Introducción

Diferentes tratamientos han sido utilizados para sincronizar los celos; la mayoría de ellos incluyen la administración de progesterona en combinación con un agente luteolítico y sales de estradiol, que permiten regular la dinámica folicular y el momento en que ocurren las ovulaciones¹⁴. A este tratamiento de sincronización se lo utiliza en animales cíclicos⁶, como también en animales en anestro⁹.

En el mercado existen dispositivos que contienen diferentes cantidades de progesterona³. Así, se diseñó un experimento para caracterizar los niveles plasmáticos de progesterona utilizando el Cue-Mate (1,56 g progesterona, Bioniche Animal Health Canada Inc), CIDR (1,9 o 1,38 g progesterona; Pfizer Animal Health, USA) o DIB (1 g progesterona, Syntex SA, Argentina).

No se observaron diferencias en las concentraciones plasmáticas de dicha hormona durante un tratamiento de 7 días de duración. No obstante, el tratamiento con DIB o 1,38 g de progesterona generó el nivel más bajo de progesterona plasmática en un período de 21 días, lo cual indica que los dispositivos con mayor cantidad de progesterona liberan dicha hormona durante un lapso de tiempo más prolongado²².

En Argentina y Brasil, existen dispositivos con contenidos de progesterona inferiores a 1 g. En consecuencia, el presente trabajo tuvo por objetivo comparar el efecto de dispositivos con diferentes cantidades de progesterona sobre el nivel plasmático de dicha hormona, la dinámica folicular y la tasa de ovulación.

La administración de benzoato de estradiol al finalizar el tratamiento con progesterona podría inducir esto sin ovulación; a esto se lo ha asociado con la presencia de folículos pequeños⁶. Sin embargo, en otros casos, el estrés de los animales que se podría generar por las prácticas de manejo a la que son sometidos podría ser la causa de falta de respuesta ovulatoria.

Así, investigadores observaron que vacas que fueron manejadas en condiciones de estrés tuvieron un menor porcentaje de preñez (38,2% vs 63,1%, respectivamente) ²⁷. En consecuencia, se fijó como objetivo secundario relacionar los niveles plasmáticos de cortisol con la respuesta ovulatoria.

Material y Métodos

Lugar, animales y tratamientos. El experimento se llevó a cabo en un establecimiento agropecuario ubicado en el partido de Rauch, Buenos Aires (36° S, 59° W). Se utilizaron 30 vacas secas, cíclicas Bostaurus, que se ubicaron sobre pasturas naturales. La condición corporal al inicio del experimento fue de 3,4±0,4 (escala 1 a 5; 1: emaciada y 5: obesa¹³. Los animales fueron distribuidos aleatoriamente a tres grupos que recibieron los siguientes tratamientos:

T0,558 (n=10). En el día 0 se colocó un dispositivo intravaginal con 0,558 g de progesterona (Cronipres M24, Biogénesis-Bagó, Garin, Argentina) y 2 mg de benzoato de estradiol (BE, Bioestrogen, Biogénesis- Bagó, Garin, Argentina) administrado intramuscularmente (i.m.). En el día 8 se retiró el dispositivo y se administró vía IM 0,150 mg de D-cloprostenol (Enzaprost, Biogénesis-Bagó, Garin, Argentina). En el día 9 (24 h post retiro del dispositivo), se inyectó 1 mg de BE.

T1 (n=10). Ídem tratamiento T0, 558 con la salvedad que la cantidad de progesterona fue de 1 g (Cronipres 3 usos, Biogénesis-Bagó, Garin, Argentina).

T1, 3 (n=10). Ídem tratamiento T0,558 con la salvedad de que la cantidad de progesterona fue de 1,3 g (Cronipres 3 usos + 3 camisas con 100 mg de progesterona cada una, Biogénesis-Bagó, Garin, Argentina).

Toma de muestras y mediciones hormonales. Para caracterizar los niveles de progesterona y cortisol en plasmas se tomaron muestras de sangre por punción de la vena yugular en los días 0, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 22. Dichas muestras se recogieron en tubos heparinizados y fueron centrifugados (2000 xg durante 15 minutos) dentro de la hora de extraídas. El plasma sobrenadante fue recogido y almacenado a -20°C hasta el momento de realizar las determinaciones hormonales.

Las mediciones hormonales se realizaron en el Laboratorio de Endocrinología de la Facultad de Ciencias Veterinarias (UNCPGA, Tandil, Buenos Aires). Las muestras se analizaron utilizando un kit de RIA para progeterona y cortisol (Coat Acount, Siemens Healthcare Diagnostic, USA). Los kits para progesterona²⁵ y cortisol⁷ fueron previamente validados para su uso con plasma bovino.

Para progesterona, el coeficiente de variación intra-ensayo fue menor que 7% para concentraciones de 0,1 y 40 ng/ml; mientras que el coeficiente inter-ensayo tuvo una variación menor al 3,5% y la sensibilidad del ensayo fue de 0,01 ng/ml.

Para cortisol, el coeficiente de variación intra-ensayo fue menor que 9% para concentraciones entre 1 y 50 mcg/dl, mientras que el coeficiente inter-ensayo fue menor que 5% y la sensibilidad fue de 1 mcg/dl.

Mediciones ultrasonográficas. Se revisaron los ovarios mediante un scaner de 7,5 MGHz (Sonovet 900; Medison, Korea). Se determinó el área y la localización del cuerpo lúteo; como también, el diámetro de los folículos >3 mm. Se realizaron ecografías cada 48 h entre los días 0 y 6; cada 24 h del día 6 al 9 y cada 12 h del día 9 al 12. En el día 22 se realizó una nueva ecografía.

Las mediciones descriptas precedentemente permitieron determinar la dinámica folicular ocurrida duran te el tratamiento, el área del cuerpo lúteo y el momento de la ovulación.

El día de emergencia de una nueva onda de crecimiento folicular fue definido como el momento en que el folículo dominante fue identificado retrospectivamente con un diámetro de 4 o 5 mm¹⁰. Cuando el primer folículo identificado tuvo un diámetro de 6 mm se consideró al día previo como día de la emergencia folicular.

El folículo dominante de una onda de crecimiento folicular fue definido como el primer folículo que alcanzó el tamaño más grande¹¹. En el presente estudio, el folículo dominante perteneciente a una nueva onda de crecimiento folicular fue inducido por el tratamiento con progesterona más estrógenos. Un folículo persistente fue definido cuando la dominancia de dicho folículo se extendió desde el momento de colocar el dispositivo intravaginal hasta el momento de la ovulación.

La tasa de crecimiento (mm/día) fue determinada en forma individual para cada uno de los folículos, utilizando el día como variable independiente y el diámetro como variable dependiente. Así, la tasa media de crecimiento fue calculada según lo citado en la bibliografía¹¹.

El momento de la ovulación se definió como el promedio entre la última observación del folículo dominante y el momento en que éste desapareció¹⁵. El diámetro del folículo ovulatorio fue aquel determinado previamente a su desaparición. La ovulación fue confirmada cuando se detectó un cuerpo lúteo en el lugar donde había desaparecido el folículo dominante ²⁰.

Análisis estadístico. Las variables analizadas fue­ ron sometidas al test de Kolmogorov-Smirnov para determinar normalidad de los residuos y examinadas por análisis de varianza (ANOVA), utilizando el programa estadístico SAS (PROC GLM²⁴) y sometidas al test de Bartlett (realizándose transformaciones cuando fueran necesarias), para determinar homogeneidad de varianza.

Tales variables fueron: diámetro del folículo dominante en el momento de retirar el dispositivo intravaginal, 24 h después y en el momento de la ovulación, tasa de crecimiento folicular, intervalo entre el retiro del dispositivo y la ovulación, y área del cuerpo lúteo.

Las concentraciones plasmáticas de progesterona y cortisol del día 0 al 12, y el día 22, fueron analizadas por ANOVA para medidas repetidas en el tiempo (PROC MIXED²⁴). La tasa de ovulación fue analizada utilizando el PROC CATMOD ²⁴. El modelo de análisis estadístico incluyó los efectos del tratamiento. Para el nivel de cortisol, el modelo incluyó la respuesta ovulatoria. Todos los valores fueron expresados como media ± EE.

Resultados

Dinámica folicular. Se observó el surgimiento de una nueva onda de crecimiento folicular en el 83,3% de los animales (25/30), comenzando a los 3,9±1,3 días luego de colocado el dispositivo intravaginal. El resto de los animales tuvo un folículo dominante (FD) persistente.

Los diámetros del FD en el momento de retirar el dispositivo, a las 24 h posteriores y a la ovulación, no difirieron entre tratamientos (p>0,05; Tabla 1). Sin embargo, hubo diferencias en la tasa de crecimiento del folículo ovulatorio (p<0,05; Tabla 1).

El porcentaje de vacas que ovularon (66,7%; 20 de 30, p>0,05) y el intervalo del retiro del dispositivo a la ovulación (71,4±9,9 h) no difirieron entre tratamientos. El diámetro del folículo dominante en el momento de retirar el dispositivo no difirió entre las vacas que ovularon y las que no lo hicieron (11,1±1,7 y 10,3±1,1 mm respectivamente, p>0,05).

En los tratamientos T1 y T1, 3, el 100% de las ovulaciones se produjeron de un folículo dominante surgido de una nueva onda de crecimiento folicular; no así en el T0, 558 en el que solo ocurrió en el 50% (p<0,05).

Niveles plasmáticos de progesterona y cortisol, así como área del cuerpo lúteo. No se observaron diferencias en los niveles de progesterona entre los diferentes tratamientos utilizados (p>0,05; Figura 1). En el día 0, el 93,3% de las vacas tuvieron un cuerpo lúteo, los cuales fueron similares entre tratamientos (T0, 558 g = 310,2±129,7; T1 g = 371,4±93,8 y 1,3 g = 360,9±84,5 mm2; p>0,05).

En las vacas que ovularon en el día 22, tanto el nivel de progesterona (7,2±3,8 ng/ml) como el área del cuerpo lúteo (290,8±118 mm2) no difirieron entre tratamientos (p>0,05). Aquellas vacas que no ovularon pre­ sentaron concentraciones de progesterona inferiores a 1 ng/ml.

Los niveles plasmáticos de cortisol fueron mayores en los días 8 y 9 en las vacas que no ovularon (p<0,05); siendo significativa la interacción respuesta ovulatoria por día del tratamiento (p<0,05; Figura 2).

Discusión

La emergencia de una nueva onda de crecimiento folicular fue observada en el 83,3% de las vacas coincidiendo con lo informado por la bibliografía¹, cuyos autores registraron un valor del 87,5%. El rango en que surge la nueva onda de crecimiento folicular luego de administrar benzoato, es de 3 a 6 días^4,21; siendo el promedio observado en el presente trabajo de 3,9 días.

La cantidad de progesterona utilizada en los dispositivos (desde 0,558 g hasta 1,3 g) no afectó el diámetro del folículo dominante ovulatorio ni el porcentaje de ovulación; sin embargo, cabe señalar que en aquellas vacas que recibieron 0,558 g de progesterona, el 33,3% de las ovulaciones se originaron de un folículo persistente comparado con el 14,7% y 0% para las que recibieron 1 g y 1,3 g de progesterona.

No obstante, los niveles plasmáticos de dicha hormona no difirieron entre tratamientos, lo cual hace difícil encontrar una explicación a esta observación. Futuros trabajos deberán confirmar tal hallazgo.

El porcentaje de vacas que ovularon, independientemente del tratamiento, fue del 66,7%. Este porcentaje es inferior al registrado en la literatura¹⁷. Los animales utilizados en el presente trabajo pertenecían a un rodeo comercial y fueron sometidos a manejos muy intensivos (ecografía y sangrados diarios) que podrían haber generado estrés, explicando el menor porcentaje de ovulación.

Figura 1 Niveles plasmáticos de progesterona en vacas tratadas con dispositivos intravaginales que conte nían diferentes cantidades de progesterona (P4). 

Figura 2 Niveles plasmáticos de cortisol en vacas tratadas con dispositivos intravaginales con diferentes cantidades de progesterona según ovularon o no en respuesta al tratamiento. El asterisco indica diferencias significativas (p<0,05) entre vacas que ovularon y aquéllas que no lo hicieron. 

En este sentido, se argumentó que cualquier manejo que provoque estrés en los animales genera un aumento en el nivel de glucocorticoides y podría interferir con la actividad reproductiva¹⁹. En ratas, investigadores concluyeron que bajo las condiciones en las que realizaron sus experimentos, la dexametasona podría bloquear la ovulación por inhibir la síntesis y liberación de LH, lo cual provocaría ausencia del pico preovulatorio de dicha hormona².

En el presente trabajo se observó que los animales que no ovularon tuvieron niveles de cortisol en plasma superiores a aquellos que ovularon en los días 8 (retiro del dispositivo) y 9 (administración de BE para inducir el pico preovulatorio de LH). En consecuencia, se podría hipotetizar que el aumento de cortisol en estos animales podría haber bloqueado la generación del pico de LH, paso necesario para que los animales ovulen.

Por otro lado, en la especie porcina se ha sugerido que existe una interacción entre el status social de los animales y la respuesta al estrés. Así, hay animales más sumisos que serían más sensibles, por lo cual serían más afectados por situaciones de estrés¹⁸. Otros autores han propuesto una situación similar en la especie bovina, en la cual habría relación entre el comporta­ miento individual y la respuesta al agente estresante¹². Ello explicaría porque no todas las vacas sufrieron un bloqueo de la ovulación a pesar de haber sido sometidas al mismo manejo.

Otros trabajos han estudiado la relación entre el manejo de los animales, el nivel de cortisol en plasma y la eficiencia reproductiva. Así, un investigador⁸, observó un aumento significativo en el nivel de cortisol (de 3,67 a 4,84 ng/ml; p<0,05) en novillos que fueron manejados en forma estresante (perros, picanas, etc.) comparado con aquellos en los que se tuvieron en cuenta las normas de bienestar animal. En este sentido, se ha observado cómo un manejo inadecuado de los animales afecta negativamente la proporción de hembras que quedan preñadas luego de realizar una IATF ^26,27.

El diámetro del folículo dominante en el momento de retirar el dispositivo fue ligeramente superior al obtenido por investigadores que registraron valores de 9,2±0,9 mm²³. A las 24 h posteriores el diámetro fue similar. Otros autores han informado un diámetro de 8,5 mm para vacas cíclicas¹⁶. Diferencias en el tipo de dispositivo utilizado podrían haber generado niveles de progesterona distintos, que podrían explicar las dife rencias observadas.

Otro factor que influye en el diámetro del folículo al momento de retirar el dispositivo es el tiempo de permanencia del mismo en la vagina. En el trabajo realizado por otros investigadores, los dispositivos estuvieron colocados durante 8 días²³. En el presente trabajo estuvieron un día más, lo cual hace suponer que el folículo tuvo un día más para crecer, por lo cual sería de mayor tamaño. El diámetro del FD ovulatorio fue coincidente con lo citado en la bibliografía^5,6,16,23.

Los niveles plasmáticos de progesterona observados en el presente trabajo en aquellas vacas que ovula- ron, sumado a las características ováricas (porcentaje de ovulación, intervalo de retiro del dispositivo-ovulación, diámetro del FD ovulatorio) brindan las bases fisiológicas que permiten explicar la ausencia de diferencias significativas en el porcentaje de preñez que se obtiene al utilizar dispositivos con diferentes cantidades de progesterona.

Finalmente, este trabajo muestra que hay una relación entre los niveles de cortisol (en el momento en que se estimula y debería producirse el pico preovulatorio de LH) y la respuesta ovulatoria. Esto podría ser un indicador de cómo fueron manejados los animales (situaciones de estrés). Tal hecho asume importancia al momento de decidir cómo manipular animales, ya que un mal manejo afectaría su eficiencia reproductiva.

Se concluye que los dispositivos intravaginales de 0,558 g, los de 1 g y los de 1,3 g de progesterona, generan similares niveles plasmáticos de dicha hormona y cambios ováricos. Los animales que no ovulan, tienen mayores niveles de cortisol que aquellos que sí lo hacen, pudiendo esto ser un indicador de situaciones de estrés; el cual podría afectar la eficiencia reproductiva.