GENÉTICA Y BIOLOGÍA

Diseño de un método molecular para la detección de Ilex dumosa en yerba mate elaborada utilizando una secuencia específica ubicada en la región ITS2 del DNA ribosómico

Design of a molecular method for the detection of de Ilex dumosa in manufactured yerba mate using a specific sequence situated in the ITS2 region of the ribosomal dna

 

Mónica Lucrecia Barchuk, María Mercedes Tiscornia, Ernesto Martín Giorgio, María Isabel Fonseca, Pedro Darío Zapata

¹ Laboratorio de Biotecnología Molecular - Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales - Universidad Nacional de Misiones. Módulo de Bioquímica y Farmacia - Av. Mariano Moreno 1375 - 3300 - Posadas, Argentina. E-mail: biotecmol2010@gmail.com

. Mónica Lucrecia Barchuk¹ Licenciada en Genética por la Universidad Nacional de Misiones. Becaria doctoral del CONICET/CEDIT y miembro del Laboratorio de Biotecnología Molecular (FCEQyN - UNaM). Posee presentaciones a congresos nacionales e internacionales. biotecmol2010@gmail.com

. María Mercedes Tiscornia¹ Licenciada en Genética por la Universidad Nacional de Misiones. Auxiliar de Primera en la Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales (UNaM), dictando materias de grado. Es Becaria del CONICET y miembro del Laboratorio de Biotecnología Molecular (FCEQyN - UNaM). Dirige auxiliares y becarios de grado. Posee publicaciones en revistas indexadas nacionales e internacionales y presentaciones a congresos nacionales e internacionales.

. Pedro Darío Zapata¹ Bioquímico, Doctor por la Universidad de Alcalá de Henares, Profesor Regular Adjunto en la Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales (UNaM), dictando materias de grado y posgrado. Es Secretario de Extensión y Vinculación Tecnológica de la FCEQyN - UNaM. Es Director del Laboratorio de Biotecnología Molecular (FCEQyN - UNaM). Se desempeña como Director y Co-Director de proyectos Incentivados y Subsidiados. Dirige auxiliares, becarios de grado y posgrado. Posee publicaciones en revistas indexadas nacionales e internacionales y presentaciones a congresos nacionales e internacionales.

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Resumen

En la provincia de Misiones predominan dos especies del género Ilex: I. paraguariensis e I. dumosa, pero solo la primera debe ser utilizada para la elaboración del producto yerba mate. I. dumosa es frecuentemente utilizada en mezclas con I. paraguariensis, aunque en cantidades superiores al 1% son consideradas adulterantes. Desde el punto de vista tecnológico es factible diferenciarlas a través del uso de marcadores moleculares como las regiones ITS del DNA ribosómico. El objetivo del trabajo fue diseñar una técnica molecular que permita detectar I. dumosa en paquetes de yerba mate cuando esta se encuentre como adulterante. Para ello se trabajó con hojas frescas, 13 marcas comerciales de yerba mate elaborada y yerba canchada. Para el diseño de los cebadores se utilizaron las regiones ITS de I. dumosa y se estandarizaron las condiciones de amplificación, los resultados fueron chequeandos mediante secuenciación. La sensibilidad del método fue de 93,3% y la especificidad de 100%, con un límite de detección de 1% p/p. La técnica fue validada a través del análisis de muestras comerciales y artificialmente adulteradas, sin encontrarse rastros del contaminante en ninguno de los paquetes comerciales testeados.

Palabras clave: Ilex dumosa; Regiones ITS; DNA ribosómico; Detección molecular.

Abstract

In Misiones two species of genus Ilex prevail: I. paraguariensis and I. dumosa, but only the first one should be used to manufacture yerba mate products. I. dumosa is frequently used in mixtures with I. paraguariensis, although amounts above 1% are considered adulterants. From the technological perspective, it is feasible to differentiate them through the use of molecular markers such as ITS regions of ribosomal DNA. The aim of this work was to optimize a molecular technique to detect I. dumosa in yerba mate packages when it could be found as adulterant. Fresh leaves and thirteen trademarks of yerba mate and yerba canchada were used for the experience. For primers design ITS regions of I. dumosa were used and amplification conditions were standardized and products were sequenced. The technique sensitivity and specificity were 93.3% and 100% respectively, with a detection limit of 1% w / w. The technique was validated through the analysis of commercial and artificially adulterated samples and no traces of I. dumosa were detected in all commercial packages tested.

Key words: Ilex dumosa; ITS regions; Ribosomal DNA; Molecular detection.

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Introducción

América del Sur es considerada una de las regiones de mayor diversidad para el género Ilex L., habiéndose descripto 12 especies para este continente ^{[1, 2]}, de las cuales únicamente una de ellas es aceptada como "yerba mate" por el Código Alimentario Argentino: I. paraguariensis A. St. Hil.^[3]
Originalmente la yerba mate fue utilizada por los guaraníes en Argentina, Brasil y Paraguay, existiendo evidencias de los primeros cultivos durante los siglos XVII y XVIII [4]. En la actualidad su consumo como infusión se ha difundido ampliamente, transformándose en una arraigada costumbre para millones de personas de todos los niveles socio-económicos de los mencionados países sudamericanos y de algunos países árabes en los que fue introducida (según informe del Ministerio de Economía y Finanzas Públicas, accesible en http://www.mecon.gov.ar/peconomica/docs/Complejo_Yerbatero.pdf). Sin embargo, el cultivo de la yerba mate se ha desarrollado exclusivamente en la zona comprendida por el sur de Paraguay, sur de Brasil y NE de la Argentina, específicamente en la provincia de Misiones y el noreste de la provincia de Corrientes ^[5]. En la provincia de Misiones predominan dos especies: I. praguariensis e I. dumosa Reissek. I. paraguariensis es blanco de numerosos estudios respecto a su composición y comportamiento ante ciertas condiciones debido a la gran importancia socioeconómica que tiene su principal producto: la yerba mate. I. dumosa es frecuentemente utilizada en mezclas con I. paraguariensis, aunque en bajas proporciones como parte de yerba mate compuesta. Según el Artículo 1193 - (Res Conj. SPRyRS y SAGyPA N° 41/2006 y N° 641/2006) del Código Alimentario Argentino se establece que "... Con la denominación de Yerba Mate o Yerba se entiende el producto formado por las hojas desecadas, ligeramente tostadas y desmenuzadas, de Ilex paraguariensis Saint Hilaire (Aquifoliácea) exclusivamente, mezcladas o no con fragmentos de ramas secas jóvenes, pecíolos y pedúnculos florales". Además el artículo 1195 remarca que no podrá contener más del 1% de sustancias vegetales extrañas. Por lo tanto, el agregado de proporciones de I. dumosa se considera adulteración cuando supera el 1% p/p. ^[3]
Los marcadores moleculares permiten la identificación y caracterización del DNA de una especie facilitando su clasificación cuando no hay pruebas fenotípicas que se complementen, superando la mayoría de las limitaciones de los métodos tradicionales ^{[6, 7]}. Uno de los marcadores moleculares basados en DNA corresponde a regiones del RNA ribosómico (rRNA): las regiones denominadas ITS (Internal Transcribed Spacer) ^{[8, 9, 10]}. La zona de los ITS son regiones no codificantes e hipervariables del rDNA y permiten el reconocimiento a nivel interespecífico, mientras que las regiones codificantes correspondientes con los rRNA 18S, 5,8S y 28S son conservadas y muestran una baja variabilidad intraespecífica ^[11].
El objetivo de este trabajo fue utilizar una porción de la región ITS-2 y del gen 5.8S que forman parte del DNA ribosomal para diseñar una técnica molecular que permita detectar I. dumosa en proporciones superiores al 1% p/p para la detección de este adulterante en paquetes de yerba mate.

Materiales y métodos

Muestras

Se trabajó con dos tipos de muestras: hojas frescas de Ilex dumosa e Ilex paraguariensis y yerba mate elaborada procedente del producto comercial disponible en góndolas. Como control libre de I. dumosa se utilizó yerba mate elaborada procedente del molino de la empresa "Las Marías".
Las muestras de I. dumosa correspondieron a hojas jóvenes de 15 individuos recolectados de la colección YM 55/94 (Tabla 1) de la Estación Experimental del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria Cerro Azul (INTAEEA Cerro Azul), eligiéndose hojas sanas sin daño ni contaminación aparente con microorganismos.

Tabla 1: Colección YM 55/94 perteneciente al INTA Cerro Azul. Muestras de I. dumosa empleadas en el trabajo.

Las muestras de hojas frescas de I. paraguariensis correspondieron al cultivar inscripto 1/74 hembra y 8/74 macho, cuyo origen fue una plantación ya inexistente de dicha especie perteneciente al INTA- EEA- Cerro Azul.

Extracción de DNA

Para la extracción del ADN genómico se realizaron algunas modificaciones al protocolo estandarizado por Doyle and Doyle 1987 ^[12]. Las muestras fueron molidas con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino que fue depositado en un microtubo. Posteriormente fueron digeridas 90 min a 60ºC con bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) 2% y Proteinasa K 0,1 mg/mL en presencia de b-mercaptoetanol utilizándose una solución buffer que contenía Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 50 mM y NaCl 1,5 M. Las muestras fueron agitadas cada 20 min y al final de la digestión fueron centrifugadas y purificadas con cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) y acetato de potasio 3 M para eliminar lípidos y proteínas contaminantes. Finalmente el DNA fue precipitado con etanol absoluto, lavado con etanol 70%, resuspendido en agua libre de nucleasas y almacenado a -20ºC hasta su utilización. La calidad del DNA obtenido se evaluó mediante técnicas espectrofotométrica y electroforética.

Diseño y análisis bioinformático de los cebadores

Los cebadores fueron diseñados para el reconocimiento específico de I. dumosa. Para el diseño de los cebadores se utilizaron las secuencias correspondientes a DNA ribosomal, que incluya la región utilizada en este trabajo, de seis especies distintas de Ilex disponibles en GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov): I. paraguariensis (EU796897.1; AY183491.1; AY183492.1; EF590778.1; FJ394705.1; AJ492656.1), I. dumosa (AJ492657.1; AY183479.1; AY183480.1; AY183481.1; AY183488.1; AY183489.1), I. argentina (AJ492655.1; AY183482.1; AY183483.1; FJ394659.1), I. microdonta (AY183485.1; AY183484.1; AJ492665.1), I. taubertiana (AY183487.1), I. theezans (FJ394716.1; AY183498.1; AY183497.1; AY183493.1; AJ492666.1; FJ394716.1; AY183498.1), I. brasiliensis (AY183497.1; AY183493.1; AJ492666.1). Todas las secuencias específicas fueron alineadas mediante el programa Clustal X 1.83 y se seleccionaron regiones específicas para la ubicación de los cebadores ^{[13, 14, 15]}. Para finalizar se realizó el diseño de los cebadores con el programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) ^[16].
Posteriormente los cebadores fueron fabricados y probados en reacciones de amplificación (PCR) utilizando muestras conocidas.

Amplificación

Las reacciones de amplificación (PCR) se realizaron con dos finalidades. Primero para ajustar las condiciones de amplificación para los cebadores diseñados, utilizando en este caso DNA que correspondía a I. dumosa (verdaderos positivos, VP). En este caso se tuvieron en cuenta las variables características de ajuste de una amplificación: temperatura de hibridación (50 y 55 ºC), concentración de MgCl₂ (1,5 y 2 mM), concentración de dNTP (200 y 100 mM), cantidad de cebadores (10 y 5) y cantidad de DNA (1 µL del DNA diluido entre 1:50 y 1:300). Mientras que se mantuvieron constantes el volumen de reacción (20 µL) y cantidad de Taq polimerasa (0,5 U/reacción). Las muestras que resultaron positivas fueron secuenciadas (Macreogen Inc., Corea del Sur) y analizadas con la herramienta BLAST disponible on-line en el NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) para confirmar la identidad del amplicón observado.
Por otro lado, la PCR optimizada como se acaba de describir (T de hibridación 50 ºC, MgCl2 2 mM, dNTP 200 mM, cebadores 10 pmol/reacción, Taq polimerasa 0,5 U/ reacción, 1 µL de DNA diluido 1:100) fue utilizada para analizar la especificidad, sensibilidad y límite de detección del método. Cálculos de sensibilidad y especificidad Para realizar los cálculos de sensibilidad y especificidad se realizaron amplificaciones con muestras provenientes de 15 individuos de las especies I. dumosa (verdaderos positivos, VP) y 2 individuos de la especie I. paraguariensis (verdaderos negativos, VN) ^{[17, 18, 19]}. Con los resultados se confeccionó una tabla de contingencia considerando como falsos positivos (FN) aquellas muestras de I. paraguariensis que producían una amplificación, y como falsos negativos (FN) aquellas muestras de I. dumosa que no producían amplificaciones de la región analizada. Estas amplificaciones se realizaron en las condiciones óptimas de amplificación estandarizadas como se describe más arriba y por triplicado para cada muestra. A partir de estos datos se calculó la sensibilidad (S) y la especificidad (E) según las ecuaciones que se detallan a continuación:

S = VP/ (VP + FN)
E = VN/ (VN + FP)

Determinación del límite de detección

Para la determinación del límite de detección se trabajó con muestras de yerba canchada de I. paraguariensis y de I. dumosa cedidas por Establecimiento Las Marías (sometidas al proceso general de elaboración de la yerba que incluye zapecado y secado). Previo a la extracción de DNA, la muestra fue adulterada mediante la mezcla en un mortero de madera en las proporciones que se muestran en la Tabla 2. Posteriormente la extracción de DNA se realizó sobre 0,2 g de muestra procesándose cada muestra por triplicado. Cada muestra procesada por triplicado utilizando las condiciones que resultaron de la optimización y los resultados de la amplificación analizados por electroforesis en geles de agarosa al 2% en TBE.

Tabla 2: Proporciones de I. paraguariensis e I. dumosa utilizadas para la determinación del límite de detección

Se tomó como límite de detección la menor cantidad de I. dumosa expresada en % p/p que resulta positiva al ser amplificada.

Resultados

De acuerdo a los objetivos del trabajo, primeramente se procedió al diseño de la técnica para posteriormente validarla con muestras comerciales. Diseño de cebadores específicos para I. dumosa Durante la localización de la posición más adecuada para ubicar los cebadores específicos se identificó una secuencia común a ambas especies ubicada sobre la secuencia del DNA ribosómico 5,8S en la posición 317-346, donde se ubicó el cebador sentido (Fw). Por otro lado se identificó una posición específica para I. dumosa en la región ITS-2 comprendida entre 622 y 642 en donde se posicionó el cebador antisentido (Rv) específico. (Figura 1 y Tabla 3).

Figura 1: Región utilizada para el diseño de cebadores. Se indican las secuencias y la posición relativa de los cebadores utilizados. rDNA: DNA ribosómico. ITS: secuencia transcripta interna. IGS: región intergénica. TIS: región de inicio de la transcripción. Cebador Fw: cebador sentido. Cebador Rv: cebador reverso.

 

Tabla 3: Cebadores diseñados para la amplificación de I. dumosa

5' Compl: complementariedad entre extremos 5'.
3' Compl: complementariedad entre extremos 3'.

Ajuste del método y ensayo de especificidad para I. dumosa

Para amplificar la región ITS2 de I. dumosa se ensayaron 4 diluciones (1:50, 1:100, 1:200 y 1:300), de las cuales las mayores resultaron ser más convenientes, probablemente debido a la dilución de contaminantes que resultan inhibitorias al proceso de amplificación. (Figura 2)

Figura 2: Optimización de las cantidades de DNA. Se muestra un gel de agarosa 2% teñido con bromuro de etidio que indica las distintas diluciones testeadas en la amplificación de la región ITS2 de I. dumosa. C-: control negativo. M: marcador de peso molecular 100 pb ladder.

Estos resultados fueron apoyados por los datos espectrofotométricos que indican un incremento de la relación A260/A280, evidenciando mayor pureza.
Para la comprobación de la identidad de los amplicones logrados se procedió a su secuenciación y análisis con la herramienta BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), encontrándose identidad con I. dumosa en más del 99% y arrojando un de e-value altamente significativo (2x10-120) ^[14].

Cálculo de sensibilidad y especificidad del método

Para corroborar la especificidad y sensibilidad del método se analizaron muestras de I. dumosa e I. paraguariensis caracterizadas botánicamente por el INTA-EEA Cerro Azul. En las figuras 3 y 4 se pueden ver las amplificaciones de los individuos utilizados.

Figura 3: Amplificación de DNA proveniente de plantas seleccionadas en el INTA-EEA Cerro Azul. Se muestra un gel de agarosa 2% teñido con bromuro de etidio. Sobre las calles se indica el número de muestra a la que corresponde la amplificación. Las muestras fueron procesadas por triplicado. C-: control negativo. M: marcador de peso molecular 100 pb ladder.

 

Figura 4: Amplificación de DNA proveniente de plantas seleccionadas en el INTA-EEA Cerro Azul (continuación). Se muestra un gel de agarosa 2% teñido con bromuro de etidio. Sobre las calles se indica el número de muestra a la que corresponde la amplificación. Las muestras fueron procesadas por triplicado. M: marcador de peso molecular 100 pb ladder.

Estos resultados se resumen en la tabla de contingencia (Tabla 4) a partir de la cual se calcularon los valores de sensibilidad y especificidad del método. Como cada PCR se realizó por triplicado, se consideró positiva si una de las 3 amplificaciones resultaba positiva.

Tabla 4: Tabla de contingencia 2x2 para el cálculo de especificidad y sensibilidad.

De acuerdo a estos datos los valores de sensibilidad (S) y especificidad (E) fueron:

S = 14/(14 + 1) = 0,933 E = 2 / (2 + 0) = 1

Determinación del límite de sensibilidad

La menor cantidad de I. dumosa que el método detectó fue de 1% p/p. (Figura 5). Ensayos de validación Para los ensayos de validación del método se utilizaron muestras de yerba mate procesada que fueron seleccionadas a partir de material en góndola ubicado en diversos comercios de la Ciudad de Posadas, Provincia de Misiones y se resumen en la tabla 5.

Figura 5: Amplificación de DNA proveniente de muestras de yerba mate adulterada con I. dumosa en una proporción de 1% p/p. Se muestra un gel de agarosa 2% teñido con bromuro de etidio. Las calles 2 a 4 y 6 a 7 corresponden a dos muestras adulteradas con 1% p/p, procesada independientemente y amplificadas por triplicado. C-: control negativo. M: marcador de peso molecular 100 pb ladder. Las calles 9 y 10 corresponden a los controles - y + utilizados en el experimento de validación.

Tabla 5: Muestras de yerba mate comercial y controles utilizados para la validación del método

Como control libre de adulterantes (control negativo) se utilizó una muestra procedente del molino del establecimiento "Las Marías" en donde se realizó una molienda exclusiva con material vegetal seleccionado de I. paraguariensis luego de someterse al proceso general de elaboración de la yerba que incluyó zapecado y secado. Como control positivo se utilizó una de las muestras adulteradas que contenía 1% de I. dumosa. (Figura 5)

Discusión

Para diferenciar una especie por medio de herramientas moleculares, es importante hallar una secuencia del genoma que sea específica para dicha especie y no presente una alta tasa de mutaciones. La utilización de las regiones ITS como marcadores moleculares, es particularmente útil para estos fines, pero su utilidad está condicionada al hallazgo de un SNP específico para la especie, que permita el diseño de una estrategia molecular que la distinga de otras especies. El método optimizado en el presente trabajo utiliza una posición específica perteneciente a la región ITS-2, que no muestra amplificación cruzada con I. paraguariensis, favoreciendo el diseño de una reacción de amplificación específica de secuencia. Sin embargo, desde el punto de vista molecular debería testearse contra otras especies del mismo género, particularmente las que crecen en la misma región cultivada, para aportar mayor valor como marcador selectivo entre algunas especies de Ilex, y de esta manera su utilidad en muestras adulteradas. ^[21]
Desde el punto de vista bromatológico, el Código Alimentario Argentino da lugar únicamente a la especie Ilex paraguariensis Saint Hilaire (Aquifoliaceae) como componente de la yerba mate, considerando a las demás especies del género Ilex, así como a otras especies botánicas, como adulterantes si aparecen en proporciones mayores al 1% p/p, o no han sido declaradas como yerba compuesta (Artículos 1193 y 1195 del Código Alimentario Argentino) ^[3]. Por lo tanto, contar con métodos para la identificación y reconocimiento de estas adulteraciones es fundamental. I. dumosa actualmente está siendo analizada por los beneficios que tendría respecto a la yerba mate, ya que contiene concentraciones muy bajas de cafeína ^[22], aunque también se han identificado variedades de la misma I. paraguariensis con estas mismas propiedades. Este es uno de los motivos por los que podría incrementarse el numero de adulteraciones de yerba mate con I. dumosa y sienta las bases para contar con un método que identifique esta especie botánica en particular como adulterante. En este trabajo se ha optimizado un método molecular para reconocer adulteraciones de yerba mate con I. dumosa, que adopta como criterio tomar como positiva una muestra que arroja al menos una amplificación positiva de tres realizadas, lo cual representa una posición conservadora hacia el consumidor con una baja tolerancia de la situación de adulteración. Además, se trata de un método que muestra volares óptimos de sensibilidad y especificidad ^{[23, 24]}. Al poseer una especificidad del 100% permite afirmar que no se han observado falsos positivos por lo que es un método confirmatorio ^{[19, 24]}, y acompañando eso, el límite de detección de 1% p/p es justamente el mismo que establece el Código Alimentario Argentino, por lo que su transferencia al sector analítico bromatológico es ideal.
El último punto que debe tenerse en cuenta es la relación de costo del método y su aplicabilidad. En este sentido, la relación de costo esta comandada por la disponibilidad del equipamiento para la realización del método y que actualmente se ofrece de manera cada vez más amplia en el mercado. Por otro lado, el costo en insumos y reactivos para un determinación de este tipo, considerando los estudios por triplicado y los controles positivos y negativos no supera los U$S 20, quedando únicamente a consideración el costo en RRHH. Actualmente existe una fuerte tendencia a la formación en este campo, la biología molecular, por lo que los nuevos profesionales tienen la formación de base para realizar este tipo de técnicas, restando únicamente un impulso gubernamental y legal para su implementación.
En conclusión, este trabajo aporta un nuevo método molecular basado en una técnica de PCR alelo específica que permite distinguir con una alta sensibilidad y especificidad la presencia de I. dumosa frente a I. paraguariensis en muestras de yerba mate elaborada cuando se encuentra en cantidades superiores a 1% p/p.

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Recibido: 30/07/2012
Aprobado: 05/02/2013