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INTRODUCCION
Las orquídeas son monocotiledóneas pertenecientes a la familia Orchidaceae, clasificadas en más de 700 géneros que incluyen unas 25.000 especies. Son plantas cosmopolitas que crecen principalmente en los trópicos y subtrópicos, aunque existen especies que se desarrollan en zonas templadas y frías (Freuler, 2007). Al igual que la mayoría de las plantas, las orquídeas se reproducen de forma sexual y asexual. La reproducción sexual garantiza una mayor diversidad genética y, por ende, fenotípica. Sin embargo, la principal forma de reproducción utilizada por coleccionistas y comerciantes es la asexual, en la cual la nueva planta se obtiene a partir de fracciones de la planta madre favoreciendo así la propagación y diseminación de enfermedades, especialmente las de etiología viral (Zettler, Ko, Wisler, Elliott y Wong, 1990; Hartmann y Kester, 1991). Las orquídeas pueden ser multiplicadas a gran escala mediante técnicas de micropropagación originando clones perfectos de la planta original (planta madre) (Arditti y Ernst, 1993). La propagación de meristemas es un método muy útil para la multiplicación masiva de variedades de calidad destacada y especialmente de híbridos, pero requiere de material madre de excelente calidad sanitaria.
En el mundo se han reportado varios virus que afectan diferentes géneros de orquídeas. Entre ellos, Cymbidium mosaic virus (CymMV) y Odontoglossum ringspot virus (ORSV) son los patógenos más relevantes desde el punto de vista económico debido a los daños que ocasionan y a la elevada prevalencia e incidencia que tienen a nivel mundial (Zettler et al., 1990). Ambos virus se transmiten de una planta infectada a otra sana por contacto mecánico y su dispersión se ve favorecida por la propagación agámica de estas especies (Wong, Chng, Lee, Tan y Zettler, 1994; Rani, Pant y Jain, 2010; Pradhan, Regmi, Ranjit y Pant, 2016). Hasta la fecha no se ha demostrado su transmisión a través de semillas y no se conocen
insectos vectores de estos patógenos.
En el año 2010 en Argentina se reportaron por primera vez ambos virus en orquídeas del género Oncidium producidas bajo cubierta en la provincia de Buenos Aires (Cánovas, Ballari y Nome, 2016). CymMV pertenece al género Potexvirus, de la familia Alphaflexiviridae; es un virus monopartito, elongado flexuoso de aproximadamente 480 nm de longitud (Lefkowitz, et al., 2018). Dependiendo del género de orquídea, el CymMV ocasiona síntomas sistémicos de mosaico suave, manchas y estrías en hojas y flores, amarillamiento y caída de hojas (Pearson y Cole, 1986; Pant, Das, Pun, Ramachandran y Medhi, 2010). El ORSV, pertenece al género Tobamovirus, de la familia Virgaviridae; los viriones son elongados rígidos, con forma de bastón de aproximadamente 300 nm de largo (Lefkowitz et al., 2018). Los síntomas característicos de este virus son puntos necróticos en las hojas y estrías coloreadas en las flores. Las plantas infectadas presentan disminución del número y tamaño de escapos florales y flores, las cuales a su vez pueden manifestar deformaciones morfológicas (Hu, Ferreira, Wang y Xu, 1993; Zheng, Shen, Chen y Jan, 2010). Las coinfecciones con ambos virus resultan frecuentes; en este caso los síntomas observados son amarronamiento, estrías de color marrón y necrosis en flores, acompañados de pérdida de vigor en las plantas (Tanaka, Nishii, Ito, Kameya-Iwaki y Sommartya, 1997). Existen ocasiones en que plantas aparentemente sanas están infectadas con estos virus, por lo que la simple evaluación visual de síntomas no es un método confiable para determinar la condición sanitaria de las orquídeas (Zettler et al., 1990).
En los sistemas de cultivos intensivos y/o semi- intensivos la forma más práctica de reducir los daños ocasionados por este virus consiste en la detección temprana y eliminación de las plantas infectadas a fin de asegurar la producción de material vegetal sano. A nivel comercial existen varios métodos para diagnosticar estas virosis, pero no son económicos ni se encuentran fácilmente disponibles para la mayoría de los floricultores. Este hecho favorece la multiplicación y comercialización de material infectado que luego impacta de manera negativa en las economías e industrias floricultoras de nuestra región.
Con la finalidad de promover la producción, multiplicación y comercialización de orquídeas de sanidad controlada, el objetivo del presente trabajo fue producir un antisuero policlonal para ser utilizado en el desarrollo de técnicas serológicas que permitan la detección de CymMV y ORSV.
MATERIALES Y MÉTODOS
Purificación viral
Se maceraron 70 g de hojas de Nicotiana glutinosa L. coinfectadas con CymMV y ORSV en 350 ml de tampón fosfato de sodio (Na3PO4 0,1 M pH 7,4), más el agregado de 200 pl de ácido tioglicólico, 0,05 g de DIECA, 2,1 g de sulfito de sodio y 350 ml de cloroformo. El homogenato se filtró y clarificó a 4355 g durante 20 min. La fase acuosa se sembró en colchones de sacarosa al 20 % en tampón fosfato de sodio y se centrifugaron a 113 000 g por 1 h 30 min. Los pellets se resuspendieron en 1 ml del mismo tampón y se sembraron en un gradiente de cloruro de cesio fraccionado 10 % - 40 % en tampón fosfato 0,04 M pH 7. El gradiente se centrifugó durante 3 h 30 min a 82 700 g. Se seleccionaron dos fracciones: la fracción A (FA) correspondiente a ORSV y la fracción B (FB) correspondiente a CymMV. Cada fracción se diluyó 1:10 en tampón fosfato y se centrifugó a 113 000 g durante 1 h para eliminar el cloruro de cesio. Los pellets se resuspendieron en 200 pl de tampón fosfato y se midió la concentración viral mediante espectrofotometría. El grado de pureza de los productos finales fue analizado al microscopio electrónico de transmisión (MET) JEOL 1200 (Jeol, Tokyo, Japan) mediante preparaciones rápidas según protocolo descripto por Kitajima y Nome, 1999.
Inmunización y obtención de antisueros
Las fracciones seleccionadas (FA y FB) se inyectaron de manera independiente a dos conejos machos californianos vía intramuscular. Inicialmente se inocularon 90 pg de la FA y 125 pg de la FB, con el agregado de coadyuvante de Freud completo (1:1 v/v) en un volumen final de 1 ml. A los 24 días se aplicó un refuerzo del restante de la purificación, 30 pg de la FA y 60 pg de la FB en mezcla 1:1 v/v con coadyuvante de Freud incompleto. Se realizaron sangrías a los 14, 31 y 41 días después de la primera inoculación (dpi). Cada una de las sangrías fue inicialmente incubada a 37 °C durante 1 h y luego 1 h a 4 °C. Posteriormente, se obtuvieron las fracciones séricas mediante centrifugación a 3024 g durante 5 min.
Titulación de antisueros
El título de cada antisuero (As) se evaluó mediante diluciones seriadas de las diferentes fracciones séricas en pruebas de NC-ELISA (Parent,
Berlanger, Desjardins y Brisson, 1985) 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000 en tampón antisuero [TBS (0,02 M Tris-HCl; 0,15 M NaCl; pH 7,4) + 2 % de leche descremada en polvo]. Sobre una membrana de nitrocelulosa (BIO-RAD, California, USA) se adsorbieron 5 pl de cada purificación viral de manera independiente y combinada (FA, FB y FA+FB) y 5 pl de orquídeas y nicotianas asintomáticas maceradas 1:10 p/v en TBS + 0.05 % Tween 20 + 0,01 M DIECA + 0,02 % NaN3. Las membranas fueron incubadas con los As primarios (diluciones seriadas) y un As secundario de IgG de cabra anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina (BIO-RAD, California, USA) diluido 1:3000 en tampón antisuero. Las membranas se revelaron en una solución de sustrato (tetrazolium nitroazul y fosfato bromocloroindolil, SIGMA) y agua destilada. La aparición de color púrpura fue considerada como muestra positiva.
Purificación de gammaglobulinas y calibración de la técnica de Double antibody sandwich- enzyme-linked immunosorbent assay (DAS- ELISA)
El As seleccionado se mezcló con igual volumen de sulfato de amonio saturado. La mezcla se dejó en agitación 1 h a temperatura ambiente y se centrifugó a 15 300 g por 15 min. Luego, se colocó en una columna DEAE Sephacel y se dializó con tampón fosfato salino 0,5X [PBS (1 mM KH2PO4; 8 mM Na2HPO4; 0,13 M NaCl; 3 mM KCl) + 0,02 % NaN3, pH 6,8]. Se recogieron 10 fracciones de 1 ml cada una y se determinó la concentración de inmunoglobulinas (Igs) mediante lectura en espectrofotómetro a 280 nm. Se seleccionaron las fracciones que presentaron los dos valores de absorbancia más altos. La fracción de mayor absorbancia se conjugó con la enzima fosfatasa alcalina, y la segunda se utilizó como Ig. Los anticuerpos anti CymMV+ORSV purificados se conjugaron con fosfatasa alcalina utilizando una solución de glutaraldehido al 1 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.). La preparación se mantuvo durante 4 h a temperatura ambiente y se dializó tres veces con PBS 1X para eliminar residuos de glutaraldehido. La reacción se bloqueó con el agregado de 0,05 % de albúmina de suero bovino y se adicionó 0,01 % de NaN3 para su conservación.
Con el fin de calibrar la técnica de DAS-ELISA, las Igs e Igs conjugadas con fosfatasa alcalina se diluyeron 1:500, 1:1000, 1:1500 y 1:2000 en PBS, siguiendo el protocolo descripto por Clark y Adams, 1977. En cada placa de ELISA se colocaron purificaciones virales de plantas de orquídeas como controles positivos y nicotianas asintomáticas como controles negativos. Aproximadamente 0,1 g de tejido vegetal se trituró en tampón de extracción (PBS + 0.05 % Tween 20 + 2 % PVP-40.000, pH 6.8) en una dilución 1:5 p/v, y se sembraron 100pl de cada macerado por celda. Las placas se incubaron toda la noche a 4 °C antes de agregar la IgG-anti ORSV+CyMV conjugada. Los valores de absorbancia a 405 nm fueron determinados en un lector de ELISA (Dynex MRX II) a intervalos de 20 min después de la adición de p-nitrofenilfosfato como sustrato.
Una vez determinada la dilución de empleo de la Ig e Ig-fosfatasa alcalina para la técnica de DAS- ELISA, se evaluaron 45 ejemplares tomados en diferentes invernaderos de Córdoba Capital. Las muestras consistieron de material vegetal (hojas y flores) provenientes de orquídeas que manifestaban síntomas característicos de infección viral (Figura 1), cada especímen se evaluó por duplicado. Los estudios incluyeron especies pertenecientes a los géneros Cattleya, Cymbiduim, Dendrobium, Oncidium y Phaleanopsis. Las lecturas con valores de absorbancia mayores a dos veces la media de los controles sanos fueron consideradas positivas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El protocolo utilizado para purificar partículas virales mediante ultracentrifugación en gradiente de cesio permitió concentrar los viriones en dos bandas o fracciones bien definidas, denominadas FA y FB. Los valores de absorbancia obtenidos por espectrofotometría fueron de 0,18 pg ml-1 y 0,25 pg ml-1 para FA y FB, respectivamente, indicando la presencia de partículas virales en cada una de ellas. El análisis al MET (Figura 2) mostró que la FA presentó mayor cantidad de partículas rígidas de unos 300 nm de longitud correspondientes al ORSV, y escasas partículas virales flexuosas correspondientes a CymMV. La FB presentó mayor concentración de partículas flexuosas de unos 480 nm de longitud características del CymMV, y partículas aisladas rígidas de unos 300 nm de longitud correspondientes al ORSV.
Ambas fracciones fueron inoculadas de manera independiente a dos conejos y a partir de la titulación de las diferentes fracciones séricas obtenidas se seleccionó como As la sangría correspondiente a los 41 dpi del conejo inyectado con la FA. Dicho As presentó alto título (dilución 1:10000) para la detección de ambos patógenos simultáneamente sin mostrar reacción con los testigos asintomáticos (Figura 3). El As presentó reacción positiva con ambas purificaciones virales
Figura 1: Orquídeas positivas por DAS-ELISA para CymMV y/o ORSV, manifestando (A) amarronamiento de las flores, (B) manchas puntiformes de color negro en flores, (C) manchas cloróticas y estrías necróticas en hojas y (D) puntos necróticos en las hojas.
(CymMV y ORSV) y con plantas de orquídeas que presentaban infección mixta. Esto se debió a que la FA inyectada al conejo contenía partículas pertenecientes a ambas especies virales. En contraste, aquellas orquídeas que se utilizaron como testigos enfermos para ORSV no reaccionaron con el As debido posiblemente a una baja concentración del virus ya que las plantas no manifestaban síntomas al momento de realizar las pruebas.
El As se utilizó para la detección de los patógenos mediante la técnica de DAS-ELISA. Las diluciones de uso seleccionadas fueron 1:500 tanto para la IgG-anti ORSV+CyMV como para la IgG-anti ORSV+CyMV conjugada con fosfatasa alcalina, ya que esta combinación presentó la mayor diferencia entre los valores de absorbancia de los testigos asintomáticos y los testigos enfermos. La técnica se puso a prueba a través de un estudio prospectivo llevado a cabo en agosto de 2018 en cuatro establecimientos comerciales de Córdoba Capital, Argentina. Aproximadamente el 22 % de las muestras reaccionaron contra los anticuerpos policlonales para CymMV+ORSV, mientras que un total de 35 muestras resultaron negativas en las pruebas de DAS-ELISA (Tabla 1). Los análisis serológicos negativos podrían deberse a la época escogida para el muestreo puesto que las bajas temperaturas no favorecen la multiplicación de los virus en las plantas (Kassanis, 1957; Obrepalska- Steplowska et al, 2016). Otro motivo podría atribuirse a que los síntomas estuviesen asociados a otros factores como deficiencias nutricionales, fitotoxicidad, nemátodos u otras enfermedades causadas por hongos o bacterias (Simone y Burnett, 2002). Freitas-Astua, Rezende y Kitajima (1999), señalaron la dificultad de identificar infecciones virales en orquídeas basados solo en la observación de síntomas.
Figura 2: Preparados de fracciones recuperadas de purificación viral. (A) FA: las flechas negras indican partículas virales rígidas correspondientes a ORSV y las flechas blancas señalan partículas virales flexuosas de CymMV. (B) FB: las flechas blancas muestran partículas virales características de CymMV y las flechas negras señalan partículas virales pertenecientes a ORSV.
Figura 3 Detección de CymMV y ORSV por NC-ELISA utilizando la fracción sérica correspondiente a los 41 dpi con la FA. A1 y B6, tampón; A2 y B4, nicotianas infectadas con CymMV+ORSV; A3 y B5, orquídeas infectadas con ORSV; A4, FB (purificación de CymMV); A5 y B1, nicotianas sanas; A6 y B2, orquídeas sanas; B3, FA (purificación de ORSV).
Tabla 1: Cantidad de muestras de diferentes géneros de orquídeas recolectadas en viveros de la ciudad de Córdoba y analizadas por DAS-ELISA, utilizando anticuerpos policlonales para CymMV+ORSV
Vivero
La ocurrencia de las virosis fue determinada en tres de los establecimientos relevados lo que indica una alta prevalencia de estos patógenos en los centros comerciales de la ciudad (Tabla 1). Este constituye el primer reporte de estas virosis en plantas de orquídea en la provincia de Córdoba, y es un indicador del tráfico de material infectado en nuestro país.
Los estudios realizados muestran que los reactivos serológicos desarrollados pueden emplearse en las pruebas de NC-ELISA y DAS- ELISA, pudiendo explorarse su aplicación en otras variantes de ELISA, otras técnicas serológicas como Dot immuno binding assay (DIBA), Rapid immuno filter paper assay (RIPA) y Tissue blot immuno assay (TBIA), e incluso en técnicas de immuno electro microscopía (IEM) (Pant et al., 2013).
CONCLUSIONES
Se desarrollaron reactivos serológicos para el diagnóstico de CymMV y ORSV, los dos virus más importantes que infectan plantas de la familia Orchidaceae. La capacidad de estos reactivos para identificar CymMV, ORSV o infecciones mixtas en las plantas, permite realizar los análisis de manera más rápida y económica lo que representa una ventaja para detecciones a gran escala. Además, las herramientas de diagnóstico desarrolladas en este trabajo podrán ser utilizadas en futuras investigaciones, tendientes a promover la producción, multiplicación y/o comercialización de orquídeas libres de CymMV y ORSV, tanto en la provincia de Córdoba como en el resto del territorio nacional.
