Materiales y métodos

Se trata de un estudio retrospectivo, observacional no alea torizado. La población de estudio estuvo constituida por niños con diagnóstico de LLA que ingresaron a los centros participantes de la Sociedad Argentina de Hemato-Oncología Pediátrica (SAHOP), incluidos en el Protocolo de Tratamiento ALLIC-BFM 2009/HPG (Los resultados del protocolo ALLIC-BFM 2009/HPG no han sido publicados aún). Los centros participantes de SAHOP fueron: Hospital de Pediatría Garra han, Hospital de Niños de San Isidro, Hospital Nacional de Clínicas, Hospital del Niño Jesús de Tucumán, Hospital Eva Perón de Catamarca, Hospital Juan Pablo II de Corrientes y Hospital Avelino Castellán de Chaco.

Un total de 455 casos con LLA, diagnosticados entre octubre de 2009 y febrero de 2016 fueron incluidos en el pre sente estudio, de los cuales se recolectaron 763 muestras de seguimiento entre octubre de 2009 y enero de 2019. Del total de muestras de seguimiento que pudieron ser cuantificadas, 379 correspondieron al día 33 y 384 del día 78 de tratamiento. No fueron procesadas 27 muestras del día 33 y 7 muestras del día 78 por ser insuficientes o no evaluables. Además, no se evaluaron por no haber sido remitidas a nuestra institución 1 muestra del día 33 y 16 del día 78.

Fueron ingresados todos los pacientes que reunieron los criterios diagnósticos de LLA, menores de 17 años, que tuvieron estudios diagnósticos completos: morfológicos, de citometría de flujo, moleculares y citogenéticos, y en los cua les fue posible la obtención de ADN para la determinación del perfil de reordenamientos de Ig/TCR. Se excluyeron del estudio los que habían recibido algún tipo de tratamiento quimioterápico previo al diagnóstico de LLA, los enfermos con enfermedades subyacentes causantes de comorbilida des (síndrome de Down, inmunodeficiencias, síndromes de fragilidad cromosómica, HIV+), los niños menores de 1 año de edad al momento del diagnóstico y los que no contaban con muestras de seguimiento disponibles.

Los estudios moleculares se realizaron al momento del diagnóstico para la caracterización de los reordenamientos Ig/TCR, a fin de detectar aquellas recombinaciones clonales que pudieran ser utilizadas para el diseño de por lo menos un primer paciente específico (PPE) para la cuantificación de la ERM; en el seguimiento, se realizó la cuantificación de la ERM en la muestra de médula ósea del día 33 del Protocolo I (fase de inducción) y en médula ósea del día 78 (previo a la consolidación). El protocolo ALLIC-BFM 2009/HPG estratifica los pacientes teniendo en cuenta el valor de la ERM mediante CFM al día 15 de tratamiento, por lo tanto, el análisis de la ERM en el día 33 y día 78 no fueron utilizados para definir grupos de riesgo en dicho protocolo.

Las determinaciones se realizaron a partir de células mo nonucleares obtenidas por centrifugación con gradiente de densidad de muestras de médula ósea preservadas a -80°C hasta su utilización.

La caracterización de los reordenamientos de Ig/TCR fue realizada a partir de ADN total correspondiente a 107 células mononucleares, que fue purificado utilizando kit de extracción de ADN QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Alemania). Para comprobar la integridad de las muestras y la ausencia de posibles inhibidores de reacción se realizó la cuantificación del gen control Albúmina.

La búsqueda de reordenamientos completos e incompletos de IGH, IGK, TCRB, TCRG y TCRD fue realizada mediante PCR multiplex y secuenciación utilizando el equipo ABI 3130 y ABI 3500 (Applied Biosystems, USA)¹¹. A partir de las re combinaciones clonales detectadas, se diseñaron los PPE de acuerdo con criterios estandarizados por el grupo EuroMRD¹². La cuantificación fue realizada a través de PCR en tiempo real, con un equipo CFX-96 (BioRad, USA), utilizando el PPE diseñado junto con primers y sondas del tipo TaqMan que reconocen zonas consenso, previamente establecidas y estan darizadas por el grupo Biomed¹¹. La validación de los ensayos, la determinación de rango cuantitativo y sensibilidad, así como la expresión de los resultados siguieron las recomendaciones y procedimientos estandarizados de la ESLHO (European Scientific foundation for Laboratory Hemato Oncology)¹².

En cuanto a la ERM mediante CFM, el análisis de los mar cadores fue realizado sobre alícuotas del aspirado de médula ósea, siguiendo estrictamente las pautas de estandarización y calidad establecidas en el protocolo ALLIC-BFM 2009. Las células fueron adquiridas y analizadas en un Citómetro de Flujo FACSCanto II (Becton-Dickinson, USA), adquiriendo al menos 300.000 eventos syto16 (+) (Thermo Fisher Scientific, USA) por tubo. Fue requerido que la población identificada como ERM (cluster) contuviera al menos 30 células o eventos, a fin de alcanzar una sensibilidad de 1 × 10-4. Los anticuer pos utilizados fueron anti CD1a, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD34, CD38, CD45, CD58, CD99 y CD3 citoplasmático, TdT.

Fue posible realizar la cuantificación de ERM por ambos métodos en un total de 314 muestras del día 33 y 352 del día 78. En un total de 66 casos (Día 33: 40 y Día 78: 26) no fue posible estudiar la ERM por CFM por tratarse de muestras no evaluables por esta metodología (presencia de al menos 2% de eritroblastos en las muestras).

Los consentimientos informados de los pacientes fueron obtenidos siguiendo los lineamientos éticos señalados en la declaración de Helsinki. Los investigadores se adhieren a los principios bioéticos y son responsables de toda la información obtenida.

Los datos descriptivos fueron expresados como promedio o mediana y rango. Para el análisis de la evaluación de res puesta al tratamiento, análisis de eventos y supervivencia, se definieron como eventos adversos: respuesta nula, muerte durante la fase de inducción, recaída de la enfermedad, muerte en remisión completa y ocurrencia de una segunda enfermedad maligna. La probabilidad de supervivencia libre de eventos (pSLE) fue definida como el tiempo transcurrido desde la fecha del diagnóstico hasta la fecha del último control, o hasta la ocurrencia del primer evento adverso, y la probabilidad de supervivencia global (pSG), como el tiempo transcurrido desde la fecha del diagnóstico hasta la fecha del último control, o hasta la muerte por cualquier causa. La pSLE y la pSG fueron estimadas utilizando el software Statistix, a través del análisis de Kaplan-Meier y calculando el error estándar (EE) por el método de Peto. Las curvas de supervi vencia fueron comparadas a través del test de Log-Rank^13,14.

Para la comparación de la ERM estimada mediante los dos métodos se evaluó la correlación bivariada de Pearson y, para el análisis de concordancia, el coeficiente Kappa de Cohen mediante el programa R versión 1.2.1335^15-17.

Resultados

Las características clínicas, de laboratorio, de inmunofe notipo y alteraciones genéticas de los 455 pacientes al momento del diagnóstico se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 Características clínicas, de laboratorio, inmunofenotipo y alteraciones genéticas de los pacientes estudiados para enfermedad residual medible 

Con respecto a la caracterización de reordenamientos de Ig/TCR, en el 96% (n = 435) de los casos, se identifi caron uno o más recombinaciones clonales de Ig/TCR. El número de reordenamientos detectados por paciente varió de 0 a 12, con una media de 3 por caso. En total, fueron secuenciados 1550 reordenamientos de Ig/TCR, de los cuales, 692 correspondieron a inmunoglobulinas y de ellos, 406 fueron recombinaciones de cadenas pe sadas y 286 de cadenas livianas kappa. En cuanto a los receptores de linfocitos T, se caracterizaron en total 858 reordenamientos, de los cuales 122 correspondieron a TCRB, 339 recombinaciones TCRG y 397 a TCRD. En los pacientes con fenotipo LLA precursor B, se observaron reordenamientos de cadenas IGH en el 85% de los casos, el 36% presentó reordenamientos IGK, el 16% TCRB, 48% TCRG y 62% TCRD. En los casos de LLA precursor T, se observaron recombinaciones en cadenas TCRB en el 57%, 72% en TCRG, y 40% en TCRD, mientras que en IGH en 4% e IGK en 3%.

A partir de los 435 casos que presentaban recombi naciones génicas Ig/TCR, fue posible diseñar PPE en 421 casos, ya que en los 14 restantes las secuencias del segmento V-(D)-J de los reordenamientos caracterizados no permitían el diseño de PPE por no cumplir con los cri terios definidos para asegurar la especificidad requerida.

En total, fueron diseñados 675 PPE correspondientes a 421 pacientes, con una media de PPE por paciente de 2, con un rango de 1 a 3. El 45% de los PPE fueron específicos para secuencias de reordenamientos IGH, 12% para recombinaciones IGK (56% IGKde), 7% TCRB, 15% TCRG y 21% TCRD. Del total de 34 PPE reverse diseñados, 32 (94%) fueron para secuencias TCRD y los 2 restantes para reordenamientos IGK.

La mediana de sensibilidad de los PPE utilizados para ERM fue de 1 × 10-5. La mediana de rango cuantitativo de los ensayos fue de 1 × 10-4, en un rango de 1 × 10-3 y 1 × 10-5.

En cuanto al análisis de la ERM mediante Ig/TCR, de los 421 pacientes en los cuales fue posible diseñar PPE, el seguimiento pudo ser cuantificado exitosamente en 407 pacientes con LLA (89%), de los que 345 fueron LLA precursor B, 56 casos LLA precursor T y 6 leucemias agudas de linaje ambiguo (LALA). Los 14 casos restantes excluidos correspondieron a pacientes con un PPE único que presentaron una sensibilidad menor a 1 × 10-4.

De los de 407 pacientes estudiados, 39 correspondían al grupo de riesgo estándar, 267 al riesgo intermedio y 101 al grupo de alto riesgo, de acuerdo con la estratificación del protocolo ALLIC-BFM 2009/HPG.

En total, se cuantificaron 763 muestras de seguimiento, correspondiendo a 379 muestras al día 33 y 384 muestras al día 78 del tratamiento. La ERM mediante Ig/TCR fue evaluada en ambos momentos de seguimiento, día 33 y 78, en 356 pacientes. La mediana de seguimiento fue de 54 meses, en un rango de 1 a 104 meses. La mediana de ERM del total de muestras analizadas en el día 33 fue de 1 × 10-6, mientras que en el día 78 fue de 1 × 10-8. En cuanto a las muestras positivas cuantificables, la mediana de ERM positiva al día 33 fue de 2.1 × 10-3, mientras que al día 78 fue de 8.9 × 10-4.

En la Tabla 2 se muestran los parámetros de respuesta al tratamiento y la descripción de los eventos presentados en los niños estudiados.

Con el objetivo de evaluar el valor pronóstico de la ERM mediante Ig/TCR, se realizaron curvas de pSLE de los pacientes estudiados de acuerdo con el valor de ERM al día 33 y 78 de tratamiento, definiendo como valor de corte de positividad: 0.01% (Figs. 1A, 1B).

Tabla 2 Parámetros de respuesta al tratamiento y eventos presentados en los 407 pacientes estudiados 

Fig. 1 A: Probabilidad de supervivencia libre de eventos de los 379 pacientes de acuerdo con la enfermedad residual medible al día 33. B: Probabilidad de supervi vencia libre de eventos de los 384 pacientes de acuerdo con la enfermedad residual medible al día 78. Los valores indican porcentaje de probabilidad de supervivencia libre de eventos y el error estándar se indica entre paréntesis. Los resultados fueron analizados para un valor de corte 0.01% 

Adicionalmente, los 356 pacientes con ERM analizada al día 33 y 78 fueron clasificados en 3 tipos de respuesta definidos de acuerdo con los resultados de ERM: Res puesta tipo 1: los que presentaron ERM negativa en am bos momentos de seguimiento; Respuesta tipo 2: los que mostraron uno de los dos momentos de seguimiento con valor de ERM positiva; y Respuesta tipo 3: los que tuvieron ERM positiva en ambos momentos de seguimiento. El análisis fue realizado utilizando como valor de corte de positividad: 0.01%. En el grupo de riesgo estándar (n=36), 34 pacientes pertenecieron al grupo 1, con una pSLE(EE) de 93.8(4.2)%, y 2 pacientes se asignaron al grupo 2, los cuales permanecieron en remisión completa (RC), es decir con una pSLE(EE) de 100(0)% (gráfico de pSLE no mostradas por el bajo número de pacientes en el grupo 2 y ausencia de grupo 3). En el grupo de riesgo intermedio (n = 231) y alto (n = 89), las curvas de pSLE(EE) para el valor de corte de 0.01% se muestra en la Figuras 2A y 2B.

Fig. 2 A: Probabilidad de supervivencia libre de eventos de los 231 pacientes de riesgo intermedio de acuerdo con los tres tipos de respuesta definidos según el valor de enfermedad residual medible. B: Probabilidad de supervivencia libre de eventos de los 89 pacientes de riesgo alto de acuerdo los tres tipos de respuesta definidos según el valor de enfermedad residual medible. Los valores indican porcentaje de probabilidad de supervivencia libre de eventos y el Error Estándar se indica entre paréntesis. Los resultados fueron analizados para un valor de corte 0.01% 

Como se puede observar en la Figura 2, tanto en los pacientes de riesgo intermedio como en el alto riesgo, las pSLE de los 3 tipos de respuesta fueron significativamente diferentes (p < 0.001).

Además, fue realizada la comparación entre los valores de ERM obtenidos mediante los reordenamientos de Ig/ TCR y CFM en el total de 407 pacientes. La mediana de sensibilidad obtenida mediante Ig/TCR fue de 1 × 10-5 (equivalente a 0.001%), mientras que para CFM fue de 0.002%.

Del análisis comparativo de las 314 muestras anali zadas por ambas técnicas al día 33 se obtuvo un coefi ciente de correlación de Pearson de 0.89 (p < 0.00001), mientras que el coeficiente Kappa de Cohen fue de 0.702 (p < 0.00001). Del total de muestras analizadas, 245 (78%) fueron negativas y 43 (14%) muestras fueron positivas por ambos métodos. Se observaron discordan cias en 26 muestras de seguimiento (8%), de las cuales 7 fueron positivas sólo por CFM, con una mediana de ERM de 0.2 (rango: 0.1-6.8)%; mientras que los 19 restantes, fueron positivas sólo por Ig/TCR con una mediana de ERM de 0.2 (rango: 0.1-8.2)%. En los 7 pacientes que presentaron ERM positiva sólo por CFM, los valores de ERM detectados al día 78 fueron negativos por ambos métodos. De ellos, 1 paciente murió en RC y 1 presentó recaída en médula ósea. En cuanto a los casos con ERM positiva sólo por Ig/TCR, 7 pacientes recayeron, incluyen do 1 caso en el cual fue cuantificada ERM positiva al día 78 mediante Ig/TCR pero no por CFM.

Con respecto al día 78, el coeficiente de correlación Pearson obtenido para las 352 muestras analizadas por ambas técnicas fue de 0.63 (p < 0.00001), y un coeficiente Kappa de Cohen de 0.607 (p < 0.00001). Se observaron resultados concordantes en el 97% de los casos, inclu yendo 330 (94%) muestras negativas por ambos métodos y 10 (3%) muestras positivas por ambos métodos. Se observaron discordancias en 12 muestras de seguimiento (3%), de las cuales 5 resultaron positivas sólo por CFM, con una mediana de ERM de 0.3 (rango: 0.1-2.9)%; mientras que los 7 restantes fueron positivas sólo por Ig/ TCR con una mediana de ERM de 0.2 (rango: 0.1-1.6)%. Con respecto a los pacientes con ERM positiva sólo por CFM, 3 de ellos presentaron recaída; mientras que, en el grupo de pacientes con ERM positiva sólo por Ig/TCR, 2 murieron en RC y 2 recayeron de la enfermedad.

Discusión

En el presente trabajo fue evaluada la aplicabilidad de la utilización de los reordenamientos de Ig/TCR para la determinación de la ERM como marcador pronóstico en un grupo de 455 niños con diagnóstico de LLA que ingresaron a los centros participantes de la SAHOP.

En total, fueron caracterizadas recombinaciones génicas de Ig⁄TCR en el 96% de los casos estudiados, logrando identificar un total de 1550 reordenamientos. La ERM fue cuantificada en forma exitosa en el 89% de los casos.

Con respecto a la caracterización de las recombina ciones génicas de Ig/TCR, la distribución encontrada de reordenamientos en función al inmunofenotipo fue similar a los resultados publicados por series internacionales^18-22. La presencia de reordenamientos de TCR en linfoblastos de fenotipo B y, a la inversa, reordenamientos de inmu noglobulinas en blastos de fenotipo T hace referencia al fenómeno de reordenamientos de linaje cruzado, el cual puede producirse por aberrante actividad de las recom binasas, RAG1 y RAG2, involucradas en el proceso de recombinación V-(D)-J, en las células transformadas²³.

En cuanto al diseño de los PPE, la selección de los targets para ERM fue realizada en base a la estabilidad clonal conocida para los distintos reordenamientos y a la sensibilidad teórica esperada considerando la complejidad y composición de la región V-(D)-J^11,12.

Cuando se analizó específicamente el efecto de la ERM en la supervivencia de nuestros pacientes, se pudo observar que el valor de la ERM en el día 33 de trata miento, y en el día 78, permitiría clasificar a los enfermos en diferentes grupos pronósticos. De esta manera, con un valor de corte de positividad de 0.01% se podrían identificar a aquellos con una menor o mayor probabilidad de presentar recaída de su LLA.

Cabe destacar que los resultados de estudios de ERM realizados por el grupo de estudio internacional BFM han demostrado que la determinación de ERM en solo uno de los momentos de tratamiento no es suficiente para detectar a los pacientes con pronóstico adverso. En cam bio, la información combinada sobre la ERM en ambos momentos de tratamiento es claramente informativa sobre la probabilidad de recaída.

Como se puede observar en nuestros resultados, la información combinada de la ERM al día 33 y 78 distingue claramente a grupos de enfermos con diferente pronósti co, tanto dentro del grupo de riesgo intermedio como en los de riesgo alto. Los pacientes con negatividad de ERM en ambos puntos de tratamiento presentan pSLE signifi cativamente mejores que aquellos con ERM positiva en ambos momentos. Es decir que la persistencia de niveles detectables de ERM durante el tratamiento se asocia con una mayor probabilidad de presentar una recaída clínica.

Es probablemente en el grupo de pacientes de riesgo intermedio donde el valor de la ERM tendría su mayor efecto. En este grupo de riesgo, la estratificación basada en ERM permitiría identificar casos con pronóstico más adverso, los cuales se beneficiarían con una mayor in tensidad de tratamiento quimioterápico o un trasplante de células precursoras hematopoyéticas (HSCT) durante la primera remisión. Del mismo modo, en el grupo de alto riesgo, se detectan aquellos con una muy alta probabilidad de recaída, justificando la necesidad de indicar HSCT.

Es importante remarcar que los resultados del presente estudio demuestran que la determinación de la ERM en los días 33 y 78, en pacientes previamente clasificados por ERM mediante CFM en el día 15, puede proporcionar información adicional para optimizar la estratificación en grupos de riesgo.

Al analizar las fortalezas y limitaciones de la aplicación de los estudios moleculares mediante Ig/TCR para la determinación de ERM se puede definir que las may ores fortalezas son su amplia aplicabilidad clínica y su alto efecto pronóstico, así como la robustez técnica que redunda en una altísima reproducibilidad y objetividad analíticas. Mientras que dentro de las limitaciones se encuentran: 1) las técnicas: cantidad y calidad del ADN utilizado, la limitación en la posibilidad de detección de los reordenamientos de Ig/TCR determinado por el grupo de oligonucleótidos seleccionados para las PCR multiplex; y 2) las biológicas: la presencia de oligoclonalidad y evolución clonal que resulte en pérdida del target, la baja incidencia de rearreglos clonales encontradas en algunos fenotipos o grupos etarios.

Con el surgimiento de la secuenciación de nueva generación (Next Generation Sequencing - NGS) en el campo de la inmunogenética, se ha logrado obtener mayor información sobre la diversidad del repertorio de Ig/TCR linfocitario, permitiendo su aplicación en el estudio de evaluación de clonalidad, estudio de ERM y análisis de repertorio. La mejor resolución lograda por NGS permitirá detectar con mayor profundidad los perfiles de reorde namientos de Ig/TCR presentes en las muestras de los pacientes, y así poder evaluar la aparición de cualquier recombinación clonal dominante, lo cual contribuirá a lograr una mayor precisión en los estudios clonalidad y permitirá alcanzar una mayor sensibilidad analítica en los estudios de ERM^24-26.

En el presente trabajo se muestra, además, la compa ración de valores de ERM mediante dos metodologías, reordenamientos Ig/TCR y CFM, en un grupo extenso de pacientes (n = 407).

Los resultados demostraron que ambos métodos fueron altamente concordantes, presentando valores coincidentes en el 94% del total de las muestras proce sadas. La concordancia observada al día 33 fue del 92%, mientras que al día 78 fue de 97%. Similares resultados de correlación han sido descriptos por otros grupos de trabajo, a pesar de tratarse, en algunos casos, de publica ciones con un menor número de pacientes y utilización de células mononucleares aisladas para la determinación de la ERM por CFM^27-31. Los hallazgos de ERM presentaron discrepancias en 26 (8%) de las 314 muestras estudiadas al día 33, y en sólo 12 (3%) de los 352 casos estudiados al día 78 de tratamiento, con un nivel de positividad mayor o igual a 0.1%. Cuando se analizaron con mayor detalle la magnitud de las discordancias, se pudo observar que los valores de ERM más dispares se encontraron en 4 mues tras del día 33, las cuales mostraron valores de ERM de entre 6.4% y 8.2%. En un caso, se trataba de una muestra positiva sólo por CFM, mientras que las tres restantes fueron positivas sólo por reordenamientos Ig/TCR. Los cuatro casos presentaron ERM negativas en el día 78, por ambos métodos. En el total de 12 muestras en las que se obtuvieron valores de ERM positivas por CFM, pero negativas por rearreglos Ig/TCR, al día 33 y el día 78 de tratamiento, las discrepancias probablemente se debieron a procesos de evolución clonal o presencia de subclones, aunque esto no pudo ser demostrado. Mientras que, en los 26 casos con ERM positivas sólo por rearreglos Ig/ TCR, en ambos momentos de tratamiento, las diferencias encontradas posiblemente se deban a la mayor sensibili dad alcanzada por los métodos moleculares.

Nuestros resultados muestran una excelente concor dancia, corroborando la confiabilidad de la utilización de la CFM en la determinación de la ERM en momentos de tratamiento donde hay signos de regeneración medular.

El método a elección a ser utilizado dependerá de la experiencia, los recursos (humanos y económicos) y el diseño del ensayo clínico establecido en cada centro.

Las ventajas de la utilización de la CFM para la deter minación de la ERM radican en su amplia aplicabilidad, la rapidez de obtención de resultados, la amplia disponi bilidad de equipos en el país y la capacidad de evaluar la celularidad global de la muestra de médula ósea. Mientras que en la cuantificación de los rearreglos de Ig/ TCR mediante PCR en tiempo real, se destaca su amplia aplicabilidad, objetividad analítica y fundamentalmente la alta sensibilidad lograda.

En conclusión, los resultados que forman parte del presente trabajo son los primeros obtenidos en nuestro país sobre la cuantificación de los reordenamientos géni cos de Ig/TCR para la determinación de la ERM en LLA en niños. El estudio ha sido realizado en un número muy significativo de pacientes diagnosticados en forma conse cutiva, tratados en el marco de un protocolo homogéneo y con excelente seguimiento clínico.