BIOLOGIA MOLECULAR

Distribución de genotipos del virus de hepatitis C en la población Argentina

Distribution of hepatitis C virus genotypes in an Argentine population

Distribuição dos genótipos do vírus da hepatite C na população Argentina

 

Ignacio Javier Chiesa¹, Juan Javier Serafino², María Gabriela García³, Guillermo Gabriel Nuñez⁴, María Silvia Pérez⁵, Daniel Alberto Pirola⁶

1. Licenciado en Ciencias Biológicas.
2. Microbiólogo.
3. Técnica en Biotecnología.
4. Bioquímico. Doctor en Inmunología.
5. Bioquímica. Doctora en Biología Molecular.
6. Bioquímico.

Dirección: Laboratorio MANLAB. Marcelo T. de Alvear 2263 (1120). Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. Tel: (54-11)4511-9661. Fax: (54-11) 4826-1465.

 

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Resumen

Mundialmente se han identificado 6 genotipos (1 al 6) del virus de la hepatitis C (HCV). Dichos genotipos se subdividen en diferentes subtipos (a, b, c y otros). La respuesta al tratamiento instaurado depende del genotipo del virus infectante. El objetivo del trabajo fue determinar la frecuencia de los diferentes genotipos del HCV en la población de Argentina. Se estudiaron 510 pacientes infectados con HCV; la genotipificación del virus se realizó utilizando el equipo Versant HCV genotype assay 2.0 (LiPA). Los resultados obtenidos indican que el genotipo predominante del HCV en Argentina es el 1 (67,6%), con una prevalencia similar de subtipos 1a y 1b (33,3% y 34,5%, respectivamente). Se observó también una frecuencia similar de los genotipos 2 y 3 (14,5% cada uno). Con este estudio se actualizan los datos de las frecuencias de los diferentes genotipos de HCV que circulan en Argentina utilizando la nueva versión del reactivo para diagnóstico, el cual permitió una correcta subtipificación de las muestras.

Palabras clave: Virus de la hepatitis C; Genotipos; Hibridación reversa

Summary

Six hepatitis C virus genotypes have been identified worldwide so far. These genotypes have been subclassified into different subtypes (a, b, c and others). It is known that the response to treatment is highly dependent on the genotype involved. The aim of this work was to assess the frequency of occurrence of the different HCV genotypes in the population of Argentina. To this end, 510 infected patients were subjected to HCV genotyping using the commercial kit Versant HCV genotype assay 2.0. Results indicated that the genotype 1 was the most frequent (67.6%), and that subtypes 1a and 1b showed a similar prevalence (33.3% and 34.5%, respectively). Genotypes 2 and 3 also displayed a similar frequency (14.5% and 14.5% respectively). This study provides an update regarding the frequency of all HCV genotypes circulating in Argentina. The results were obtained by the novel version of the genotyping kit, which enabled a correct subtyping of samples.

Key words: Hepatitis C virus; Genotypes; Reverse hybridization

Resumo

Globalmente foram identificados 6 genótipos (1 ao 6) do vírus da hepatite C (HCV). Estes genótipos são subdivididos em vários subtipos (a, b, c, etc.). A resposta ao tratamento depende do genótipo do vírus infectante. O objetivo do estudo foi determinar a freqüência dos diferentes genótipos do HCV na população Argentina. Foram estudados 510 pacientes infectados com o HCV, a genotipagem do vírus foi realizada utilizando o kit Versant HCV genotype assay 2.0 (LiPA). Os resultados obtidos indicam que o genótipo predominante na Argentina é o tipo 1 (67,6%), observando-se uma prevalência dos subtipos 1a e 1b (33,3% e 34,5% respectivamente). Observou-se também uma freqüência semelhante do genótipos 2 e 3 (14,5% e 14,5% respectivamente). Este estudo atualiza os dados das freqüências dos diferentes genótipos do HCV em circulação na Argentina usando a nova versão do kit, o que permitiu uma correta subtipagem das amostras.

Palavras chave: Vírus da hepatite C; Genótipos; Hibridização reversa

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Introducción

En la actualidad, de acuerdo a datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima que el porcentaje de la población mundial infectada con el virus de la hepatitis C (HCV) asciende al 3%, representando la primera causa de morbilidad por enfermedad hepática en países occidentales. En Europa solamente se estima que 4 millones de personas son portadoras de dicho virus ⁽¹⁾. El ciclo de transmisión del virus se da en el hombre, único hospedador susceptible. Las vías de transmisión del HCV incluyen la vía parenteral, la sexual y la vertical.
Este virus establece en la mayoría de los casos una infección crónica cuyo curso natural lleva al paciente afectado a la cirrosis hepática y/o al desarrollo de carcinoma hepatocelular.
El virus de la hepatitis C es un virus envuelto que pertenece a la familia Flaviridae, género Hepacivirus ⁽²⁾. Su genoma es ARN de cadena simple y de polaridad positiva, de aproximadamente 9,6 kb, el cual codifica para al menos 10 proteínas virales.
Basándose en análisis filogenéticos de los virus circulantes en la población mundial se han identificado 6 genotipos ^(1-6). Estos genotipos se subdividen en diferentes subtipos (a, b, c y otros) ⁽²⁾⁽³⁾. Los genotipos 1a, 1b y 3a son los más ampliamente distribuidos por todo el mundo. En Europa y América los subtipos 1a y 1b son los más frecuentes.
Los pacientes infectados pueden responder de forma diferente a los tratamientos antivirales disponibles.
El responsable principal de estas variaciones en la respuesta terapéutica es el genotipo que infecta al paciente el cual es considerado un factor predictivo independiente en la respuesta virológica al tratamiento y, por lo tanto, un factor clave en la elección del mismo ^(4-6).
La presencia del genotipo 1 no solo es predictora de un posible desarrollo de enfermad hepática más severa cuando se lo compara con otros genotipos ⁽⁵⁾ sino que también y en particular el subtipo 1b es el más resistente al tratamiento con interferón alfa (IFNα). Las respuestas terapéuticas más eficientes y sostenidas frente al IFNα fueron observadas en pacientes infectados con los genotipos 2 y 3 en comparación con genotipos 1 y 4.
La región 5´UTR no codificante del genoma viral es altamente conservada entre todos los genotipos y por lo tanto es la región utilizada para el desarrollo de métodos moleculares de detección y genotipificación. A su vez, esta región presenta zonas variables que permiten diferenciar entre genotipos 1 al 5, así también como a la mayoría de los subtipos del genotipo 6 de HCV. Sin embargo, esta región no permite diferenciar los genotipos 6, subtipos c a l, de los genotipos 1. Para minimizar esta limitación se utiliza información adicional que brinda el análisis de la secuencia del gen c que codifica a proteínas del core o nucleocápside del virus HCV. Este gen c incluye también secuencias adicionales que permiten aumentar la precisión de la identificación de los genotipos 1a y 1b ⁽⁷⁾.
El presente trabajo tiene por objetivo determinar la frecuencia de los diferentes genotipos en la población estudiada.

Materiales y Métodos

Se estudiaron 510 pacientes infectados con HCV. Las muestras analizadas fueron recibidas en el Laboratorio de Medicina Genómica de MANLAB en el período comprendido entre octubre de 2009 y mayo de 2011. Las mismas no fueron discriminadas según grupos de riesgo ni fuentes de contagio.
Las muestras provenían en un 82% de pacientes residentes en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y el Gran Buenos Aires; 9,4% de localidades del interior de la provincia de Buenos Aires; 4% de la región de Cuyo, 2% de la región norte; 1,4% de la región central y el 1% de la región sur del país.
El estudio se realizó de acuerdo con los principios éticos de la declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Etica del Instituto Médico Halitus. No fue necesario solicitar consentimiento informado a los pacientes debido a que los datos surgen de estudios realizados por prescripción de sus médicos tratantes.
El ARN genómico del HCV fue extraído a partir muestras de plasma con EDTA; la purificación se realizó con los reactivos para extracción de ácidos nucleicos High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche) y MagnaPure Compact Nucleic Acid Isolation Kit (Roche).
Para la amplificación de los fragmentos de la región 5'UTR y de la región de la nucleocápside (core) del genoma de HCV se utilizó el equipo Versant HCV amplification 2.0 (LiPA) (Siemens).
Este reactivo para diagnóstico permite que los pasos de transcripción reversa (TR) y la amplificación por PCR (Polymerase Chain Reaction) se realicen en un único paso.
Las regiones 5'UTR y core del genoma de HCV se amplifican simultáneamente a partir del ADNc utilizando dos pares de cebadores biotinilados para producir dos fragmentos de ADN distintos de 240 y 270 bp, que representan las regiones 5'UTR y core, respectivamente.
Para genotipificar las muestras se utilizó el reactivo para diagnóstico Versant HCV genotype assay 2.0 (LiPA) (Siemens), el cual es un ensayo de hibridación reversa donde los productos de PCR biotinilados generados por RT-PCR de las regiones 5'UTR y core del genoma de HCV se hibridan a sondas de nucleótidos inmovilizados a una membrana de nitrocelulosa.

Resultados

De las 510 muestras estudiadas, 67,6% (n=345) presentó el genotipo 1; 14,5% (n=74) presentó el genotipo 2; 14,5% (n=74) el genotipo 3 y 3,3% (n=17) presentó el genotipo 4 del HCV (Tabla I). No se han detectado muestras infectadas con HCV con genotipos 5 ó 6.

Tabla I. Frecuencia de distribución obtenida de cada genotipo del HCV.

Analizando los subtipos de los genotipos obtenidos, se observa que los genotipos predominantes son el genotipo 1b (33,5%) y el 1a (33,3%), seguidos por el genotipo 3a (14,3%) y 2 a/c (10,4%).
Dentro de las muestras con genotipo 1 (345 muestras), sólo 4 no se pudieron subtipificar (1,2% del total de muestras con genotipo 1).

Discusión y Conclusiones

La correcta subtipificación es muy importante debido a que es diferente el tipo de tratamiento que deben recibir los pacientes infectados con HCV de distintos genotipos e inclusive con el mismo genotipo pero con diferentes subtipos, como 1a o 1b ^(4-6). Como se mencionó previamente, está demostrado que el genotipo 1b de HCV se asocia con una respuesta menos favorable al tratamiento con INFα ⁽⁸⁾.
La detección de genotipos 2 y 3 en una infección con HCV es indicadora de una mejor respuesta a interferón (IFN) o a la combinación entre IFN y ribavirina.
En general, los ensayos de genotipificación, incluyendo el reactivo para diagnóstico Versant HCV genotype assay (LiPA) 1.0, utilizan la región 5'UTR del genoma del virus debido a que la misma es altamente conservada en la especie y, por lo tanto, adecuada para desarrollar métodos de identificación de genotipos.
La región 5'UTR presenta una variabilidad suficiente para permitir la discriminación de los genotipos 1 a 5 de HCV y la mayoría de los subtipos de HCV. Sin embargo, no permite la discriminación de ciertos subtipos del genotipo 6 y del genotipo 1.
Se ha demostrado que el ensayo Versant HCV genotype assay (LiPA) 1.0, no podía distinguir en forma precisa entre los genotipos 1a y 1b del HCV, debido a que en la mayoría de los casos la región 5'UTR no es lo suficientemente heterogénea para su uso en la determinación de los subtipos de HCV, ya que sólo 1 ó 2 cambios nucleotídicos en la región 5'UTR distinguen a genotipos únicos ⁽⁹⁾.
Para superar esta limitación, el equipo Versant HCV genotype assay (LiPA) 2.0 emplea información adicional de la secuencia de la región core del genoma del HCV mejorando la correcta identificación de los subtipos de los genotipos 1. Asimismo, los ensayos de genotipificación basados en hibridación reversa con oligonucleótidos han demostrado ventajas respecto a los métodos basados en PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Lenght Polymorphism) e incluso frente a la amplificación-secuenciación ⁽⁷⁾. Por la metodología utilizada el presente estudio refleja con mayor precisión la distribución de los tipos y subtipos que trabajos previamente publicados en esta región.
El presente estudio demuestra que el genotipo predominante del virus de la hepatitis C en la República Argentina y especialmente en la región de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y Gran Buenos Aires es el genotipo 1 (67,6%) observándose una incidencia similar tanto de genotipos 1a como 1b (33,3% y 33,5%, respectivamente). Si bien el porcentaje total obtenido de la suma de todos los subtipos del genotipo 1 concuerda con el obtenido en estudios previos en este país, los resultados obtenidos difieren ligeramente de los anteriores que asignaban un mayor porcentaje al genotipo 1b que al 1a ^(10-13). Esta diferencia podría deberse a que en trabajos previos se estudiaron poblaciones menores a la analizada en el presente estudio, a la diferente distribución geográfica de residencia de los pacientes, a que en algunos de ellos los pacientes provenían de una localidad o zona geográfica circunscripta o finalmente a diferencias en la precisión de la metodología empleada.
Siguiendo al genotipo 1, los genotipos detectados con mayor frecuencia son el 2 (14,5%) y el 3 (14,5%). Los datos descriptos previamente por la bibliografía describen una mayor frecuencia de genotipos 2 que de genotipos 3. En el presente trabajo se observa una frecuencia similar de ambos genotipos y una mayor frecuencia de genotipos 3a (14,3%) que de genotipos 2 a/c (10,4%) cuando se analizan los subtipos.
El método empleado permitió la genotipificación mayoritaria de los genotipos 1 y sólo el 1,2% (4 muestras) de este grupo no se pudo subtipificar.
Del total de las muestras (510) analizadas, sólo a 28 (5,5%) de ellas no fue posible subtipificar, lo que evidencia una mejora significativa respecto a los métodos basados en RFLP.
Con respecto al genotipo 4, los porcentajes obtenidos concuerdan con los descriptos previamente. También se confirma la ausencia de pacientes infectados con genotipos 5 y 6 en la Argentina ^(11-15).
El estudio realizado actualiza los datos de las frecuencias de los diferentes genotipos de HCV que circulan en este país mediante el uso de un ensayo estandarizado y validado frente a métodos de referencia ya que muchos de los trabajos previos tienen una antigüedad superior a 10 años. Asimismo, confirma la utilidad de esta nueva versión del ensayo comercial para la genotipificación y subtipificación.

Correspondencia

LIC. Ignacio J. Chiesa
Laboratorio MANLAB Marcelo T. de Alvear 2263 1120 Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Tel: (54-11)4511-9661. Fax: (54-11) 4826-1465.
E-mail: (Ignacio.chiesa@genesis-manlab.com.ar).

Referencias bibliográficas

1. World Health Organization (WHO). Wkly Epidemiol Rec 1999; 49: 421-8.         [ Links ]

2. Robertson BG, Myers C, Howard T, Brettin J, Bukh B, Gaschen T, et al. Classification, nomenclature, and database development for hepatitis C virus (HCV) and related viruses: proposals for standardization. Arch Virol 1998; 143: 2493-503.         [ Links ]

3. Simmonds P, Bukh J, Combet C, Deléage G, Enomoto N, Feinstone S, et al. Consensus Proposals for a Unified System of Nomenclature of Hepatitis C Virus Genotypes. Hepatology 2005; 42: 962-73        [ Links ]

4. Bell H, Hellum K, Harthug S, Maeland A, Ritland S, Myrvang B, et al. Genotype, viral load and age as independent predictors of treatment outcome of interferonalpha 2a treatment in patients with chronic hepatitis C. Scand J Infect Dis 1997; 29: 17-22.         [ Links ]

5. Jiao J, Wang JB. Hepatitis C virus genotypes, HLA-DRB alleles and their response to interferon-alpha and ribavirin in patients with chronic hepatitis C. Hepatobiliary Pancreat Dis Int 2005; 4: 80-3.         [ Links ]

6. Tang S, Cheng IKP, Leung VKS, Kuok UI, Tang AWC, Ho YW, et al. Successful treatment of hepatitis C after kidney transplantation with combined interferon alpha-2b and ribavirin. J Hepatol 2003; 39: 875-8.         [ Links ]

7. Verbeeck J, Stanley MJ, Shieh J, Celis L, Huyck E, Wollants E, et al. Evaluation of Versant Hepatitis C Virus Genotype Assay (LiPA) 2.0. J Clin Microbiol 2008; 46: 1901-6.         [ Links ]

8. Zein NN, Rakela J, Krawitt EL, Reddy KR, Tominago T, Persing DH, et al. Hepatitis C virus genotypes in the United States: epidemiology, pathogenicity and response to interferon therapy. Ann Intern Med 1996; 125: 634-9.         [ Links ]

9. Chen Z, Weck KE. Hepatitis C virus genotyping: interrogation of the 5_ untranslated region cannot accurately distinguish genotypes 1a and 1b. J Clin Microbiol 2002; 40: 3127-34.         [ Links ]

10. Findor J, Sorda J, Daruich J, Bruch Igartua E, Manero E, Avagnina A, et al. Distribución de genotipos del virus de la hepatitis C en una población argentina de drogadictos endovenosos. Medicina 1999; 59: 49-54.         [ Links ]

11. Quarleri JF, Robertson BH, Mathet VL, Feld M, Espínola L, Requeijo MP, et al. Genomic and phylogenetic analysis of hepatitis c virus isolates from argentine patients: a six-year retrospective study. J Clin Microbiol 2000; 38: 4560-8.         [ Links ]

12. Golemba MD, Di Lello FA, Bessone F, Fay F, Benetti S, Jones LR, Campos RH. High prevalence of hepatitis C virus genotype 1b infection in a small town of Argentina. Phylogenetic and bayesian coalescent analysis. PLoS One 2010; 5(1): e8751.         [ Links ]

13. Picchio GR, Baré PC, Descalzi VI, Busy MV, Soria SM, Raffa MP, et al. High prevalence of infection with a single hepatitis C virus genotype in a small rural community of Argentina. Liver Int 2006; 26: 660-5.         [ Links ]

14. Alfonso V, Flichman D, Sookoian S, Mbayed A, Campos R. Phylogenetic characterization of genotype 4 hepatitis C virus isolates from Argentina. J Clin Microbiol 2001; 39: 1989-92.         [ Links ]

15. Gismondi MI, Preciado MV, Badia I, Ferro A, Galoppo C, Grinstein S. Genotype characterization of hepatitis C virus infection in children. Medicina 2001; 61: 815-20.         [ Links ]

Aceptado para su publicación el 25 de julio de 2012