fisiológicos de adaptación a climas fríos, por lo tanto, un periodo de estratificación es suficiente para revertir el estado de dormición y que las semillas germinen en invierno”. Esta recomendación podría ser igualmente útil para D. granadensis, una especie andina de clima frío.

La respuesta en la germinación ante condiciones de humedad alta de D. granadensis así como la alta cantidad de endospermo, revela tentativamente la recalcitrancia de sus semillas. Según ^{Magnitskiy y Plaza (2007)} “al contrario de las semillas ortodoxas, las semillas recalcitrantes se diseminan en una condición húmeda y metabólicamente activa (^{Leprince et al., 1993}, ^{Kainer et al., 1999}), perdiendo rápidamente su capacidad de germinación al quedar expuestas a condiciones de baja humedad (^{Kermode y Finch-Savage, 2002})”. Con respecto al tipo de semilla y a las condiciones de almacenamiento, para la familia Winteraceae no dispone aún de información (^{Royal Botanical Gardens - Kew, 2008}).

Entre los tratamientos pregerminativos sugeridos para la D. granadensis, se encuentra la inmersión en agua durante 24 horas (^{Cordero y Boshier 2003}, ^{García 2010} y ^{Ramírez-Marcial et al., 2003}), la inmersión en GA3 a 1.000 ppm durante 24 horas (^{García-Flores, 2010}) y se registra un periodo de germinación entre 102 y 138 días (^{García-Flores, 2010}) y entre 180 y 200 días (^{Ramírez-Marcial et al., 2003}); no obstante, en el presente estudio se identificó que a través de ensayos de propagación sexual, es factible que este periodo de tiempo disminuya al emplear los tratamientos pregerminativos mencionados con anterioridad.

La desinfección de explantes se convierte, en ciertas ocasiones, en una limitante para el establecimiento in vitro de material vegetal. Las causas se relacionan principalmente con la poca disponibilidad de explantes o con el alto grado de contaminación que presenta el material vegetal cuando éste es recolectado en condiciones naturales. Por lo anterior, el uso de semillas de D. granadensis como material de partida, fue una buena alternativa para lograr el establecimiento aséptico de explantes y poder así estudiar los mecanismos de germinación en condiciones in vitro (^{Pérez-Martínez, 2012}). Cuando se emplea la semilla como explante de partida, se requiere que igualmente sea sometida a ensayos de desinfección para eliminar microorganismos contaminantes que puedan impedir su germinación. El hipoclorito de sodio es el agente a base de cloro más empleado y recomendado para la desinfección superficial de materiales a introducir al cultivo in vitro (^{Abdelnour y Muñoz 2005}, ^{Blanco y Valverde 2004}), es útil como germicida y agente oxidante, resulta ser muy eficiente para éste propósito, seguro, de fácil enjuague y muy económico (^{Suárez 1997}, ^{Carmona 2003}). Sin embargo, su empleo en un tiempo prolongado y a elevadas concentraciones, puede alterar las condiciones fisiológicas de los explantes dando lugar a necrosis y pérdida de la viabilidad (^{Flores et al., 2008}). Teniendo en cuenta los parámetros mencionados, las semillas D. granadensis fueron tratadas empleando como agente desinfectante el hipoclorito de sodio al 5,25 % con 4 tiempos de inmersión, que no superaron los 7 min. En el estudio, se identificó al tratamiento TD3 (hipoclorito de sodio al 5,25 % con inmersión de 5 min), como el esquema de desinfección más adecuado, ya que se alcanza el mismo porcentaje de desinfección (80%) con relación al TD4 (hipoclorito de sodio al 5,25 % con inmersión de 7 min), al emplear un menor tiempo de inmersión del explante. Para D. granadensis, la fase de establecimiento in vitro reveló que el uso del tratamiento T1: R+M1 (remoción de la testa y siembra en medio MS al 100 % en sales y vitaminas, sin suplementos orgánicos u hormonales) favoreció la germinación del 16,6 %, tres meses después de la siembra. Lo anterior indica que probablemente los mecanismos de latencia de las semillas de D. granadensis están influenciados por la presencia de la testa, la cual puede tener un efecto químico, por ejemplo, por la presencia de inhibidores fenólicos (^{Selle et al., 1983}) o mecánico, impidiendo el flujo necesario de agua y oxígeno para la germinación (^{Kelly et al., 1992}). Los resultados obtenidos al emplear oscuridad en la sala de incubación como factor de evaluación, corroboran lo expresado por ^{Finegan (1993)} y ^{Cantillo et al. (2007)}, con respecto al gremio ecológico “heliófito durable” al que pertenece, ya que requiere de sombra en sus primeras etapas de desarrollo.

Los resultados de germinación in vitro para D. granadensis revelan que el proceso germinativo es sensible a la presencia de suplementos hormonales (GA3) u orgánicos (pulpa de banano) e influenciado positivamente al emplear el medio de cultivo MS al 100 % en sales y vitaminas (M1). Estos resultados contrastan los registrados para otras especies, en donde se ha hecho necesaria la adición al medio de cultivo citoquininas, giberelinas o fluridone, para romper la latencia de las semillas (^{Ali-Rachedi et al., 2004}) y en donde el efecto inhibidor del medio MS, se evidencia incluso cuando se emplea en bajas concentraciones, por lo que se les atribuye a los nutrientes del medio MS, la disminución del vigor y retardo de la germinación (^{Rodríguez et al., 2014}). El estrés osmótico provocado por un medio rico en sales como el MS, podría incidir en que el metabolismo de los tejidos vegetales estimule la liberación de compuestos que son fáciles de oxidar convirtiéndose en fitotóxicos (^{Turkan y Demiral, 2009}).

Paralelamente, es importante disponer de diferentes fuentes semilleras para D. granadensis y comparar los resultados del cultivo de tejidos por procedencia, ya que en algunas especies forestales (p.e. Quillaja saponaria Mol.), se ha identificado que la germinación in vitro, el crecimiento de las plántulas y el enraizamiento, se encuentran estrechamente relacionados con el origen materno de las semillas (^{Prehn et al., 2003}).

5. CONCLUSIONES

Para las semillas de Drimys granadensis procedentes de Choachí (Cundinamarca), la germinación en condiciones de invernadero es superior al 40 %, al emplear como tratamiento pregerminativo la inmersión de las semillas en giberelina A₃ (2000 ppm, durante 24 horas) y posterior siembra en turba (100 %) y contenedores plásticos, bajo un porcentaje de sombra del 30 %. D. granadensis exhibe el inicio de la germinación (vía tradicional) en un periodo promedio de 75 días, presentando un porcentaje de germinación máximo de 63,50 %.

En contraste, en la germinación in vitro, el mayor nivel de desinfección de semillas se alcanza al emplear principalmente hipoclorito de sodio al 5,25 %, con inmersión del explante durante 5 min. La germinación de D. granadensis en estas condiciones se ve influenciada por la remoción de la testa y la siembra en un medio de cultivo sin fitorreguladores ni suplementos orgánicos. Sin embargo, se debe profundizar en los mecanismos que controlan la latencia y determinar la influencia en los procesos de germinación de otros factores, como la fuente semillera.

Se recomienda extraer manualmente las semillas y almacenarlas secas a 4°C o en refrigerador, para evitar su deterioro. De igual manera, recolectar la semilla cuando el fruto aún está en el árbol y está de color verde-amarillento, para evitar problemas fitosanitarios. En caso de no disponer de fitohormonas, se recomienda sembrar en las mismas condiciones de sombra y emplear como tratamiento pregerminativo la inmersión en agua por 24 horas y la composición de sustrato tierra negra y cascarilla (70 % - 30%) y/o tierra negra-lombricompost (50 % - 50 %). No obstante, se tiene conocimiento que para especies del mismo género y para la especie de estudio, se observa un efecto de la estratificación en frío-húmedo (almacenado a 4 °C, en arena de río e hidratación) en la germinación.