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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.48 no.2 La Plata jun. 2014

 

BIOQUÍMICA CLÍNICA

Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en recién nacidos en Argentina*

Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in newborns in Argentina

Deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase em recém-nascidos na Argentina

 

Niels Alejandro Federico Suldrup1, Natalia Césari2, Edgardo Raúl Streitenberger1, Antonela Naretto3

1 Bioquímico.
2 Bioquímica.
3 Técnica en Análisis de Procesos.

CORRESPONDENCIA DR. NIELS SULDRUP Departamento de Metabolopatías IACA Laboratorios San Martín 68 B8000FIB - BAHÍA BLANCA Argentina E-mail: metabolopatias@iaca.com.ar

Premio Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires/Fundación Bioquímica Argentina 2013

* Por decisión del Comité de Redacción de Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana el presente trabajo se publica respetando el formato tal cual fue presentado al Premio Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires/Fundación Bioquímica Argentina 2013.


Resumen

En Argentina la pesquisa neonatal es obligatoria por ley para ciertas condiciones, pero no para la deficiencia de Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa (G6PD). La deficiencia de G6PD es un trastorno ligado al cromosoma X que puede causar ictericia neonatal, eventualmente kernicterus y hemólisis intravascular aguda en asociación a la exposición a sustancias oxidantes, la ingestión de ciertos alimentos, drogas o medicamentos, algunas infecciones, o cualquier otra situación que implique estrés celular. Es una de las enzimopatías más frecuentes en todo el mundo. El objetivo de este estudio fue determinar la prevalencia de la deficiencia de G6PD en Argentina. Se analizaron 4.500 muestras de sangre seca en varones recién nacidos provenientes de diferentes regiones del país. La actividad de la enzima se determinó cuantitativamente mediante un método fluorométrico semiautomatizado desarrollado en el laboratorio específico para la medición del NADPH producido. El mismo fue evaluado frente a un método comercial. Se hallaron 13 (0,29%) niños que expresaron deficiencia total y 33 (0,73%) deficiencia parcial. Este hallazgo demuestra que la deficiencia de G6PD es una condición frecuente, la detección es factible y no sólo sería útil para la atención especializada contra hemólisis severa en el neonato, sino también para tomar otras medidas preventivas en la edad adulta.

Palabras clave: Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; Pesquisa neonatal.

Summary

In Argentina, newborn screening is mandatory by law for certain conditions, but not for Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD) deficiency. G6PD deficiency is an X chromosome-linked disorder which causes, in most cases, neonatal jaundice, and even kernicterus and acute intravascular hemolysis in association with exposure to oxidizing substances, ingestion of certain foods, drugs or medications, some infections, or any other situation involving cellular stress. It is one of the most common enzymopathies in the world. The aim of this study was to determine the prevalence of G6PDH deficiency in Argentina. A total of 4.500 newborn male dried blood samples from different regions of the country were analyzed. The activity of the enzyme was quantitatively determined by an "in house" developed fluorometric method, measuring the rate of formation of NADPH. It was evaluated against a commercial method. A total of 13 (0.29%) children expressing total deficiency were found, while 33 (0.73%) demonstrated intermediate deficiency. This finding is important as such patients must receive a preventive and educational care. Screening for G6PDH deficiency is feasible and not only would it take early preventive measures against severe hemolysis in the neonatal period, but also other preventive measures later in life.

Keywords: Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency; Newborn screening.

Resumo

Na Argentina, a pesquisa neonatal é obrigatória por lei para determinadas condições, mas não para a deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD). Deficiência de G6PD é um distúrbio ligado ao cromossomo X que pode provocar icterícia neonatal, kernicterus e hemólise intravascular aguda em associação com a exposição a substâncias oxidantes, a ingestão de certos alimentos, drogas ou medicamentos, algumas infecções, ou qualquer outra situação que envolva estresse celular. É uma das enzimopatias mais frequentes em todo o mundo. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência de deficiência de G6PDH na Argentina. Testamos 4.500 amostras de sangue seco de recém-nascidos do sexo masculino originários de diferentes regiões do país. A atividade da enzima foi determinada quantitativamente através de um método fluorimétrico semi-automatizado desenvolvido no laboratório específico para medir o NADPH produzido. O mesmo foi avaliado perante um método comercial. Acharam-se 13 (0,29%) crianças expressando deficiência total, enquanto que 33 (0,73%) demonstraram deficiência parcial. Este achado demonstra que a deficiência de G6PD é uma condição frequente, sua detecção é factível e não só seria útil para o atendimento especializado contra hemólise severa no neonato, mas também para tomar outras medidas preventivas na idade adulta.

Palavras-chave: Deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase; Pesquisa neonatal.


 

Introducción

La deficiencia de la enzima Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa (G6PD) es la enzimopatía más frecuente y el quinto defecto congénito más común a nivel mundial en los seres humanos. Según datos de la Organización Mundial de la Salud esta deficiencia enzimática afecta aproximadamente a 400 millones de personas en el mundo.
Es un desorden genético con un alto grado de polimorfismo. El gen que codifica la enzima está localizado en el cromosoma X. Las mutaciones en este gen determinan variantes proteicas con diferentes grados de actividad enzimática, asociadas a una amplia gama de fenotipos bioquímicos y clínicos.
La enzima G6PD está presente en todas las células del organismo y tiene un rol crítico en la reducción del glutatión y NADP en la vía de las pentosas-fosfato dentro de los eritrocitos. Ambos, NADP y glutatión son necesarios para defender a la célula del daño oxidativo.
La mayoría de las personas con deficiencia de G6PD son asintomáticas y sólo son reconocidas luego de un proceso agudo de hemólisis causado por la exposición a drogas, sustancias oxidantes, algunas infecciones, la ingestión de habas (Favismo) o cualquier otra situación que implique estrés celular. Bajo estas condiciones la hemoglobina se desnaturaliza y el eritrocito es susceptible de hemólisis.
El objetivo de este trabajo es presentar la casuística de la deficiencia de G6PD en un grupo de recién nacidos varones de diferentes regiones de Argentina. Por otra parte, se describe un método desarrollado fluorométrico semiautomatizado para la determinación masiva de la actividad de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en muestras de sangre seca en papel de filtro para la determinación de la actividad de G6PD, el que se valida y verifica según normas internacionales.
El screening neonatal y la información de los pacientes podrían reducir la incidencia de la morbilidad debido a las manifestaciones clínicas de la deficiencia de G6PD.

EPIDEMIOLOGÍA
Para el estudio de los trastornos hereditarios es imprescindible el conocimiento de datos epidemiológicos fiables y precisos.
La sorprendente similitud entre las áreas en que la deficiencia de G6PD es una patología común y la malaria por Plasmodium falciparum es endémica, proporciona evidencia circunstancial que la deficiencia de G6PD confiere algún tipo de resistencia contra la malaria.
Si bien no se conoce el mecanismo exacto de protección contra la malaria, se supone que cuando el plasmodio parasita a los hematíes, utiliza u oxida el NADPH y disminuyen los niveles de GSH. También el plasmodio degrada la hemoglobina liberando sustancias tóxicas como el hierro, lo que aumenta el estrés oxidativo. Estos efectos son drásticos en un eritrocito deficiente en G6PD, produciendo daños severos en el glóbulo.
Las estructuras dañadas son removidas por fagocitosis con el parásito en un estadio temprano de la maduración del plasmodio lo que disminuye la tasa de crecimiento del parásito (1).
Las frecuencias más altas de deficiencia de G6PD se han detectado en África, Asia, la región del Mediterráneo y en el Oriente Medio. Sin embargo, debido a las migraciones, el trastorno también se encuentra en todos los países de América, aunque con diferentes frecuencias (2).
En las patologías hereditarias ligadas al cromosoma X, generalmente, la frecuencia se expresa como la proporción de varones hemicigotos que están presentes en una muestra. Esto se supone igual a la frecuencia de los genes. La prevalencia de mujeres deficientes de G6PD y de mujeres heterocigotas deriva de un cálculo. Si bien estos resultados se consideran bastante exactos, deben ser vistos con algunas reservas debido a la inactivación al azar del cromosoma X en las mujeres.
La deficiencia de G6PD es un problema significativo para la salud pública. Alrededor del 7,5% de la población mundial lleva uno o dos genes para esta deficiencia. Esta proporción es muy variable según las diferentes regiones del globo. La mayor prevalencia se alcanza en algunos países de África, y algunas regiones de la India, donde se observa hasta un 35% de afectados en la población, mientras que en Japón y algunas partes de Europa puede ser menor al 0,1%.
Si considera que anualmente en el mundo nacen 130 millones de niños, aproximadamente 4,5 millones presentan una actividad deficiente de G6PDH; una proporción importante de estos serán susceptibles de padecer ictericia neonatal y/o crisis hemolíticas. Además, debido a las migraciones globales, las complicaciones de la deficiencia de G6PD ahora pueden ocurrir en la mayoría de los países y regiones del mundo (3).
El ritmo con que una población va creciendo afecta no sólo a su tamaño sino también a muy diversos aspectos de su composición y estructura. La tasa o velocidad de crecimiento de una población es un fenómeno que tiene innumerables consecuencias dentro del proceso de transformación de las sociedades y constituye, por lo tanto, uno de los aspectos del cambio demográfico que más atraen la atención.
La Argentina se ubica en el segundo lugar entre las naciones que mayor inmigración europea han recibido en la centuria que abarca desde mediados del siglo XIX hasta la década de los 50 del siglo pasado. Si se toma en cuenta el volumen inmigratorio en relación con el tamaño total de la población que lo recibe, el caso argentino es sobresaliente, ya que fue, a nivel mundial, el país que tuvo mayor impacto inmigratorio europeo en el período señalado (4).
En los siglos XIX y XX, antes y después de la 1a y 2a Guerra Mundial y luego de la Guerra Civil Española, la mayoría de los inmigrantes eran de origen europeo, principalmente italianos y españoles, en menor medida también se recibieron inmigrantes de otras nacionalidades como polacos, rusos, franceses, alemanes, austríacos, portugueses, griegos, ucranianos, croatas, checos, irlandeses, británicos, de los Países Bajos y escandinavos. En ese período también hubo afluencia de personas del Medio Oriente, Líbano y Siria.
Luego de la segunda mitad del siglo XX y comienzos del XXI Argentina recibió y recibe inmigrantes de los países limítrofes. Durante la última parte de la década del 90 fue recibido un número significativo de personas provenientes de países asiáticos, como China, Corea, Taiwán, de África, y del centro y oriente de Europa (Fig. 1).


Figura 1
. Diferentes corrientes inmigratorias hacia la Argentina.

Por lo tanto, la deficiencia de G6PD, que es vista como una patología de las regiones mediterráneas, africanas y asiáticas, debido a estos movimientos migratorios del pasado y el presente, debe ser tomada en cuenta como una entidad emergente y clínicamente relevante en Argentina.
En un estudio retrospectivo sobre diferentes anemias realizado por el Servicio de Hematología-Oncología del Hospital Nacional de Pediatría "Prof. Dr. Juan P. Garrahan", Buenos Aires, Argentina, sobre un total evaluado de 4642 individuos en el período comprendido entre marzo de 1991 y diciembre de 2010, la deficiencia de G6PD representó el 1,1% de los diagnósticos realizados. Pero esta cifra no permite estimar la prevalencia de la patología en el país, pues la población que asiste a este hospital está sesgada por las características de atención de la institución (5).

ESTRUCTURA, FUNCIÓN E IMPORTANCIA DE LA ENZIMA G6PD EN EL METABOLISMO ERITROCITARIO
Los glóbulos rojos deficientes de G6PD son altamente vulnerables a la oxidación.
La molécula de G6PD consiste en una secuencia de 515 aminoácidos. Su estructura activa está dada por agrupaciones de dos y cuatro unidades. A pH neutro coexisten las formas diméricas y tetraméricas en proporciones equimolares. Si bien la enzima G6PD está presente en todas las células del organismo, su actividad difiere en un rango de hasta dos órdenes de magnitud entre diferentes tejidos. Por ejemplo, mientras que los eritrocitos presentan una actividad media de 8,5 U/mg de proteína, los granulocitos pueden expresar valores medios de 850 U/mg de proteína (6).
La G6PD es conocida como la enzima que cataliza la primera reacción de la vía de las pentosas, donde la glucosa es convertida a pentosa, azúcar requerido para la glicólisis y varias reacciones de la biosíntesis. Aunque estas frases ya son clásicas en todos los libros de texto, ahora se sabe que la principal función de G6PD no es la utilización de glucosa, sino que es la producción de NADPH y que tiene un papel crucial en la prevención de daño oxidativo a proteínas y otras moléculas en todas las células (Fig. 2).


Figura 2
. Mecanismo de protección contra peróxidos y superóxidos generados por estrés oxidativo.

Cuando la tasa de NADP/NADPH aumenta, el organismo debe promover la síntesis de NADPH, un agente reductor imprescindible en varias reacciones como la síntesis de ácidos grasos o la reducción de glutatión en los eritrocitos. Para ello, la glucosa-6-fosfato será deshidrogenada por medio de la enzima G6PD, dando lugar a la primera reacción de la ruta de las pentosas fosfato. (Fig. 3) Esta ruta generará más cofactor NADPH, así como ribulosa-5-fosfato, que actúa como fuente de carbono para la síntesis de otras moléculas (3)(7).


Figura 3
. Vía de las Pentosas Fosfato.

Los radicales superóxido, altamente reactivos, decaen espontáneamente o se convierten, por acción de la superóxido dismutasa, en oxígeno y peróxido de hidrógeno (H2O2), que continúa siendo altamente tóxico. La detoxificación de H2O2 a H2O se efectúa mediante las enzimas catalasa (Cat) y glutatión peroxidasa (GSHPx) (8). La enzima glutatión reductasa (GR) tiene como función principal regenerar el glutatión reducido (GSH) a partir de su forma oxidada (GSSG) (Fig. 3).
La enzima G6PD es clave en el mantenimiento del potencial redox en las células (9). El NADPH producido por la G6PD es crucial para la función de las enzimas catalasa y la GSHPx. Es un componente estructural de la catalasa, y se requiere como sustrato para la glutatión reductasa.
Como los eritrocitos no poseen mitocondrias, la vía de las pentosas es su única fuente de NADPH, es por ello que la defensa contra el daño oxidativo depende, exclusivamente, de la G6PD (7). El NADPH es necesario para generar GSH a partir de GSSG y la conservación de los niveles intracelulares de GSH. Éste estabiliza la estructura normal contribuyendo a la elasticidad e integridad de los glóbulos rojos; además, mantiene en estado ferroso al hierro de la hemoglobina, el cual es esencial para el transporte de oxígeno (10).
Si la hemoglobina se desnaturaliza en forma irreversible, precipita y forma los Cuerpos de Heinz, que destruyen las membranas de los eritrocitos produciendo hemólisis y anemia aguda.
Debido a los roles del NADPH en el estado de óxido-reducción celular, la G6PD es la principal enzima en esta
cadena de reacciones necesarias para la protección de las células contra agentes oxidantes (11). Esta actividad enzimática nunca es totalmente incompleta en los seres humanos, todas las células nucleadas, y reticulocitos presentan actividad, aunque sea en forma muy reducida (7).

EL GEN G6PD
El gen de la enzima G6PD está localizado en la región terminal del brazo largo del cromosoma X (Xq28).Tiene 20 kb de longitud y está constituido por 13 exones y 12 intrones. La secuencia codificadora comienza en el exón 2, ya que el exón 1 no es codificante. El largo total de la secuencia codificante es de 2269 nucleótidos (6).
Por lo tanto, la deficiencia de G6PD es causada por un defecto genético ligado al cromosoma X, producida por mutaciones en el gen G6PD, de las cuales resultan cambios en la secuencia de aminoácidos, produciendo un amplio rango de fenotipos derivados del grado de afectación en la actividad de la enzima (11)(12).
El gen de la G6PD es muy polimórfico, se han descripto más de 400 mutaciones diferentes. La gran mayoría de las mutaciones corresponden a sustituciones de una sola base y se encuentran dispersas en todo el gen y se asocian con actividad reducida de la enzima. Todas las mutaciones encontradas afectan a la región codificante del gen; no se han hallado cambios en las regiones reguladoras; esto sugeriría que los niveles reducidos de actividad enzimática se asociarían con inestabilidad de la enzima más que con deficiencias en la expresión del gen (13).
Como toda condición heredable ligada a cromosoma X, los hombres pueden ser hemicigotas normales o deficientes, mientras que las mujeres pueden ser homocigotas normales, homocigotas deficientes o heterocigotas.
Utilizando pruebas bioquímicas, la identificación de los hombres es segura y precisa, no así en las mujeres. En todas las células femeninas solo un cromosoma X es activo, proceso de Lionización, por lo tanto las mujeres heterocigotas exhiben mosaicismo celular. Si la inactivación del otro cromosoma X fuera un proceso aleatorio, el 50% de las células tendrían actividad normal y el 50% serían deficientes, originando un nivel intermedio de actividad entre normal y deficiente. Sin embargo, esto no ocurre de esta manera porque la inactivación no es aleatoria, variando las proporciones entre células G6PD-normales y células con actividad deficiente. Como consecuencia de esto, las mujeres heterocigotas presentan un rango continuo de resultados de actividad (7).

VARIANTES FENOTÍPICAS DE LA G6PD
En 1967 un comité de la OMS propuso los procedimientos bioquímicos estandarizados para caracterizar las variantes fenotípicas de la deficiencia de G6PD. En 1989, para los fines taxonómicos se definieron 5 clases de acuerdo a su nivel de actividad enzimática y sus manifestaciones clínicas (Tabla I).

Tabla I. Clasificación de las Deficiencias de G6PD según recomendaciones de la OMS.

Las variantes de clase I se presentan en un grupo reducido de pacientes que presentan formas clínicas severas. Se asocian con mutaciones puntuales que producen sustituciones de aminoácidos en la región cerca del carboxilo terminal, afectan el sitio de unión de NADP y a la formación del dímero activo. Estos cambios influencian tanto en la estabilidad como en la actividad de la enzima (14).
Las clases II a IV se relacionan con la mayoría de los individuos asintomáticos que presentan deficiencia de G6PD y que desarrollan hemólisis aguda en respuesta al estrés oxidativo

MANIFESTACIONES CLÍNICAS
Si bien hay conocimiento de esta patología desde la época de los griegos antiguos, donde fue relatada por Pitágoras en relación al consumo de habas (favismo) (3), la deficiencia de G6PD no fue descripta hasta 1950, cuando una serie de pacientes sufrieron anemia hemolítica aguda luego de haberles administrado la droga antimalárica primaquina. Como resultado de una serie de investigaciones realizadas para comprender por qué solo algunas personas desarrollaban anemia hemolítica, varios estudios demostraron que la primaquina era una de las tantas sustancias responsables de disminuir la vida de los eritrocitos y los pacientes con deficiencia de G6PD experimentan una sustancial caída en la concentración de hemoglobina con aparición de cuerpos de Heinz (11).
Las manifestaciones clínicas en los individuos deficientes varían desde casos asintomáticos hasta otros con ictericia neonatal, anemia hemolítica aguda, hemólisis producida por sustancias químicas y anemia hemolítica crónica no esferocítica. La hemólisis inducida por fármacos se considera la consecuencia clínica adversa más común de deficiencia de G6PD (15).

MANIFESTACIONES NEONATALES
En neonatos la manifestación más común es la ictericia y hemólisis debido a factores causantes de estrés oxidativo. En la mayoría de los casos, la ictericia neonatal tiene un pico de incidencia dentro del segundo y tercer día de edad pero, en pacientes con deficiencia de G6PDH la hiperbilirrubinemia puede comenzar en el período perinatal, incluso puede tener un comienzo con hemólisis intra-útero (16).
Por lo tanto, la deficiencia de G6PD debería ser sospechada en neonatos que desarrollen hiperbilirrubinemia dentro de las primeras 24 horas del nacimiento, historia familiar con hermanos que padecieron hiperbilirrubinemia neonatal, valores de bilirrubina mayores del percentil 95 y en niños descendientes de inmigrantes de zonas de alta frecuencia (17)(18).
Existe una estrecha asociación entre la deficiencia de G6PD y la ictericia neonatal severa, aún a valores normales-bajos de actividad enzimática (19); también se han reportado posibles asociaciones entre mutaciones y casos de colestasis neonatal (20). A pesar de los esfuerzos para eliminar el daño cerebral permanente e irreversible debido a la encefalopatía por bilirrubina y kernicterus, estas condiciones continúan en el 3° milenio. Este fenómeno ocurre no sólo en regiones con sistemas médicos emergentes, sino también en los países desarrollados. Si bien se han propuesto guías para la detección de recién nacidos con ictericia y el tratamiento de la hiperbilirrubinemia, no se ha logrado eliminar por completo el problema (21).

Anemia hemolítica aguda
Bajo condiciones críticas puede ocurrir hemólisis intravascular masiva y hemoglobinuria. El fallo renal es la complicación más importante y puede llegar a ser letal (22). La hemólisis se produce rápidamente luego de un estrés oxidativo en los eritrocitos, generalmente desencadenado por agentes infecciosos, fármacos, agentes químicos o alimentos. En países como China y Taiwán, con una rica tradición en medicina naturista, la mayoría de las crisis hematológicas son debidas al consumo de hierbas medicinales (23).
Por lo general la hematuria se resuelve dentro de los 4 a 7 días. Se piensa que esto es debido a que los eritrocitos
más viejos que tienen la actividad de G6PD más baja son los que se hemolizan primero. Una vez que esta población eritrocitaria se ha eliminado, los glóbulos más jóvenes y reticulocitos, que tienen una mayor actividad, son capaces de manejar el daño oxidativo sin hemólisis. La duración de la bilirrubinemia no conjugada dependerá del estado de normalidad hepática del paciente (24).
En ciertos casos particulares como en la cirugía cardíaca con circulación extracorpórea (CEC), los pacientes están sometidos a un estrés oxidativo intenso. Las células rojas de una persona deficiente de G6PD son incapaces de mantener la homeostasis, dando como resultado hemólisis intensa (25).
También se han reportado casos de pacientes que luego de 48 horas de la instauración de un tratamiento de quimioterapia, son internados de urgencia debido a crisis hemolítica, produciendo anemia severa, intensa hematuria y metahemoglobinemia (26).

Anemia hemolítica crónica no esferocítica
Una minoría de pacientes con déficit de G6PD pueden presentar anemia sin necesidad de ser expuestos a agentes externos desencadenantes de hemólisis. Estos pacientes corresponden a la clasificación de variantes tipo I de deficiencia de G6PD y poseen mutaciones específicas y poco frecuentes.
Estos pacientes generalmente son evaluados por presentar anemia e ictericia, ya sea en el período neonatal o en forma recurrente durante la infancia y adultez.
La severidad de la anemia puede tener un amplio rango, desde ser subclínica hasta necesitar transfusiones. Esta anemia es por lo general normocítica, pero en ocasiones puede ser macrocítica debido a la cantidad de reticulocitos (hasta 20% o más) los cuales incrementan el volumen corpuscular medio, cambiando y ensanchando la curva de distribución de las células rojas en el hemograma.
La hiperbilirrubinemia se presenta sin alteraciones en enzimas hepáticas, baja concentración de haptoglobina y valores incrementados de lactato deshidrogenasa (27).

MANIFESTACIONES DE LA DEFICIENCIA DE G6PD EN CÉLULAS NO ERITROIDES
Debido a que las células nucleadas tienen la posibilidad de producir proteínas, son menos afectadas que los eritrocitos. Por ejemplo, pacientes que tienen una actividad de entre 5 y 10% del normal en glóbulos rojos, presentan una actividad disminuida de alrededor del 30% del normal en granulocitos. Estos pacientes pueden tener una mayor susceptibilidad a contraer infecciones, particularmente con Staphylococcus aureus.
El mecanismo por el cual la deficiencia de G6PD deteriora la función de fagocitosis es un efecto de la alteración de la cascada oxidativa causado por la escasez de NADPH.
En estudios con ratones G6PD-deficientes se han demostrado anormalidades funcionales en macrófagos (28).
En un estudio para evaluar la incidencia de infarto cerebral silente (SCI) en pacientes pediátricos con anemia drepanocítica, se evidenció que, si bien la anemia drepanocítica no favorecía la aparición de SCI, todos los pacientes a los que se les detectó SCI o vasculopatía intracraneal manifestaron deficiencia de G6PD (29). Menos conocidas son las alteraciones oculares descriptas en asociación a la deficiencia de G6PD. La injuria oxidativa causa modificaciones en las proteínas del cristalino, los procesos de desnaturalización y la formación de agregados insolubles están involucrados en casi todas las formas de cataratas (30).

Diagnóstico de la deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
El diagnóstico definitivo de la deficiencia de G6PD se basa en la determinación de la actividad de la enzima en eritrocitos en forma cuantitativa midiendo la tasa de producción NADPH a partir de NADP.
Para el screening rápido de la población se han prepuesto varios métodos cualitativos, tales como el test de azul de cresol brillante, la prueba de decoloración, descripta por Motulsky en el año 1961 y la prueba de reducción de la metahemoglobina, pruebas puntuales fluorescentes que indican deficiencia de G6PD si la mancha de sangre no fluoresce bajo luz ultravioleta (31).
Estas pruebas cualitativas han sido y son utilizadas en regiones de alta frecuencia en la incidencia de la patología, pero generan controversia y requieren de pruebas confirmatorias ante un resultado considerado anormal (31-33).
Problemas de diagnóstico erróneo pueden surgir cuando se mide la actividad enzimática durante un episodio de hemólisis agudo, o ante la presencia de un recuento alto de reticulocitos, debido a que el nivel de actividad en los eritrocitos jóvenes y reticulocitos es mayor que en las células maduras, lo que puede conducir a resultados falso-negativos para la detección de la deficiencia G6PD.
Es sabido que los recién nacidos prematuros poseen una actividad enzimática de G6PD más elevada que los neonatos a término. Incluso los resultados esperados en niños son mayores que en adultos, es por eso que los valores de actividad enzimática se deben ajustar para las diferentes poblaciones estudiadas (34).
Ninguna de estas pruebas de detección permite diagnosticar mujeres heterocigotas de manera confiable, porque el mosaicismo del cromosoma X conduce a una deficiencia parcial. En grupos de mujeres heterocigotas con inactivación X muy sesgada se pueden obtener resultados de actividad enzimática prácticamente nula (como en la hemicigocidad) hasta resultados totalmente normales.
Para minimizar este error de diagnóstico y utilizar la determinación de la actividad como prueba de pesquisa
neonatal, se propone el uso de una determinación para G6PD cuantitativa, utilizando un valor de corte elevado y el empleo de la normalización de la hemoglobina. Cualquier recién nacido con una actividad por debajo de esta marca debe ser considerado como potencialmente deficiente de G6PD, se deben tomar medidas preventivas y realizar estudios confirmatorios de actividad y el estudio de alteraciones genéticas (35).
Las pruebas basadas en la detección de mutaciones específicas mediante la reacción en cadena de la polimerasa, que no son aptas para realizar un cribado poblacional, son muy útiles para la confirmación de la sospecha clínica en mujeres, en casos familiares o en estudios prenatales.

TRATAMIENTO Y MANEJO CLÍNICO
Afortunadamente, la mayoría de las personas que presentan una deficiencia en la actividad de G6PD, permanecen clínicamente asintomáticas.
El manejo clínico más eficiente de esta enzimopatía se basa en prevenir las crisis de hemólisis, evitando la ingesta de alimentos, fármacos y el contacto con sustancias químicas potencialmente oxidantes. Este enfoque, sin embargo, requiere que el paciente sea consciente de su deficiencia, como resultado de un episodio hemolítico anterior y posterior diagnóstico o el conocimiento de su condición mediante el resultado de un programa de cribado poblacional.
En general, la crisis de hemólisis aguda en individuos deficientes de G6PD es de corta duración, y no necesita un tratamiento específico. En casos menos frecuentes, la hemólisis aguda conduce a anemia severa que puede requerir transfusiones de sangre (32).
La ictericia neonatal causada por deficiencia de G6PD es tratada de la misma manera que la ictericia neonatal debida a otras causas. Existe controversia sobre el tratamiento en relación con las concentraciones de bilirrubina, pero por lo general, cuando la concentración de bilirrubina no conjugada supera 150 mmol/L, los pacientes reciben fototerapia para prevenir lesiones neurológicas; en concentraciones más altas (>300 mmol/L), una transfusión de sangre puede ser necesaria (32)(36).
Pacientes con anemia hemolítica congénita no esferocítica que presentan una anemia bien compensada, no requieren transfusiones de sangre, sin embargo, estos individuos deben ser supervisados, ya que cualquier evento que provoque un estrés oxidativo puede empeorar gravemente, exacerbando el grado de anemia (32).
Existen varias organizaciones (OMS, Favism association) que publican tablas, que son revisadas y actualizadas permanentemente, con listados de los alimentos, drogas, medicamentos y sustancias químicas que deben ser evitados por aquellas personas con actividad deficiente de G6PD porque pueden desencadenar hemólisis (37).

Materiales y Métodos

El estudio se realizó de manera retrospectiva, utilizando muestras residuales de sangre seca en papel de filtro con solicitud de pesquisa neonatal, provenientes de toda la Argentina que fueron recibidas entre los meses de enero y abril del 2013.
Se seleccionaron 4500 muestras de calidad óptima en cuanto a su cantidad, toma de muestra y estado de conservación, de recién nacidos varones de Argentina. Con el fin de obtener una muestra representativa, se clasificaron según la zona de procedencia en 6 regiones geográficas: Noroeste (NO), Noreste (NE), Cuyo (CU), Centro (CE), Suroeste (SO) y Sureste (SE) (Figs. 4 y 5).


Figura 4
. Mapa de distribución de zonas.


Figura 5
. Distribución de muestras por zonas.

Estas muestras se codificaron mediante la sigla correspondiente a cada región más un número correlativo según su fecha de ingreso. Esta codificación fue de exclusivo acceso y conocimiento de sólo dos de los autores responsables del estudio.
El presente trabajo de investigación ha sido evaluado y aprobado por el "Comité Institucional de Bioética en Investigación" del Hospital Municipal de Agudos Dr. Leónidas Lucero, inscripto en el Registro Provincial de Comités de Ética en Investigación, dependiente del Comité de Ética Central en Investigación - Ministerio de Salud de la Provincia de Buenos Aires con fecha 17/09/10, bajo el N° 017/2010, al Folio 54 del Libro de Actas N° 1.
La determinación de la actividad enzimática fue realizada mediante un ensayo fluorométrico cuantitativo semiautomatizado preparado y validado en este laboratorio el cual se comparó con un método comercial para la determinación de G6PD en muestras de sangre seca en papel de filtro. (Neonatal G-6-PD, ZenTech, Belgium).
Se prepararon controles sobre papel de filtro S&S903 a partir de muestras de sangre de pacientes adultos diagnosticados como deficientes de G6PD, muestras de recién nacidos normales previamente analizadas con el método comercial y controles comerciales normales y patológicos (ZenTech, Belgium).

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Ensayo comercial cuantitativo
Se utilizó el método espectrofotométrico cuantitativo para la determinación de la actividad de G6PD en muestras de sangre seca en papel de filtro Neonatal G-6-PD, ZenTech, Belgium. En este método, las muestras se eluyeron en un buffer y una alícuota del eluído se incubó con un reactivo en presencia de NADP. La enzima G6PD presente en la muestra cataliza la oxidación de la glucosa 6-fosfato a 6-fosfogluconato. El NADPH producido reacciona con un reactivo de color, en el cual una sal de tetrazolio es reducida produciendo una reacción de color que se mide a 550 nm y es directamente proporcional a la actividad de G6PDH presente en la muestra. Los resultados se calcularon evaluando el aumento de la absorbancia por minuto de los desconocidos contra una curva realizada con estándares de actividad enzimática conocida. El valor obtenido se corrigió a una concentración de hemoglobina normalizada mediante la lectura a 405 nm.

Ensayo Fluorométrico
Discos de 3 mm de las muestras de sangre seca fueron incubados durante 2 horas a 37 °C en buffer Trietanolamina/EDTA, pH: 7,6 conteniendo 30 μmoles/L de glucosa-6-fosfato, como sustrato y 15 μmoles/L de NADP. Luego de la precipitación con etanol la formación de NADPH fue medida en un Fluorómetro Victor 2D Fluorometer, Perkin Elmer utilizando una longitud de onda de excitación de 355 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. La curva de calibración fue realizada con los estándares comerciales provistos por la firma ZenTech con valores de actividad enzimática conocidos expresados en U/gHb.
La comparación de los métodos se realizó siguiendo la guía "Comparación de métodos y estimación del sesgo utilizando muestras de pacientes" EP09-A2 de Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) (38). El intervalo de referencia para los valores de actividad de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa relacionada a la cantidad de hemoglobina contenida en la muestra fue establecido y verificado de acuerdo a las normas para la definición, establecimiento y verificación de intervalos de referencia en el laboratorio clínico elaboradas por Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI 28 A3E) (39).

Resultados

VALIDACIÓN DEL MÉTODO FLUOROMÉTRICO
La curva calibración se realizó por duplicado con cinco estándares con actividades de 0 hasta 30 U/gHb, obteniéndose un coeficiente de correlación r=0,997 (Fig 6). Para probar la significancia de la regresión de la curva de calibración se realizó un test de ANOVA con un nivel de significación del 1%. Se demostró que la regresión fue altamente significativa.


Figura 6
. Curva de calibración.

La linealidad fue comprobada con el software Line-Checker obteniéndose un rango de linealidad hasta 22,4 U/gHb.
Para los ensayos de precisión se utilizaron 3 controles comerciales con actividades conocidas de 1,5; 7,5 y 15 U/Hb y muestras controles preparadas con actividades de 3,5; 5,5 y 18,7 U/gHb. Estas muestras fueron procesadas 20 veces en duplicado y en días diferentes. Los resultados de los coeficientes de variación se informan en la Tabla II.

Tabla II. Ensayo de precisión.

Se determinó un límite de detección de 0,6 (DE= 0,16) procesando un control con una actividad de 0,5 U/gHb en un total de 20 corridas por duplicado (n=40).

COMPARACIÓN CON EL MÉTODO COMERCIAL
La comparación de métodos se realizó siguiendo los lineamientos de la guía CLSI EP09-A2. Para ello fueron seleccionadas 60 muestras abarcando todo el rango con significado clínico, normal y deficiente. Las muestras fueron procesadas en duplicado por ambos métodos y se estudió la reproducibilidad de los resultados. Ningún valor resultó excluido en el análisis de los datos. Luego se calculó el coeficiente de correlación r obteniendo un
valor de 0,995. El cálculo de la pendiente, la ordenada al origen de la recta de regresión se realizó mediante el método de regresión de Passing-Bablok con un intervalo de confianza del 95% (Fig. 7). El valor de la pendiente fue 1,008 (I.C.95%: 0,983 a 1,029) y la ordenada al origen de 0,19 (I.C.95%: 0,02 a 0,22).


Figura 7
. Comparación de métodos.

VERIFICACIÓN DEL INTERVALO DE REFERENCIA
Se estableció y verificó el intervalo de referencia para los valores de actividad de la enzima Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa relacionada a la cantidad de hemoglobina contenida en la muestra siguiendo las normas establecidas en la guía CLSI C28 A3E (Fig 8).


Figura 8
. Distribución de frecuencias en el Intervalo de Referencia.

El intervalo de referencia obtenido fue: 4,9 a 19,8 U/ gHb.
Teniendo en cuenta los resultados y la clasificación propuesta por el manual del método comercial, se definieron 3 grupos según la actividad enzimática determinada. Deficiencia Total (valores menores a 2 U/gHb), Deficiencia Parcial o Intermedia (Valores entre 2,1 y 4,9 U/gHb) y Actividad Normal (valores superiores a 5 U/gHb) (Fig. 9).


Figura 9
. Clasificación de los resultados en las tres poblaciones de interés clínico.

Todas las muestras que resultaron con actividad disminuida menor a 5,0 U/g Hb fueron re-analizadas para confirmar el resultado mediante el método comercial. Ningún resultado presentó discordancia entre ambos valores.
De los 4500 varones recién nacidos analizados se hallaron 13 (0,28%) muestras que expresaron deficiencia total y 33 (0,73%) deficiencia parcial (Tabla III).

Tabla III. Resultados patológicos por zona

Discusión

La Deficiencia de G6PD es uno de los desórdenes hereditarios más comunes en los humanos. Según datos de la OMS afecta a más de 400 millones de personas en el mundo. Si bien la mayoría de los casos se encuentran en las zonas tropicales y subtropicales de Europa, Asia y África, debido a los flujos migratorios se ha convertido en una condición presente en cualquier parte del mundo.
Todas las inmigraciones enriquecen a los países en los aspectos sociales y culturales pero, a su vez, incrementan las demandas en el sistema de salud. Los profesionales involucrados en la salud deben constantemente actualizarse sobre patologías étnico-específicas.
Es razonable suponer que el número de pacientes con deficiencia de G6PD se incremente en Argentina, y por lo tanto, aumenten las complicaciones asociadas, por lo que es esencial hacer ajustes en planes de gestión de la salud para el diagnóstico y tratamiento eficaz de este trastorno genético. Estos cambios podrían incluir la aplicación de la evaluación del recién nacido para identificar a las personas con esta condición. Incrementar la atención y cuidados hospitalarios de los recién nacidos afectados, brindado tratamiento rápido de las infecciones, y asesoramiento a las familias, tendientes a evitar los factores desencadenantes en crisis hemolíticas.
Si bien la mayoría de los individuos son asintomáticos, existe un riesgo de morbilidad importante, por lo que sería necesario incluir esta prueba en los algoritmos diagnósticos de los pacientes que presenten anemia, lo que permitiría detectar esta deficiencia. También sería de utilidad para todo paciente previo a la iniciación de cualquier proceso que genere estrés oxidativo, como por ejemplo quimioterapia, un tratamiento antibiótico prolongado o cirugías que requieran circulación extracorpórea.

Conclusiones

Fue hallada una frecuencia de 10 recién nacidos varones cada mil nacidos vivos, por lo que este estudio permite concluir que la deficiencia de G6PD es una condición genética esperable en Argentina. No se han encontrado registros o trabajos similares en el país.
Estos datos proveen una fuerte evidencia para la realización de un análisis costo-efectividad para la determinación de actividad de G6PD en Argentina.
La pesquisa masiva tendría utilidad, no solo por la afectación neonatal, sino para poder prevenir a todas aquellas personas que, en caso de ser asintomáticos y debido a la morbilidad que presenta esta condición, eviten situaciones o sustancias que pueden poner en riesgo su salud.
El método fluorométrico desarrollado y evaluado en este laboratorio resultó ser rápido, económico y de fácil aplicación en cualquier centro de pesquisa. La comparación con el método comercial utilizado como referencia mostró muy buena correlación. El intervalo de valores de referencia encontrado guarda coherencia con los valores publicados en toda la bibliografía consultada y permite definir claramente los tres rangos de importancia clínica. Esto lo posiciona como una alternativa válida para la utilización como prueba de cribado masivo.

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Recibido: 28 de febrero de 2014
Aceptado: 28 de abril de 2014

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