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Revista de la Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Cuyo

versão On-line ISSN 1853-8665

Rev. Fac. Cienc. Agrar., Univ. Nac. Cuyo vol.47 no.1 Mendoza jun. 2015

 

ARTICULO ORIGINAL

Efecto del extracto acuoso de chañar (Geoffroea decorticans Burkart) sobre Botrytis cinerea, como posible alternativa para su control durante poscosecha de uva de mesa

Effect of aqueous extract of chañar (Geoffroea decorticans Burkart) on Botrytis cinerea, as possible alternative for control in post-harvest of table grape

Joana Jaqueline Boiteux 1, 2, María Vanda Hapon 1, 2, María de los Ángeles Fernández 2, Gabriela Susana Lucero 1, 2, Pablo Humberto Pizzuolo 1, 2

1 Cátedra de Fitopatología.

2 Instituto de Biología Agrícola de Mendoza (IBAM CONICET). Facultad de Ciencias Agrarias - Universidad Nacional de Cuyo. Almirante Brown 500- Luján, Mendoza. C. P. M5528AHB. jboiteux@fca.uncu.edu.ar

Originales: Recepción: 28/04/2014 - Aceptación: 04/12/2014


RESUMEN

Botrytis cinerea es un hongo parásito, que produce enfermedades destructivas en muchos cultivos y causa daños económicos importantes. En vid produce podredumbre blanda de la baya, disminuyendo rendimientos y calidad de uva, mostos y vino. Para asegurar la calidad, se emplean distintas estrategias. Entre éstas, la aplicación de fungicidas, que pueden producir efectos adversos en el ambiente y dejar residuos que afectan la salud. Los extractos de plantas son un método de control alternativo válido. Los objetivos de este trabajo fueron determinar el efecto biológico del extracto acuoso de chañar sobre la germinación y crecimiento del tubo germinativo de conidios de B. cinerea y determinar su eficiencia en el control in vivo. Para ello se puso en contacto el extracto a distintas concentraciones, con los conidios del patógeno. Para determinar la eficiencia del control in vivo, sobre racimos de vid cv. Red Globe, se comparó el extracto a distintas concentraciones con dicloran y difusores de dióxido de azufre. De estos estudios, pudo determinarse que el extracto fue capaz de inhibir la germinación y crecimiento del tubo germinativo de conidios de B. cinerea. En los ensayos in vivo, el extracto disminuyó el porcentaje de bayas afectadas por el patógeno.

Palabras claves: Vid; Poscosecha; Podredumbre; Extractos vegetales; Chañar; Botrytis cinerea

ABSTACT

Botrytis cinerea is a parasite fungus that causes destructive diseases over several crops and important economic damages. In grapes causes berry softy rots, which decreases both harvest yield and grape, must and wine quality. In order to ensure quality, different controls are used, such as cultural measure and fungicide applications. Last one, presents adverse effects in environment and its residue affect human health. Plant extracts are a valid alternative method. The objectives of this study were to determine the biological effect of aqueous extract of Geoffroea decorticans (chañar) on germination and germ tube growth of conidia of B. cinerea and to determine its efficiency in vivo control. To accomplish the objectives different concentrations of plant extract were tested over conidia of the pathogen. Efficiency of in vivo control on bunches of grapes cv. Red Globe was determined for different concentrations of plant extract. Also, control efficiency was compared with the chemical controls dicloran and sulfur dioxide. From these studies it was determined that the chañar extract inhibited germination and germ tube growth of conidia of B. cinerea. In vivo tests, under preventive treatments with chañar extract showed that the percentage of diseases berries decreases.

Keywords: Grape; Postharvest; Rot; Plant extract; Chañar; Botrytis cinerea


INTRODUCCION

Botrytis cinerea Pers. es un hongo ubicuo que causa podredumbre en un gran número de cultivos hortícolas, frutícolas, florícolas, entre otros (16, 32, 37). Sobre vid, este microorganismo produce la enfermedad denominada "podredumbre gris" o "moho gris", considerada una de las enfermedades de mayor importancia a nivel nacional e internacional (11, 22).

La podredumbre gris afecta principalmente a los racimos de uva, tanto durante el cultivo como en almacenamiento, transporte y comercialización (29). Si bien a campo es donde esta enfermedad produce los mayores daños, durante el período de almacenamiento, en uva destinada a consumo en fresco, también constituye un grave problema. Esta última situación se debe a que durante el almacenamiento, el fruto envejece y los tejidos se debilitan. El producto en este estado es incapaz de soportar la invasión de organismos patógenos, produciéndose la infección. En una caja de embalaje, es suficiente un racimo enfermo con B. cinerea para que contamine al resto y se pierda por completo la fruta. A este problema se suma el hecho que el control de B. cinerea es difícil y que durante la etapa de poscosecha, existen pocos productos químicos permitidos. Actualmente, en Argentina, los únicos productos permitidos son: dióxido de azufre (SO2) (18, 27, 29, 36) y dicloram (10).

El SO2 si bien posee un excelente control, en varios países del mundo su uso se está restringiendo debido a los residuos que deja en la fruta, peligrosos para la salud humana y el ambiente (2, 6, 31, 32). Además de estos inconvenientes, el producto en sí mismo produce decoloración de bayas y raquis, afectando su calidad (20, 33).

El dicloram, es un fungicida de amplio espectro con acción preventiva y curativa, de Clase Toxicológica IV, lo que significa que normalmente no ofrece peligro.

En la Resolución 507/08 del SENASA, se indica que no se han fijado Límites Máximos de Residuos (LMR) para este producto debido a su poca peligrosidad. En la Unión Europea el LMR para uva es de 0,10 mg Kg-1. Este fungicida puede ser aplicado para el control de podredumbre de los racimos, aunque normalmente el productor cuyano no lo utiliza desde hace muchos años. En consecuencia, ha desaparecido del mercado local (14).

Por lo expuesto, hay una urgente necesidad en encontrar nuevas tecnologías para la protección de la uva de mesa contra la podredumbre gris ocasionada por B. cinerea (9). Investigaciones recientes se orientan al uso de plaguicidas naturales (12, 19, 25, 27, 32, 35, 38, 39). Dentro de este grupo, los compuestos de origen vegetal son aquellos que más atención han generado (8).

Existen referencias de extractos vegetales a los cuales se les ha demostrado actividad biológica contra diferentes hongos fitopatógenos (13, 14, 26, 34). Muchos de ellos son usados por la humanidad desde tiempos remotos para curar o aliviar males, por presentar una importante producción de metabolitos secundarios (8). Entre estos se citan Allium sativum (1); Prunus persica (3); Juglans nigra; Pyrus communis (34); Aloe vera (30); Satureja hortensis (7); Capsicum frutescens (4); Lupinus exaltus (5); Mentha piperita (1); Mangifera indica (21); Heliopsis longipes (24); Matricaria chamomilla (15); Ocimum basilicum (17).

En Argentina, el chañar (Geoffroea decorticans Burkart) es una de las plantas utilizadas en medicina popular por sus virtudes emolientes, balsámicas, expectorantes y antiasmáticas (23, 28). Por consiguiente, el extracto de esta planta podría constituir, en el futuro, una importante fuente de pesticidas biológicos contra hongos fitopatógenos.

Objetivos

Determinar el efecto biológico del extracto acuoso de chañar sobre la germinación y crecimiento del tubo germinativo de conidios de B. cinerea y determinar la eficiencia del extracto en el control in vivo en uvas durante su conservación.

MATERIALES Y METODOS

Aislado utilizado

Para los estudios se utilizó un aislado monospórico nativo de B. cinerea, obtenido de uvas cv. Chardonnay de Mendoza. Este aislado pertenece a la colección de microorganismos del Laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Cuyo.

Obtención del extracto acuoso de chañar

El material vegetal utilizado fue hojas frescas de poblaciones de chañar del Jardín Botánico de la Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Cuyo (32° 58' latitud sur; 68° 52' longitud oeste y 921 m s. n. m.).

Para la obtención del extracto acuoso se siguió la metodología utilizada por Widmer et al. (2006).

Para ello, 20 g de hojas se colocaron en un erlenmeyer de 500 mL con 200 mL de agua destilada.

Posteriormente se autoclavó durante 45 min a 121°C a 1 atm. Inmediatamente se filtró a través de gasa y el extracto se redujo a 20 mL en mechero de Bunsen.

Luego se centrifugó a 5000 rpm durante 15 minutos y el sobrenadante se esterilizó durante 20 min a 121°C y 1 atm. El extracto obtenido se almacenó a 4°C hasta su uso.

Determinación de la inhibición de la germinación y crecimiento del tubo germinativo de conidios de B. cinerea con extracto acuoso de chañar

Para determinar el efecto del extracto de chañar sobre la germinación y crecimiento del tubo germinativo de conidios de B. cinerea, se utilizó la técnica descrita por Chilosi et al. (2011). En primer lugar se preparó una suspensión de conidios de B. cinerea a una concentración de 1.106 conidios.mL-1. Luego se puso en contacto, en las cavidades de portaobjetos escavados (dos cavidades), 2 µL de la suspensión de conidios preparada, con la cantidad de extracto necesario a fin de obtener, en los 10 µL finales, las concentraciones a ensayar (1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 y 80%).

En los testigos se reemplazó el extracto por agua destilada estéril. Cada tratamiento se realizó por triplicado, considerándose una repetición un portaobjeto. Se incubaron en oscuridad a aproximadamente 21°C durante 16 h. Cumplido este período se bloqueó el ensayo con tricolorante de Güegüen, y se determinó sobre un total de 100 conidios la cantidad de conidios germinados, midiéndose en estos el largo del tubo mediante el programa aplicativo Axiovision.

Con los datos obtenidos se calculó el porcentaje medio de inhibición de germinación de conidios y el porcentaje medio de inhibición del crecimiento en largo de tubo germinativo de conidios de B. cinerea utilizando la fórmula (*).

Para determinar la concentración del extracto de chañar que inhibiría en un 50 y 95% la germinación de conidios y el crecimiento en largo del tubo germinativo de conidios de B. cinerea, se probaron distintos modelos de ajuste, eligiéndose el que mejor explicó la distribución de los datos.

Para ello se tuvo en cuenta el Cuadrado Medio del Error (CME), Error Estándar (EE) y R2 ajustado por grados de libertad (g.l).

Determinación de severidad de B. cinerea en racimos de vid inoculados artificialmente con el patógeno, antes y después de ser tratados con extracto de chañar

Los ensayos se realizaron utilizando racimos de uva cv. Red Globe sanas. Para llevar a cabo el ensayo se preparó una suspensión de conidios de B. cinerea a una concentración de 1.106 conidios.mL-1.

Cada tratamiento fue un racimo de uva colocado dentro de una caja plástica cerrada estéril. Los tratamientos fueron realizados tanto en forma preventiva, como curativa, conforme si los mismos fueron realizados antes o después de la inoculación con la suspensión del patógeno respectivamente.

Para determinar la eficiencia de control se asperjaron los racimos con la suspensión de conidios de B. cinerea. Veinticuatro horas antes y/o después de la inoculación se trataron los racimos con tres concentraciones de extracto de chañar (10, 50 y 80%), dicloran al 10% (concentración media registrados en CASAFE para tratamiento pos-cosecha de uva de mesa), generadores de anhídrido sulfuroso y testigos.

Se realizaron tres réplicas por tratamiento. Luego de 7 días de incubación a 22 ± 2°C se determinó la severidad de la enfermedad (porcentaje de bayas afectadas).

Análisis estadístico

Los porcentajes de inhibición del largo de tubo germinativo y de la germinación de conidios, fueron sometidos a análisis de la varianza y las medias separadas mediante test de Tuckey con a = 0,05. Luego, se confeccionó una curva de inhibición mediante regresión, a fin de determinar la concentración de extracto que inhibiría el 50% (CI50) y 95 % (CI95) de las variables analizadas.

En los ensayos in vivo, los datos de severidad fueron analizados mediante ANOVA (P=0,05). Posteriormente se confeccionó una curva de severidad.

Los análisis estadísticos se realizaron con los programas InfoStat, Statgraphics Centurion y Graphpad Prism 5.0.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Determinación del efecto ejercido por el extracto acuoso de chañar sobre la germinación y crecimiento del tubo germinativo de conidios de B. cinerea

En la figura 1, puede observarse cómo el contacto directo de conidios de B. cinerea durante 16 h con el extracto acuoso de chañar al 1%, no disminuyó el porcentaje de germinación de conidios respecto del testigo.

Figura 1. Porcentaje de inhibición de la germinación y crecimiento del tubo germinativo de conidios de Botrytis cinerea a distintas concentraciones de extracto de chañar.

Figure 1. Percentage of germination and germ tube growth inhibition on conidia of Botrytis cinerea to differents concentrations of chañar extract.

Al 50%, produjo un incremento significativo en la inhibición de la germinación, alcanzando aproximadamente el 21%. Al 80% produjo una mayor inhibición alcanzando el 79,3%, diferenciándose estadísticamente del resto de las concentraciones estudiadas.

Ensayos realizados por otros investigadores mostraron que extractos al 10% de las especies vegetales Allium, Capsicum, Juglans nigra, Liquidambar styraciflua, Prunus persica, Pyrus communis, Taxus canadensis, inhibieron en forma considerable la germinación de conidios de B. cinerea (39). En este trabajo se observó un efecto inhibitorio menor del extracto de chañar en comparación con las otras especies vegetales estudiadas. No obstante, no es posible efectuar comparaciones concluyentes ya que en estos trabajos no se especifican los métodos utilizados para realizar las determinaciones, el método de obtención de los extractos e incluso en algunos casos si se trata de un extracto acuoso o alcohólico.

El modelo que mejor se ajustó a la distribución de datos de inhibición de la germinación de conidios fue el no lineal Logístico. El mismo presentó un CME de 22,3; EE de 4,7% y R2 ajustado de 97,0%. La ecuación que representó al modelo ajustado fue:

Donde:

Y = variable dependiente e indica el porcentaje de inhibición de germinación de conidios de B. cinerea.

X = variable independiente e indica la concentración del extracto.

En función de este modelo, se obtuvo que concentraciones de extracto de chañar de 69,1 y 87,4% inhibirían en un 50 y 95% la germinación de conidios de B. cinerea respectivamente.

Con respecto al crecimiento del tubo germinativo de conidios de B. cinerea, en la figura 1 (pág. 245) puede distinguirse cómo los tratamientos con extracto al 1, 5, 10, 20 y 30% no se diferenciaron estadísticamente entre sí, pero estas concentraciones se diferenciaron de las concentraciones mayores. Los tratamientos con concentraciones de extracto comprendidos entre 60 y 80%, no se diferenciaron significativamente entre sí, alcanzando una inhibición del 87%.

Por su parte, el efecto biológico del extracto acuoso de chañar al 80% sobre el crecimiento del tubo germinativo de conidios de B. cinerea, ha sido determinado previamente demostrando su capacidad de inhibir el crecimiento del tubo en un 98,5% (25); por lo que los resultados obtenidos en este ensayo son similares a los reportados anteriormente. De acuerdo con esto, es posible inferir que el extracto de chañar al 80% inhibe en más del 80% el crecimiento del tubo germinativo de conidios de B. cinerea.

El modelo que mejor se ajustó a la distribución de datos de inhibición del crecimiento del tubo germinativo de conidios de B. cinerea fue el Logístico. El mismo presentó un CME de 56,8; EE de 7,5% y R2 ajustado de 94,0%. La ecuación que representó al modelo ajustado fue:

Donde:

Y = variable dependiente e indica el porcentaje de inhibición del crecimiento de tubo germinativo.

X = variable independiente e indica la concentración del extracto.

En función de este modelo, se obtuvo que concentraciones de extracto de chañar de 44,4% y 77,6% inhibirían en un 50 y 95% el crecimiento del tubo germinativo de conidios de B. cinerea respectivamente.

Determinación de la severidad de B. cinerea en racimos de vid inoculados artificialmente con el patógeno, antes y después de ser tratados con extracto de chañar

En los ensayos con tratamiento aplicados en forma preventiva, el testigo presentó un porcentaje de bayas afectadas por B. cinerea del 95%. En los tratamientos en los que se aplicó dicloram y extracto de chañar al 10 y 50% no presentaron diferencias significativas con respecto al testigo. El extracto al 80% presentó un porcentaje de bayas afectadas del 67,3%, diferenciándose del resto de los tratamientos. Donde se utilizaron generadores de SO2 no se observaron bayas afectadas, diferenciándose estadísticamente del resto de los tratamientos y del testigo (figura 2).

Figura 2. Porcentaje de bayas cv Red Globe afectadas por Botrytis cinerea sometidas a diversos tratamientos poscosecha en forma preventiva y curativa.

Figura 2. Percentage of berries cv Red Globe affected by Botrytis cinerea under different post-harvest treatments on preventive and curative way.

En los tratamientos realizados en forma curativa con extracto de chañar y dicloram no se observaron diferencias significativas con respecto al testigo. El testigo presentó un porcentaje de bayas afectadas del 94%. Con generadores de SO2 no se observaron bayas afectadas, diferenciándose estadísticamente del resto de los tratamientos y del testigo. Cabe señalar que el tratamiento con generadores de SO2, el cual mostró mayor efectividad tanto en aplicaciones preventivas como curativas, provocó un importante pardeamiento de bayas y desecación de raquis, afectando las características organolépticas de los racimos de uva (figura 2).

En trabajos anteriores se demostró, que el extracto acuoso de jarilla al 50% aplicado en forma preventiva a racimos de uva cv. Red Globe disminuyó el porcentaje de bayas afectadas por B. cinerea en aproximadamente un 19% (20). Además en este trabajo se indicó que los generadores de SO2 fueron los más eficientes en el control del patógeno, sin embargo afectaron la cosmética de los racimos tratados. De acuerdo con esto, es posible inferir que el uso de extractos vegetales sobre racimos de uva cv. Red Globe, tratados en forma preventiva podría constituir una nueva alternativa para el control poscosecha de B. cinerea.

CONCLUSIONES

El extracto acuoso de chañar a las concentraciones estudiadas inhibió tanto la germinación como el crecimiento del tubo germinativo de conidios de B. cinerea registrándose un efecto dosis-dependiente en ambos, siendo mayores las concentraciones para inhibir la germinación de los conidios.

En los ensayos in vivo, en particular en los tratamientos preventivos, el extracto de chañar a concentraciones de 50 y 80% inhibió significativamente el porcentaje de bayas afectadas por B. cinerea. Para los tratamientos curativos las concentraciones de extracto estudiadas no presentaron una reducción del porcentaje de bayas afectadas por B. cinerea.

Por lo mencionado anteriormente, el extracto de chañar permite controlar a B. cinerea, tanto in vitro como in vivo. Además manifiesta un efecto inhibitorio superior al dicloram, por lo menos en las pruebas in vivo ensayadas. Estos estudios indicarían que el extracto de chañar podría ser usado para el control preventivo de B. cinerea en poscosecha. Sin embargo, se requieren estudios ulteriores para determinar las concentraciones óptimas y tiempo de exposición, a fin de lograr mayor eficacia de control con una mínima o nula alteración de las características organolépticas del producto sobre el cual sea aplicado

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AGRADECIMIENTOS

A la Secretaría de Ciencia, Técnica y Posgrado de la Universidad Nacional de Cuyo que permitió la realización de este trabajo.

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