Introducción

La mastitis bovina es la inflamación de las glándulas mamarias de las vacas lecheras, causadas por la invasión y destrucción de los tejidos productores de leche por microorganismos patógenos²⁴. Las bacterias responsables de causar mastitis incluyen tanto grampositivas como gramnegativas (Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae⁶. Los Staphylococcus coagulasa negativos son patógenos oportunistas que también han surgido como importantes patógenos de mastitis ²⁷.

La mastitis es una enfermedad de presentación endémica y es considerada una de las más costosas en la industria láctea. Puede presentarse de forma clínica o subclínica y las consecuencias económicas pueden estar dadas por el tratamiento, las pérdidas en la producción, el descarte temprano de animales, los cambios en la calidad de la leche y el riesgo de otras enfermedades ^13,28.

Los antimicrobianos se utilizan con frecuencia en las terapias para el control de varias bacterias que causan mastitis en las granjas lecheras ²³. Sin embargo, el tratamiento de la mastitis, así como su control, es difícil ⁽¹. La aparición de las bacterias resistentes a los antimicrobianos es una de las razones de la baja tasa de recuperación de la mastitis ¹¹.

Actualmente, la resistencia a los antimicrobianos se considera un problema de salud pública en todo el mundo ¹⁹. Las bacterias multiresistentes a las drogas están muy extendidas, debido a la presión selectiva resultante del uso extensivo de antimicrobianos (ATM) en la medicina veterinaria y humana, y debido a la adquisición de determinantes de resistencia antimicrobiana de otras bacterias¹⁶.

En Paraguay el uso de ATM en el tratamiento de la mastitis bovina no está regulado y se permite el acceso libre a los mismos, en ocasiones sin supervisión técnica, lo que se considera puede favorecer la aparición de cepas con resistencia a dichos agentes.

Resulta importante, en primer lugar, identificar las especies microbianas más prevalentes causantes de mastitis infecciosas en una zona o región de producción. En segundo lugar, identificar los niveles de resistencias a los antimicrobianos (RAM) que presentan, de tal manera a realizar un uso más efectivo y criterioso de los ATM. La RAM es una realidad en el mundo y según la OMS resulta en una de las mayores amenazas para la salud, la seguridad alimentaria y el desarrollo de los países ¹⁹.

En este sentido, en Paraguay hay pocos estudios publicados que se hayan enfocado en la RAM¹⁰, teniendo como antecedente el perfil de resistencia in vitro a ATM de cepas causantes de mastitis a nivel de establecimientos de pequeña y mediana producción, pero hasta donde se sabe no se realizó ningún estudio que abarque a establecimientos de los 3 niveles de producción (pequeño, mediano y grande) y que haya abarcado a 3 departamentos del país en donde se concentra la producción de leche proveída al área metropolitana de la gran Asunción.

El objetivo de este estudio fue identificar los microorganismos más frecuentemente aislados en leche de cuartos mamarios positivos al California Mastitis Test (CMT) y determinar el perfil de resistencia a anti­ microbianos en función al grupo o especies de agentes microbianos aislados.

Material y métodos

Lugar de estudio. Se tomaron 411 muestras de leche de la misma cantidad de vacas lecheras, cuyos cuartos dieron positivo a CMT de los departamentos Central (8 tambos, n= 224), Cordillera (6 tambos, n= 137) y Paraguarí (3 tambos, n= 50), en su mayoría de razas Holando, Jersey y cruzas Holando-Jersey. El periodo de lactación, la cantidad de leche producida, así como los sistemas de producción fueron diferentes.

Aspectos éticos. La toma de la muestra se realizó durante el ordeño de la mañana o de la tarde. Dado que no se practicaron procedimientos experimentales; no fue necesario solicitar el aval de un comité de ética. El estudio contó con el consentimiento informado de los productores para la toma de las muestras. Esta toma fue realizada por investigadores del proyecto y estudiantes de último año de la carrera de ciencias veterinarias de la Universidad Nacional de Asunción, quienes recibieron un entrenamiento previo para la realización del procedimiento de la prueba CMT, la conservación y el envío de muestras al laboratorio cumplieron los pará­ metros establecidos por el National Mastitis Council¹⁸.

Prueba de CMT. Se realizó en 1644 cuartos en producción, De los cuartos mamarios que presentaron un resultado mayor o igual a trazas, se procedió a la toma de aproximadamente 20 ml de muestra (colocados en frascos estériles), haciendo un pool cuando más de un cuarto de una misma vaca fue positivo para al CMT. Estas muestras fueron refrigeradas a 5°C y antes de las 24 horas se hicieron llegar al Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de Asunción.

Cultivo bacteriológico y tipificación bacteriana. Las muestras de leche, fueron sembradas en agar sangre, agar MacConkey y agar Tripticasa Soya, incubándose entre 18 y 24 horas. En las cajas en las que no hubo crecimiento volvieron a ser incubadas por 24 horas, posteriormente fue realizada la coloración de Gram para determinar morfología y tinción clasificándolas como cocos o bacilos Gram positivos y Gram negativos. A los cocos Gram positivos se les realizó la prueba de la catalasa, y a los negativos se les implementó la prueba de la coagulasa, clasificando los cocos como coagulasa positivos o negativos. Posteriormente, esta metodología se complementó con un sistema de identificación comercial, confirmando género y especie; de esta forma se pudo discriminar entre Staphilococcus aureus de otros estafilococos coagulasa positivos como Staphilococcus intermedius y Staphilococcus hyicus. Los cocos Gram positivos y catalasa negativos se identificaron como Streptococcus sp a los cuales se les efectuó la prueba de CAMP, hidrólisis de la esculina, hipurato e inulina y crecimiento en NaCl. A los bacilos Gram negativos se les implementó las pruebas de oxidasa, indol, triple azúcar, RM-VP, LIA, citrato y urea, para determinar género y especie¹⁵. La evaluación de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos se realizó mediante el método de dilución en placa, siguiendo las recomendaciones del National Commitee for Clinical Laboratory Standards (CLSI) ⁵. Todos los ATM se evaluaron como drogas puras con potencia conocida, los cuales se mantuvieron refrigeradas entre 4-8°C por un máximo de un mes. Los ATM ensayados fueron aquellos de uso más frecuente para diferentes enfermedades en los rebaños lecheros del país y se se­ leccionaron para las diferentes especies bacterianas de acuerdo a su espectro de acción. Las drogas utilizadas fueron: oxacilina, penicilina, eritromicina, clindamicina, cloranfenicol, tetraciclina, ampicilina, cefotaxima, gentamicina, trimetropimsulfametoxazole, rifampicina, ciprofloxacina, cefoxitin, ceftazidima, cefixima, amoxicilina, ácido clavulánico, cefepime, ceftriaxona, ácido nalidixico, imipenem, ertapenem, aztreonam, cefoprezona sulbactam, amikamicina, y cefuroxima. Para el análisis de los resultados, se consideró que cada cepa bacteriana se comportaba individualmente frente a un antimicrobiano determinado, la sensibilidad / resistencia se basó en las recomendaciones del CLSI 2013 ⁵.

Diseño metodológico. El muestreo se efectuó por conveniencia y de manera transversal de los 17 tambos de los 3 departamentos de Paraguay, utilizándose los registros de tambos del organismo oficial de salud animal (SENACSA).

Análisis estadísticos. Se realizaron mediante estadísticas descriptivas (determinación de frecuencias absoluta y relativa de los datos), utilizando el software estadístico Epiinfo 7.0, evaluando prevalencia microbiana y de resistencia antimicrobiana, así como el cruzamiento entre estas dos variables.

Resultados y Discusión

En la Tabla 1 se pudo observar que el 35,7% (102/286) de los microorganismos aislados corres­ pondieron a 3 especies de Streptococcus (S. dysgalactiae, S. mutans, S. agalactiae) y a otros Streptococcus (17/286) como S. equi, uberis, mitis, porcinus y pneumonie. El 35,3% (101/286) fueron del grupo SCN de las siguientes especies Staphylococcus epidermidis (55),

S. saprophyticus (8), S. capitis (8), S. simulans (7), S. shleiferi (6), S. lugdunensis (6), S haemolyticus (6) y S. warneri (5). Los SCP representaron el 16,4% (47/286) que correspondieron a S. aureus (28), S. hyicus (7), S. intermedius (7), S. pseudointermedius (4) y S. schleifericoagulans (1). Se aislaron en menor número: Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterococcus canis y levadura.

Los microorganismos causantes de mastistis fueron clasificados de acuerdo a su hábitat, interacción con el pezón y patogenicidad, como microorganismos contagiosos, ambientales y otros microorganismos ². En el presente estudio el más frecuente fue un microorganismo ambiental (el Streptococcus dysgalactiae), seguido por un microorganismo oportunista (S. epidermidis), siendo también frecuentes dos agentes causales de mastitis contagiosa como el S. aureus y el S. agalactiae, datos que concuerdan con otros investigadores ⁴. Cabe señalar que en la actualidad los SCN son considerados causantes de mastitis emergentes en el mundo ²².

El perfil de la resistencia a los ATM en los departamentos Central Cordillera y Paraguarí (Tabla 2) fue más frecuente en 5 de éstos. En orden decreciente fueron: tetraciclina, penicilina, sulfatrimetoprim, rifampicina y ampicilina (variando desde 35% para la tetraciclina hasta poco más de 6% para la ampicilina). También apareció resistencia en menor frecuencia a la eritromicina, clindamicina, gentamicina, oxacilina, cloranfenicol y ciprofloxacina, que en todos los casos fue inferior al 4%.

La alta resistencia a la tetraciclina observada pudo deberse a la utilización masiva de este antimicrobiano motivado por el costo asequible que presenta, que fue marcadamente inferior a lo reportado por un estudio francés (próximos a 7%) durante 10 años de evaluación, mostrando una tendencia estacionaria ³, aunque el trabajo fue realizado solo en SCP.

Sin embargo, en un reporte colombiano se encontró una alta prevalencia de resistencia a la tetraciclina (58%) en el grupo de SCN aislados por cultivo microbiológico ²². El siguiente antimicrobiano con frecuencia de resistencia importante fue la penicilina, probablemente por pertenecer al grupo de los antibióticos más utilizados en los casos de mastitis bovina ⁴.

En un estudio europeo realizado en leche de cuartos mamarios con mastitis clínica se reportaron niveles de resistencia variable de 25,1 y 29,1% ⁹, que incluso, fueron superiores a lo observado en el presente estudio, explicado probablemente por el grupo de microorganismos en que se realizó (S. aureus y SCN) ⁹. No obstante, en otro estudio realizado en Colombia en SCN aislados por cultivo microbiológico, la resistencia fue incluso mucho más elevada (61%) ²².

La resistencia de las diferentes especies microbianas a los distintos ATM se comportó de la siguiente manera: de los 10 probados para el grupo de los Streptococcus sp, en 7 de ellos se encontró resistencia (variación de 1,7 a 51,3%), con las frecuencias más altas para tetraciclina, sulfatrimetoprim y rifampicina (Tabla 3), mientras que los SCN presentaron resistencia a 8/10 antimicrobianos (variación de 2 a 29,7%), siendo las mayores resistencias a penicilina (30/101), tetraciclina (19/101) y eritromicina (5/101).

Los SCP 7/10 ATM presentaron algún grado de resistencia (rango de 2,1 a 44,7%), observándose las mayores resistencias a la penicilina (21/47) seguida de tetraciclina (17/47). El Corynebacterium sp solo fue resistente a un ATM a la sulfatrimetoprim. En el caso de las enterobacterias se probaron en 20 ATM según las sugerencias de CLSI ⁵, con resistencia a 7 de éstos, siendo la más importante la ampicilina (1 E. coli y 3 Klebsiella), seguida por la sulfatrimetoprim (2/5: 1 por cada especie bacteriana citada) y la tetraciclina (2/5: ambos para la E. coli).

En el presente estudio la resistencia a la tetraciclina de los Streptococcus fue muy alta (51,3%), concordante con los 59% de prevalencia de resistencia ATM reportada en tambos grandes de China⁷. Dentro de este grupo de especies la resistencia ATM del S. dysgalactiae más relevante fue a la tetraciclina (54,4%), incluso más alta a los 33% (de 1180 muestras reportadas en 2018 en vacas con mastitis clínica de China ²⁹).

Respecto a la resistencia de los Streptococcus sp a la penicilina y ampicilina, si bien fue baja (3,4% y 2,5%), en principio no debería existir resistencia a este antimicrobiano. En tal sentido, se ha reportado²¹ que los antimicrobianos como penicilina, amoxicilina-clavulamico, cefazolina, rifampicina, cloranfenicol y vancomicina, muestran muy buena eficacia in vitro contra el grupo de Streptococcus (S. agalactiae, S dysgalactiae, S. uberis), aislados de bovinos con mastitis subclínica, por lo que estos tipos de ATM son frecuentemente usados para el tratamiento contra S. agalactiae ⁸, aunque en el presente estudio la rifampicina evidenció un nivel de resistencia de 16,8%.

La prevalencia de la resistencia a la sulfatrimetoprim fue de 26,9%, muy inferior a lo informado por investigadores ²⁹ para las sulfonamidas (83%), aunque superior al 17% encontrado por otros¹⁷ para S. dysgalactiae aislados en un estudio. Se ha descripto una resistencia intrínseca para la mayoría de los Streptococcus a las sulfonamidas ²⁶.

Para el grupo de SCN, la resistencia a penicilina y tetraciclina (30 y 19%, respectivamente) fue importante en este estudio, que resultó inferior a lo reportado en un trabajo colombiano para la penicilina (38,9%), pero superior a los 8,3% a la tetraciclina ¹⁴. En tal estudio se reportó una mayor resistencia a la eritromicina (13,9% vs 5%) ¹⁴.

En otra investigación realizada en el mismo país se encontraron prevalencias de resistencias mucho más altas a las del presente estudio, que fueron de 61, 58 y 42% para penicilina, tetraciclina y eritromicina respectivamente ²². También se observó 3% de meticilino resistencia (oxacilina) lo que concuerda con los 3,09% hallados por otros ²⁵, aunque en un trabajo publicado recientemente no observó resistencia a la oxacilina ^14).

Dentro de los SCP el microorganismo aislado en mayor número fue el Staphylococcus aureus (28/47), en el que se observaron las mayores resistencias de 53,6 y 50% a la penicilina y tetraciclina respectivamente. Algunos estudios^14,25 mostraron una menor resistencia a la penicilina (23,1% y 33,85%), no obstante en otros trabajos se reportó un mayor valor de resistencia (66%) ⁷.

Para la tetraciclina también se reportan menores niveles de resistencia a ATM como 18,5% ¹⁴ y 18% ⁷. Se observó un caso (3,6%) de meticilino resistencia a cefoxitina, que fue similar a los 4,6% reportados por otros¹⁴ para la misma droga, e igual número de resistencia para eritromicina y clindamicina (1/28) en este trabajo, que fue mucho menor a la resistencia reportada por otros¹⁴ para estos dos antimicrobianos (15,4% en ambos ATM).

La resistencia a Corynebacterium sp solo se evidenció para sulfatrimetoprim (5/12), no habiendo resistencia a penicilina ni tetraciclina, lo cual coincide con lo resultado de otras investigaciones ⁹, en el sentido de no reportar resistencia a penicilina y tetraciclina, a pesar de que ellos no hicieron la prueba a sulfonamidas.

La mayor resistencia observada en enterobacterias fue para la ampicilina (4/5), seguida de sulfatrimeto- prim y tetraciclina (2/5 en ambos ATM). La resistencia para la ampicilina fue mayor en Klebsiella (3/3) que para E. coli (1/2), superior a las resistencias a los mismos ATM (78,6% y 24%, respectivamente) reportadas por otros ⁹.

Se debe tener presente el alto rango de resistencia esperado en este género bacteriano a causa de la baja susceptibilidad inherente a la ampicilina ⁹. En el caso de la tetraciclina ambas resistencias fueron para E. coli (2/2), muy superior a lo reportado para esta especie (23,6%) ^7,9, con la reserva debido al número reducido de enterobacterias aisladas en el presente estudio.

Se evidenció multi-resistencia (>a 2 ATM) en 3 cepas (3/79) de S. dysgalactiae que fue la especie aislada en mayor número (79/119), evidenciando resistencia a la tetraciclina, sulfatrimetoprim y rifampicina. La multi-resistencia observada en este estudio fue muy inferior (21/101) a la reportada ⁷, aunque fueron a diferentes tipos ATM de los observados en el presente estudio, a excepción de la tetraciclina.

Los SCN presentaron 6/101 cepas multi-resistentes, todas fueron resistentes a la penicilina, 3 a oxacilina, 4 a eritromicina, 3 a gentamicina, 2 a tetraciclina y rifampicina, y 1 sola cepa a trimetroprim sulfametoxazole. Además, una cepa de Staphylococcus schleiferi fue resistente a 7 ATM. Estos niveles de multi-resistencia fueron mucho más bajos que los informados por Raspanti para el S. haemolyticus (42,8%) en Argentina ²⁰ y para SCN (78,6%) por Gizaw en Etiopía ¹².

Para los SCP se encontraron 4/47 cepas multi-resistentes, más frecuentemente en Staphylococcus aureus. Todas ellas fueron resistentes a penicilina, 3 a meticilina y 2 a clindamicina y eritromicina (una sola cepa a gentamicina, tetraciclina y rifampicina). También una cepa de Staphylococcus intermedias fue resistente a 6 ATM, esta multi-resistencia observada ¹⁰ concuerda con lo reportado anteriormente ²⁵, aunque es inferior al 33% reportado otros ⁷, aunque concuerdan en su patrón de resistencia con los siguientes antimicrobianos: penicilina, oxacilina, clindamicina y tetraciclina.

Los microorganismos más prevalentes en las 17 fincas lecheras de los 3 departamentos de Paraguay, donde se tomaron las muestras, fueron especies propias del medio ambiente como el Streptococcus dysgalactiae, del grupo SCN como el Staphylococcus epidermidis y uno de los patógenos más importantes causantes de mastitis contagiosa, el Staphylococcus aureus.

Los Streptococcus sp fueron muy resistentes a la tetraciclina (51,3%). Los SCN fueron más resistentes a la penicilina (29,7%) al igual que los SCP (44,7%). Los Corynebacterium fueron resistente a la sulfatrimetoprim (41,7%), en tanto, que las enterobacterias fueron altamente resistentes a la ampicilina (4/5). La multi- resistencia observada en este trabajo fue baja (3/119) en Streptococcoccus, (6/101) en SCN y (4/47) en SCP, pero llama la atención que todos los multi-resistentes SCN y SCP lo fueron para la penicilina y el 50% meticilino resistentes, lo que puede representar un serio problema para salud pública.