BIOLOGÍA MOLECULAR

Campos electromagneticos planares permiten explicar el acople entre peptidos y moleculas de HLA-II

The use of planar electromagnetic fields to explain coupling between HLA-II molecules and peptides

Campos electromagnéticos plano ajudam a explicar o acoplamento entre os peptídeos e as moléculas HLA-II

 

Adrian Cortes^1a, Jonathan Coral^2a

¹ Quimico, Especialista en Inmunologia y Fisica Molecular
² Quimico, Especialista en Bioinformatica
^a Instituto de Investigacion en Vacunas Sinteticas, Antisuero y Nuevos Medicamentos IVSI; CP 190002, 3013879939; Popayan - Cauca, Colombia.

CORRESPONDENCIA DR. ADRIÁN CORTÉS Calle 6ª Nº 18-11, POPAYÁN, Cauca, Colombia E-mail: adrian.cortes205@gmail.com

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Resumen

A partir del reciente hallazgo de campos electromagnéticos planares en sistemas proteicos, se propone un mecanismo para explicar la seleccion, atraccion y acople de peptidos con las moleculas de HLA-II para su posterior presentacion a celulas T-Helper. El mecanismo aqui planteado explica dichos acoples por primera vez sin recurrir al paradigma de acople molecular "Llave-Cerrojo". Aplicando estos patrones electromagneticos, se disenaron ocho peptidos con mejor capacidad acoplante con la molecula de HLA-II que el peptido de acople universal conocido como CLIP, lo cual indica que esta metodologia facilita el diseno de peptidos-vacuna con altos valores de binding. Estos patrones electromagneticos descubiertos por los autores permitieron tambien explicar la capacidad de acople universal del peptido CLIP, asi como proporcionar multiples soluciones a problemas de la Bioquimica y la Inmunologia Molecular que seran expuestos en trabajos posteriores.

Palabras clave: Antígeno leucocitario humano clase II; Péptido asociado a la cadena invariante del complejo mayor de histocompatibilidad clase II; Diseño de vacunas; Presentación de antígenos; Mecanismo de acople "llavecerrojo"; Campos electromagnéticos.

Summary

Following the recent discovery of planar electromagnetic fields in protein systems, this work proposes a mechanism to explain the action of HLA-II molecules in selecting, attracting and coupling with peptide-antigens prior to their presentation to T-helper cells. The mechanism explains such couplings for the first time without recourse to the molecular "key-lock" paradigm. Using these electromagnetic field patterns, eight peptides were designed that showed better coupling capacity with HLA-II molecules than the native CLIP peptide. The novel methodology enables the design of vaccinepeptides with high binding capacity. The discovered electromagnetic patterns further offer an explanation of the universal coupling capacity of CLIP and give rise to a number of solutions and new concepts in molecular immunology.

Key words: Human leucocyte antigen class II; Class II - associated invariant chain peptide; Vaccine design; Antigen presentation; Key-lock mechanism; Electromagnetic fields.

Resumo

Desde a descoberta recente de campos eletromagnéticos plano em sistemas proteicos, os autores propõem um mecanismo para explicar a seleção, a atração e o acoplamento de peptídeos com moléculas HLA-II para subsequente apresentação de células T-Helper. O mecanismo criado explica tais acoplamentos pela primeira vez, sem recorrer ao paradigma de acoplamento molecular "Key-Lock". Aplicando estes padrões eletromagnéticos, foram criados oito peptídeos com melhor acoplamento com a molécula HLA-II do que o peptídeo de anexar universal conhecido como CLIP, que indica que esta metodologia facilita o projeto de peptídeos-vacuna com altos valores de ligação. Estes padrões eletromagnéticos descobertos pelos autores permitiram também explicar a capacidade do CLIP de peptídeo de acoplamento universal, bem como fornecem múltiplas soluções para problemas de Bioquímica e Imunologia Molecular, que será exibido em trabalhos posteriores.

Palavras-chave: Antigénio de leucócitos humanos de classe II; Peptídeo CLIP; Projeto de vacina; Apresentação de antígenos; Mecanismo de anexação "key-lock"; Campos eletromagnéticos.

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Introducción

En la activación de respuestas inmunes, las moléculas del Antígeno Leucocitario Humano Clase II (HLA-II por sus siglas en inglés) son las responsables de presentar los péptidos-antígenos a las células T-Helper ⁽¹⁾⁽²⁾ para activar con esto la cascada de respuesta. El acople de las moléculas HLA-II con péptidos antígenos es por lo tanto crítico para el diseño de vacunas ⁽³⁾⁽⁴⁾ ya que esto es crucial para la inducción de memoria inmunitaria. Existen tres tipos de moléculas de histocompatibilidad HLA-II, DR, DP y DQ, ⁽⁵⁾⁽⁶⁾. El alto polimorfismo de estas moléculas representa una de las mayores dificultades para el diseño de péptidos-vacuna con suficiente capacidad de acople ^(7-9). Sin embargo, todas las HLA-II presentan estructuras tridimensionales comunes, como la hendidura conformada por las dos cadenas proteicas A y B ⁽¹⁰⁾, entre las cuales se acoplan los péptidos de origen foráneo que serán presentados ⁽¹⁾⁽³⁾.
El mecanismo de acople HLA-Péptido no ha podido ser explicado satisfactoriamente por las fuerzas intermoleculares conocidas (Van der Waals, puentes de hidrógeno y fuerzas iónicas), las cuales actúan solamente a cortas distancias, como es el caso de las fuerzas iónicas ⁽¹¹⁾ que poseen radios de acción de tan solo unos dos nanómetros ⁽¹²⁾. Así, en los modelos de docking molecular sólo se tienen en cuenta los residuos que hacen contacto físico entre las superficies ^(10)(13)(14), sin tomar en consideración las fuerzas transmoleculares de tipo electromagnético como las halladas por los autores ⁽¹⁵⁾ y sustentadas experimentalmente ⁽¹⁶⁾. De aquí se infiere que ninguno de los conceptos clásicos logra explicar las interacciones moleculares de largo alcance que ocurren entre moléculas proteicas. Además, del análisis tridimensional de las proteínas y sus respectivos ligandos, se aprecia que sus acoples no poseen una complementariedad espacialelectrostática bien definida, por lo tanto no explica claramente la selectividad entre dominios proteicos, como lo propone el modelo clásico "llave-cerrojo" ^(16)(17).
Existe evidencia que los procesos biológicos pueden ser inducidos o modulados por campos electromagnéticos de frecuencias características, como lo hace la luz en los sistemas fotosintéticos ⁽¹⁸⁾ o el incremento en la actividad catalítica de algunas enzimas al ser irradiadas con campos electromagnéticos ⁽¹⁹⁾. Investigaciones realizadas en la School of Electrical and Computer Engineering, de la RMIT University, en Melbourne (Australia) muestran que las proteínas emiten y absorben radiación electromagnética de frecuencias muy precisas, propias de cada proteína. Los investigadores de la RMIT Universityconsideran que tal radiación es generada por los residuos superficiales de las proteínas conocidos como "hot spots", los cuales se hallan agrupados alrededor del sitio activo ⁽¹⁶⁾. Sin embargo, esta hipótesis falla en no poder explicar fenómenos intermoleculares como: 1) el carácter altamente direccional de los acoples entre proteínas, 2) la evidente comunicación de largo alcance entre moléculas acoplantes, 3) la alta selectividad de los acoples intermoleculares, y 4) la alta velocidad con que ocurren estos acoples. En estudios anteriores ⁽¹⁵⁾, el equipo del Instituto de Investigación en Vacunas Sintéticas y Nuevos Medicamentos (IVSI), halló la existencia de patrones geométricos constantes entre todas las moléculas de HLA-II. Estos patrones de configuración planar fueron denominados Planos electromagnéticos de Cortés-Coral (PECC), puesto que generan, como se infiere en el trabajo, campos electromagnéticos planares. Los PECC están formados por grupos de aminoácidos altamente conservados de una misma especie química (por ejemplo Gly o Pro) dispuestos sobre un mismo plano geométrico. Así, habrá planos PECCGly, PECC-Pro, PECC-Leu, etc. Los PECC poseen capacidad atractiva de largo alcance, lo cual les permite a estos campos atravesar la proteína completa hasta proyectarse hacia el medio acuoso dirigiéndose hacia otras proteínas con las cuales interactúan y posteriormente atraen, como se muestra en un trabajo previo de Cortés, et al. ⁽¹⁵⁾.
En su forma nativa, todas las moléculas HLA-II poseen un péptido acoplado conocido como Péptido Asociado a la Cadena Invariante del Complejo Mayor de Histocompatibilidad Clase II (CLIP por sus siglas en inglés) ⁽⁹⁾, cuya función es bloquear la unión prematura de cualquier otro péptido con estas moléculas ⁽¹³⁾. La principal característica del CLIP es su capacidad de acople universal con todos los tipos y subtipos de HLA-II. El mecanismo exacto de selección, atracción y acople de péptidos con el HLA-II es poco entendido hasta el presente. En esta publicación los autores plantean un mecanismo fundamentado en los PECC para explicar estos fenómenos, así como el diseño de péptidos con mejor capacidad acoplante que el péptido CLIP.

Materiales y Metodos

Se analizaron las 299 secuencias de proteínas de HLAII presentes en la base de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI por sus siglas en inglés). Estas bases de datos fueron depuradas, dejando únicamente secuencias humanas. Una vez seleccionada la información, se realizaron alineamientos múltiples usando el algoritmo Clustal-W2. Se escogieron los residuos altamente conservados bajo criterios de frecuencia de repetición en la base de datos depurada. Estos residuos fueron ubicados en las estructuras 3D de complejos proteicos de HLA-II con péptido acoplado usando los visualizadores Cn3D (visualizador de estructuras macromoleculares, versión 4.3, 2011; http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml) y Jmol (un visor Java de código abierto para estructuras químicas en tres dimensiones. Versión 12.0, 2011; http://www.jmol.org/). La búsqueda para estructuras tridimensionales fue realizada en la base de datos del NCBI y en el Banco de Datos de Proteínas (PDB por sus siglas en inglés), utilizando proteínas cristalografiadas. Se localizaron 20 complejos de los tipos DP, DR y DQ por presentar sistemas HLA-II/péptido. Las proyecciones geométricas y los estudios tridimensionales fueron realizados en Jmol, tomando registros de imagen ⁽¹⁵⁾.
La relación Acople/IC50 se tomó como medida de binding, donde los valores más altos indican el mejor acople. Los valores de cuantificación de binding de los péptidos diseñados por los autores se llevó a cabo usando el algoritmo MultiRTA ^(20)(21), cuyos resultados fueron tabulados.

Resultados

En la Tabla I se muestra el número correspondiente a los residuos altamente conservados en los tres tipos de moléculas de HLA-II (DP, DQ y DR), tanto en sus cadenas A como B.

Tabla I. Residuos altamente conservados de moléculas de HLA-II en secuencias humanas.

a A y B son las notaciones respectivas para las cadenas α y β de las moléculas de HLA-II.

En la Figura 1 se exponen las posiciones espaciales de residuos altamente conservados encontrados en las bases de datos depuradas del NCBI. Se observan alineamientos planares de Glicinas (Figura 1a,b) y de Triptófanos (Figura 1c,d) en una proteína de HLA-II-DR (PDB: 3O6F). La naturaleza planar de estos arreglos pueden apreciarse con mayor facilidad en las vistas laterales (Figura 1b,d). Estos arreglos planares son denominados Planos electromagnéticos de Cortés-Coral (PECC).

Figura 1. Posiciones espaciales de los residuos altamente conservados Glicina y Triptófano en una proteína de HLA-II DR (PDB: 3O6F). (a) y (b) Campo planar de Glicina, PECC-Gly; (c) y (d) Campo planar de Triptófano, PECC-Trp; (imagen tomada de Jmol 12.0).

La Figura 2 ilustra un esquema del mecanismo de selección, atracción y acople de péptidos que realiza el HLA-II, donde el PECC-Gly (a la izquierda) atrae al residuo Gly del péptido mostrado a la derecha.

Figura 2. Atracción del residuo Gly del péptido (derecha) por el PECC-Gly en la molécula de HLA-II. Residuos

En la Tabla II se observan los PECC proyectados por el HLA-II, que favorecen la atracción de ciertos aminoácidos en un péptido. Se aprecia que en algunas posiciones hay más de un PECC proyectado, como se observa en la posición 1, donde se presentan PECC-Trp, PECCTyr y PECC-Val.

Tabla II. Campos PECC proyectados por el HLA-II que favorecen la atracción de ciertos aminoácidos en un péptido.

En la Tabla III se exponen secuencias de péptidos acoplados a moléculas de HLA-II DR, DP y DQ, obtenidas de cristalografías realizadas por otros autores. Las coincidencias de los péptidos con las proyecciones PECC, son resaltadas en azul. Se observan entre una y cinco coincidencias en las secuencias peptídicas con los campos PECC.

Tabla III. Datos experimentales de péptidos acoplados a HLA-II y sus coincidencias con las proyecciones PECC. Las coincidencias son resaltadas en azul.

En la Tabla IV se exponen las medidas de binding calculadas por el algoritmo MultiRTA mediante la relación Acople/IC50. Las secuencias con sustituciones de aminoácidos en el CLIP (mostradas en rojo) son presentadas de acuerdo a su eficacia de mayor a menor binding. Las sustituciones fueron aplicadas de acuerdo con los patrones PECC sugeridos por la Tabla II. Las secuencias en azul son de CLIP en su forma nativa. En la Figura 3 se exponen tres planos PECC que se proyectan hacia sus respectivos aminoácidos en el péptido CLIP. Los planos son mostrados de manera individual para PECC-Pro, PECC-Thr y PECC-Leu.

Tabla IV. Medidas de binding de las secuencias CLIP sustituidas de acuerdo a las indicaciones PECC y calculos usando el algoritmo MultiRTA ^(20)(21)

a El algoritmo MultiRTA no muestra predicciones para el tipo HLA-II DQ b Las secuencias en azul corresponden a las secuencias nativas de CLIP acoplado con DR y DP. Los residuos en rojo representan las sustituciones implementadas usando las indicaciones PECC de la Tabla II.

Figura 3. Tres planos PECC (PECC-Pro, PECC-Thr y PECC-Leu) proyectados sobre el péptido CLIP (imagen tomada de Jmol 12.0).

Discusion y Conclusiones

Esta discusión está centrada en el hallazgo realizado por los autores, de campos electromagnéticos planares presentes en las moléculas de HLA-II.

PLANOS ELECTROMAGNÉTICOS DE CORTÉS-CORAL "PECC"
En el diseño de péptidos-vacuna, el polimorfismo de las moléculas de HLA-II (DR, DP, DQ) ha representado un problema permanente, ocasionando restricción en el acople de los antígenos ⁽²²⁾. A pesar del polimorfismo exhibido por estas proteínas, los autores hallaron un patrón común y constante de residuos que permite conservar la funcionalidad biológica de estas moléculas. Tales residuos son mostrados en la Tabla I, donde se aprecia que las cadenas A de las moléculas DP y DR, presentan residuos con igual posición secuencial, lo mismo ocurre con las cadenas B de las moléculas DQ y DR. A su vez, todos estos residuos ocupan posiciones espaciales equivalentes en los tres tipos de moléculas DR, DP y DQ.
En la Figura 1 se exponen solamente dos de los nueve tipos de residuos altamente conservados, Gly y Trp, los cuales fueron localizados en las estructuras tridimensionales del HLA-II. Se aprecia que estos residuos generan patrones de alineamiento espacial bien definidos, estableciendo un sistema de planos. Este fenómeno de configuración planar se presentó por igual en todos los residuos altamente conservados de las tres proteínas de HLA-II estudiadas (DR, DP y DQ). Los autores infieren que estos patrones planares generan campos electromagnéticos planares atractivos, los cuales fueron denominados Planos Electromagnéticos de Cortés-Coral (PECC). Los campos PECC son generados por sistemas colectivos de residuos idénticos y son capaces de extenderse más allá de la superficie molecular. El acople molecular entre proteínas es por lo tanto inducido por estos campos electromagnéticos de largo alcance y no mediante colisiones físicas aleatorias como lo explica la teoría cinética molecular ⁽¹⁸⁾.
La problemática relativa a la comprensión de los acoples intermoleculares puede ahora ser considerada a la luz del concepto PECC. En primer lugar, la naturaleza geométrica de los PECC permite a las señales electromagnéticas viajar en una única dirección, lo cual puede explicar la naturaleza altamente direccionada de los acoples moleculares en los sistemas bioquímicos. En segundo lugar, la configuración planar de estos campos también hace posible la emisión de señales electromagnéticas que pueden viajar largas distancias a través y entre moléculas. En tercer lugar, los campos PECC del HLA-II atraen los residuos diana hasta un punto exacto en la hendidura de acople, explicando con esto la alta precisión de los acoples intermoleculares observados en los sistemas bioquímicos. Finalmente, la doble cualidad de atracción y selectividad de los PECC, logra explicar la alta velocidad con la cual los acoples intermoleculares tienen lugar, ya que ni la teoría cinética, ni los principios termodinámicos proporcionan tal explicación ⁽¹⁸⁾. Los planos PECC se pueden comparar por analogía con las conformaciones macroscópicas planares exhibidas por las galaxias, cuya disposición espacial se debe a los efectos de largo alcance generados por las fuerzas gravitacionales ⁽²³⁾, mientras que en las proteínas estos mismos arreglos podrían atribuirse a los campos electromagnéticos planares que intercomunican y estabilizan residuos iguales altamente conservados. Otro arreglo espacial similar está presente en las bicapas lipídicas celulares, las cuales se disponen en arreglos planares que forman una barrera continua y delimitan las células (24).

MECANISMO DE SELECCIÓN Y ACOPLE DE PÉPTIDOSANTÍGENOS
A partir de los PECC proyectados (Fig. 2) desde las moléculas de HLA-II hacia el exterior, los autores infirieron los patrones de acople universal para los tres tipos de HLA-II (DR, DP y DQ). Este patrón de acople se presenta en la Tabla II, la cual muestra los residuos que serán atraídos en cada posición del HLA-II. Todos los tipos y subtipos de HLA-II presentaron los mismos PECC en las mismas posiciones espaciales de cada molécula, lo cual implica la existencia de un patrón de selección, atracción y acople universal. Así, cuando los péptidos-antígenos presentan residuos coincidentes con los PECC del HLA-II, se genera un proceso de atracción sobre estos péptidos hasta que finalmente son acoplados con la hendidura del HLA-II. De esto se infiere que los PECC tienen la propiedad de atraer selectivamente a ciertos péptidos para ser acoplados. Corroborando lo anterior, se observa que todos los complejos HLA-Péptido estudiados a partir de datos cristalográficos, poseen secuencias peptídicas coincidentes con los PECC, tal como lo expone la Tabla III. Esto implica que cada molécula de HLA-II seleccionó, atrajo y finalmente acopló péptidos que presentaban coincidencias con los PECC.

DISEÑO DE PÉPTIDOS CON ALTA CAPACIDAD DE ACOPLE A HLA-II
Para verificar el efecto atractivo de los PECC se realizaron las sustituciones sobre el péptido CLIP sugeridas por la Tabla II y sus valores de binding se determinaron mediante el algoritmo MultiRTA ⁽²⁰⁾. Ocho péptidos fueron diseñados aplicando el criterio PECC, y sus medidas de binding son expuestas en la Tabla IV. Se observa que las sustituciones sugeridas por la Tabla II, generaron mejores acoples que el péptido de acople universal conocido como CLIP en su forma nativa. El péptido CLIP en su forma nativa presenta cinco coincidencias con los PECC. Mediante las sustituciones propuestas por la Tabla II, su número de coincidencias fue incrementado hasta seis, de lo cual debería esperarse un incremento en su binding, lo cual fue confirmado usando el algoritmo MultiRTA ⁽²⁰⁾. Estas mejoras en el acople confirman la naturaleza atractiva de los campos PECC y por lo tanto puede aplicarse en el diseño de péptidos- vacuna con alta capacidad de acople con las moléculas de HLA-II.

EXPLICACIÓN MEDIANTE PECC DE LA UNIVERSALIDAD ACOPLANTE DE CLIP
Todos los péptidos diferentes a CLIP acoplados a HLA-II, poseen entre una y cuatro coincidencias con los PECC (Tabla III). Por su parte el péptido CLIP (3QXD), exhibe un total de cinco coincidencias con los PECC. Sólo tres de estas, por claridad, son representadas en la Figura 3. Lo anterior muestra que este alto número de coincidencias entre los PECC y el CLIP explica la alta promiscuidad de este péptido con todas las moléculas de HLA-II (DR, DP y DQ). Se concluye que se hallaron patrones electromagnéticos de tipo planar que dirigen el acople de los péptidosantígenos con las moléculas de HLA-II. Estos patrones son generados por grupos de residuos altamente conservados en las moléculas de HLA-II. Dichos campos fueron denominados PECC. La función de los PECC es seleccionar y atraer péptidos antígenos y permitir su acople con las moléculas de HLA-II. El concepto de campos electromagnéticos planares explica tales acoples sin recurrir al paradigma de acople molecular "llave-cerrojo". El criterio PECC permitió también el diseño de ocho péptidos, cada uno con mejor capacidad de acople que el péptido CLIP. El alto número de coincidencias de los campos PECC con el CLIP explica la capacidad de acople universal de este péptido con todas las moléculas de HLA-II. Finalmente, los resultados obtenidos proporcionan diversas soluciones y nuevos conceptos para la Inmunología Molecular y la Bioquímica en general, los cuales serán expuestos en trabajos posteriores.

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Recibido: 7 de octubre de 2014
Aceptado: 5 de mayo de 2015