Introducción

La leishmaniasis es una enfermedad que afecta al hombre y a numerosas especies de mamíferos, de presentación variable según la interrelación de numerosos factores inherentes al huésped, al parásito y al medio ambiente ¹⁶.

La problemática de la leishmaniasis en América radica en sus complejos y variantes aspectos epidemiológicos de presentación. La identificación de huéspedes naturales de Leishmania y reservorios, es de fundamental importancia para comprender el ciclo natural del parásito y la epidemiología de la enfermedad en un área determinada, remarcando de esta manera la necesidad de estudios de focos activos ¹⁷.

Si bien los caninos son epidemiológicamente importantes como reservorios urbanos en diferentes regiones de América, sobre todo para L. infantum chagasi²², la idea de que sean los únicos reservorios ha llevado a las autoridades de salud, en muchas ocasiones, al sacrifico de estos animales como única medida de control de la zoonosis, con baja efectividad en los resultados de tales programas al no tener en cuenta un análisis de múltiples variables influyentes⁵.

Por otro lado, la participación en el ciclo de transmisión de L. infantum de otros mamíferos infectados en zonas urbanas diferentes a caninos domésticos, ya fue propuesta para otras especies animales como gatos ²⁰ y zarigüeyas de hábitat urbano y peri-urbano ⁴, por lo que la participación putativa de otros mamíferos debería ser considerada en las propuestas de control de esta zoonosis, no solo por su identificación como reservorios, sino también como estrategias de conservación de sus nichos ecológicos.

Existen suficientes antecedentes sobre el rol que juegan los roedores en la manutención de ciclos de Leishmnia en diferentes zonas geográficas, reportados en varias especies de roedores silvestres y sinantrópicos ⁸. También se investigaron en zona endémica, diferentes especies de murciélagos y su rol como huéspedes de infección natural ³ o su papel como reservorios¹⁵⁾ en zonas endémicas³ y no endémicas a leishmaniasis¹¹.

Corrientes y Misiones son provincias consideradas de mayor importancia en la prevalencia de leishmaniasis en el hombre y también en otros animales. Tal situación epidemiológica ha marcado a la Provincia de Corrientes como endémica¹², pero poco se sabe sobre la verdadera eco-epidemiología de este lugar y la participación de otras especies animales, fuera de los caninos, como posibles intervinientes en la manutención de la enfermedad en el tiempo y en un biotopo determinado.

En base a trabajos previos del equipo de investigación y con el conocimiento sobre roedores y murciélagos de la Ciudad de Corrientes en estrecha convivencia con el hombre, nos planteamos nuestro objetivo de estudio, basado en conocer la posible participación de estas especies animales en el ciclo de la parasitosis, manteniendo el agente etiológico como huéspedes naturales, reservorios, huéspedes putativos o diseminadores.

Se planteó detectar la infección natural y determinar su prevalencia en la Ciudad de Corrientes con métodos de alta sensibilidad como las técnicas de biología molecular, de elección en estudios epidemiológicos en animales silvestres ²³.

En este estudio se trabajó particularmente con muestras de médula ósea de tales pequeños mamíferos, por ser un tejido en el cual se presenta el principal patrón de distribución de Leishmania visceral, para detectar la presencia de ADN del parásito, como así también la identificación de especies de leishmanias.

Material y Métodos

El estudio se realizó durante el período 2018-2019, en zona urbana de la Ciudad de Corrientes, Argentina (27°28’50’’S, 58°50’02”E). Los puntos de muestreo fueron equivalentes a focos y barrios con prevalencia a leishmaniasis canina (visceral / cutánea), teniendo en cuenta registros de la Dirección de Zoonosis de la Municipalidad de la Ciudad de Corrientes, a los que se sumaron datos de consultorios privados.

El presente trabajo es parte de un proyecto mayor acreditado por la Sec. Gral de CyT UNNE), aprobado por el Comité de Ética y Bioseguridad de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNNE (expediente 14­ 2019-02029, protocolo N° 0084).

Para la captura de roedores se utilizaron jaulas tipo Sherman que fueron colocadas en áreas de mayor prevalencia de casos de leishmaniasis canina. Las jaulas se ubicaron de forma intra y peri-domiciliaria, dos noches seguidas por cada lugar identificado.

Los roedores capturados fueron trasladados al laboratorio de la cátedra de Salud Pública de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNNE, para ser identificados según clave de Osgood (1943) y registrados por edad, sexo y datos clínicos sobre identificación de alopecias, áreas escamosas y lesiones en punta de orejas, hocico, cola, base de la cola y pulpejos de los cuatro miembros.

Para la captura de quirópteros, se identificaron los refugios por medio de métodos auditivos, avistamientos e identificación de rastros. La captura se realizó de acuerdo al lugar y tipo de refugio, utilizando redes de niebla, captura directa en forma manual o “trampa balde”. El manejo y traslado se realizó en bolsas de tela de paño hasta el laboratorio, donde los murciélagos fueron identificados según clave de Bárquez y Díaz¹⁾ y se registraron sus datos al igual que los descriptos para roedores.

Para obtener las muestras de ambas especies se realizó la eutanasia de los animales con pentobarbital sódico (Euthanyle) vía intraperitoneal, previa sedación con una combinación de Ketamina/Acepromacina. Luego se realizó la disección de los animales exponiendo los huesos largos -húmero y fémur- para ser seccionados en forma transversal y exponer el orificio medular (Figura 1), a través del cual se introdujo una aguja con jeringa de tuberculina heparinizada realizando de esta manera la extracción del tejido medular (Figura 2), para ser colocado en Eppendorf libres de ADN.

Para la extracción del ácido desoxirribonucleico (ADN) se realizó una digestión con detergente CTAB (bromuro de cetil trimetilamonio) y purificación con cloroformo: alcohol isoamílico. Se aplicó una técnica de PCR para control de material genético extraído de quirópteros ¹⁴⁾ y otra técnica para las ratas ³⁰.

Como marcador de peso molecular se utilizó pGEM® DNA (Promega) para murciélagos y Cienmarker (Biodynamics) para ratas. Para ambas PCR se utilizó agua destilada como control negativo. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1% y 2% respectivamente en buffer TBE1X, teñidos con bromuro de etidio y visualizados por transiluminación UV.

Para la identificación de leishmanias se aplicó una nested PCR para detectar ADN de protozoos del género Leishmania sp. En la primera ronda se utilizaron primers que amplifican bandas de 520 pb²⁹ y con el producto de amplificación de esta primera PCR se aplicó la segunda ronda con iniciadores que amplificaron bandas de 490 pb ²⁵.

Los productos de PCR fueron revelados por electroforesis horizontales con buffer TBE1X en geles de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio y visualizados por transiluminación UV, utilizando como marcador de peso molecular Cienmarker (Biodynamics).

Para la Identificación de especies de Leishmania (V) braziliensis y L. (L) chagasi se trabajó con muestras que resultaron positivas a la nested PCR, aplicando PCR sencillas bajo condiciones que ya fueron descriptas para ambas especies L. (L) chagasi y Leishmania (V) braziliensis⁶.

Como control positivo para las tres técnicas (genérica y dos sencillas), se utilizó ADN de Leishmania sp, Leishmanias chagasi y braziliensis provenientes del Instituto Nacional de Parasitología “Dr. Mario Fatala Chaben”, Argentina, además de agua destilada como control negativo. Los productos de PCR fueron revelados por electroforesis horizontales en geles de agarosa en buffer TBE (Tris- Acido bórico- EDTA) 1X, teñidos con bromuro de etidio y visualizados por transiluminación UV.

Se utilizó un marcador de peso molecular Cienmarker (Biodynamics) para la comparación de tamaños de los fragmentos amplificados. Se determinó la prevalencia genérica específica de esta parasitosis y la prevalencia diferencial entre especies de Leishmania spp en las diferentes especies animales que conviven en una zona urbana y endémica.

Resultados

Se capturaron 90 animales para su muestreo, 40 roedores y 50 quirópteros. Los roedores capturados fueron identificados en su totalidad pertenecientes al género Rattus rattus. El 80% de las capturas ocurrieron dentro del domicilio, el resto fue peridomiciliario, y solamente 3 capturas se lograron en áreas abiertas. Todos los roedores fueron clasificados como adultos, 12 hembras y el resto machos. A la inspección clínica no se detectaron signos o características visibles compatibles con leishmaniasis.

Ocho animales del total de capturados no fueron muestreados, por encontrarse en estado de preñez, o por no lograr obtener suficiente tejido medular para la repetición de cada una de las 5 PCR por muestra (control de especie, anidada y para especie braziliensis y chagasi).

Por lo tanto se procesaron 32 muestras de ADN y se logró detectar por medio de la técnica Nested PCR para el género Leishmania, primer round, la amplificación de bandas de 520 pb en 9 muestras, al aplicar al producto de esta primer PCR una segunda vuelta para incrementar la sensibilidad del diagnóstico, la amplificación de bandas de 490 pb se detectó en 7 de las 9 muestras positivas al ADN del género Leishmania por lo cual la prevalencia hallada fue del 21,8%.

Figura 1 Apertura de hueso largo y vista del canal medular. 

Figura 2 Absorción de tejido medular a través de jeringa de tuberculina heparinizada. 

De las muestras positivas obtuvimos la identificación de la especie L. chagasi para 5 muestras, una para Leishmania braziliensis y una muestra no detectable para ninguna de las dos especies analizadas.

En cuanto a los murciélagos, se logró la captura de 50 animales. Tres fueron capturados con red de nie­ bla, otros tres en huecos de árboles con trampa balde y los 44 restantes se capturaron con el método manual y trampa balde en refugios artificiales de viviendas habitadas por el hombre. A la inspección clínica no presentaron lesiones compatibles con leishmaniasis.

Se identificaron 37 machos (30 adultos + 7 juveniles) y 13 hembras adultas. Se logró identificar a los murciélagos incluidos en dos de las 4 familias que habitan en la Provincia de Corrientes, las familias Mollosidae y Vespertillonidae, insectívoras.

Se procesaron 50 muestras con la aplicación de la técnica nested PCR, para ambas rondas, se logró detectar bandas de amplificación de 520pb y 490pb en 5 muestras, 3 para la especie Eumops patagonicus y 2 para la especie Myotis albescens.

Cuatro muestras de las totales resultaron positivas para L chagasi (dos para Eumops patagonicus y dos para Myotis albescens) y una resultó no detectable para ambas especies de Leishmanias en murciélago Eumops patagonicus.

Discusión

Con respecto a los roedores, el alto porcentaje de capturas intra-domiciliarias, probablemente se deba a la especie dominante en la zona urbana de la Ciudad de Corrientes, y el sexo y la edad predominante respondan a las características de comportamiento territorial y curioso de estos animales ¹⁰.

En cuanto a Leishmania, se detectó una alta prevalencia que supera la establecida para considerar a Rattus rattus como probable reservorio urbano ⁹, característica ya descripta por otros autores en Rattus rattus que habitan Venezuela ⁸, como también la misma especie y Rattus. norvegicus en Colombia ²⁸.

En México también se constató en áreas urbanas la infección natural a Leishmania en R. rattus, R. norvegicus y M. musculus²¹; y en Brasil, al igual que en nuestro trabajo, se reportó la infección natural en tejido medular de hueso femoral de Musmusculus²⁸. No solo en América se obtuvieron resultados sobre la detección de roedores sinantrópicos como huéspedes naturales, también en Turquía ocurrió en la especie R rattus²⁷. En Irán y zonas geográficas circundantes a ésta, se co­ rroboró en las especies M. musculus y R. norvegicus¹⁹.

Basándonos en numeroso trabajos científicos a nivel mundial, podríamos afirmar que los roedores cumplen distintos roles según área geográfica, ya sea como huéspedes naturales, importantes diseminadores o en algunos casos, como uno de los principales reservorios ⁷.

En cuanto a los quirópteros, la captura más eficiente que obtuvimos se relacionó a los numerosos refugios en estructuras edilicias en zona urbana de la ciudad de Corrientes, en estrecho contacto con el hombre. La edad y sexo del mayor porcentaje capturado también responde a conductas comportamentales propias de la especie.

En cuanto a la detección de Leishmania se halló una baja prevalencia, con un valor que no representa la posibilidad de constituir una especie que se comporte como verdadero reservorio, al menos, en este escenario epidemiológico y con las características de este estudio, no dejando de lado la posibilidad de un rol en la dinámica de la transmisión como reservorios secundarios o esparcidores endémicos que suplanten o ayuden al reservorio primario de la zona geográfica a mantener el agente etiológico en la región.

La baja prevalencia hallada concuerda con resultados obtenidos en la ciudad de México ⁽³, sin embargo en murciélagos que habitan Brasil, se ha detectado una prevalencia marcadamente alta de 40%, por lo cual se adjudica a estos mamíferos el papel de perfectos reservorios de la zona estudiada ²⁶. Estos hallazgos remarcan la problemática que presenta la leishmaniasis en cuanto a su marcado dinamismo, dado por alteraciones en el medio ambiente, reservorios, vectores y cambios demográficos realizados por el hombre ¹⁸.

En referencia a las especies del parásito, en ambos animales el mayor porcentaje se atribuye a Leishmania infantum (chagasi), resultados que podrían ser esperados en base a la clase de tejido estudiado y al conocimiento de patrones de distribución del parásito dependientes de la especie de Leishmania. Sin embargo, se ha demostrado que a pesar de existir patrones de distribución, en algunos casos pueden existir focos crípticos en sitios no comunes como fue demostrado con L. trópica, claramente dermatotrópica, pero con asiento también en otros lugares como hueso, médula y epididímo ⁷.

En poblaciones de la India se ha demostrado que la Leishmania trópica aparte de asentarse en piel también lo hace de formas importante en médula ósea, constituyendo una leishmaniasis visceral ¹³. En nuestros resultados no se detectó L. braziliensis en murciélagos pero sí pudimos hacerlo en tejido medular de rata, especie claramente identificada como dermatotrópica, pero no es desacertada o imposible esta ubicación, debido a que otras especies también con patrón cutáneo, como L. mexicana amazonensis, fueron identificadas en tejido medular y causantes de leishmaniasis visceral en el hombre ².

Al contrario, también existen trabajos donde se detectaron especies de Leishmania de tipo cutánea en el hombre, con marcado asentamiento en las vísceras de roedores, lo cual refuerza la idea de que el tropismo no es el mismo en diferentes especies²⁴. Es importante destacar que los patrones de distribución no solo dependen de la especie del parásito, sino también de la célula huésped y del estado general que esté presente, pudiendo aquellas Leishmanias que normalmente poseen presentación cutánea, por alguna situación, visceralizarse ^13,26.

En nuestro caso, también hallamos muestras de tejido medular de ratas y murciélagos que siendo positivas al género Leishmania, resultaron negativas a las dos especies testeadas, lo cual demuestra la posibilidad que otra especie se encuentre circulando en nuestra región y que posea asiento en médula de pequeños mamíferos, que claramente se presenta con baja densidad.

En base a los resultados obtenidos y el análisis bibliográfico de otras regiones, concluimos que existe alta posibilidad de que otros mamífero, fuera de los caninos considerados los principales reservorios urbanos en la Ciudad de Corrientes, colaboren en mantener ciclos de la enfermedad para que el agente etiológico se perpetué en esta zona geográfica a través del tiempo, reforzando el nuevo concepto de reservorio, que remarca la necesidad de una red de hospedadores y características ambientales necesarias para presentar el mejor escenario de mantenimiento.

Si bien más estudios serán necesarios para darle continuidad al conocimiento sobre patrones de distribución de Leishmanias en pequeños mamíferos y su implicancia epidemiológica, los presentes resultados colaboran con la vigilancia activa que debe realizarse en diferentes especies animales involucradas en un ecosistema determinado, sumando criterios para la interpretación de un enfoque ecológico integrado.

Estos resultados, junto a otros pocos estudios en Argentina, constituyen actualmente las primeras piezas de evidencia del papel que murciélagos y roedores desempeñan en el ciclo de la enfermedad en una zona urbana.