Evaluación del molibdato y nitrato sobre bacterias sulfato-reductoras asociadas a procesos de corrosión en sistemas industriales

J. R. Torrado Rincón*, D. M. Calixto Gómez, A. E. Sarmiento Caraballo, J. H. Panqueva Álvarez

Corporación para la Investigación de la Corrosión (CIC). Km 2, Vía Refugio, Sede UIS, Guatiguará, Piedecuesta, Santander, Colombia.

*Correspondencia. E-mail: jorgetorrado@gmail.com

RESUMEN

Se estudió la cinética de crecimiento de bacterias sulfato-reductoras (BSR) y la biotransformación de sulfato a sulfuro de hidrógeno bajo condiciones de laboratorio, para establecer el efecto inhibitorio de sales de molibdato y nitrato de sodio. Los microorganismos estudiados fueron aislados del agua de producción contenida en un sistema de transporte de gas natural, donde se encontraban relacionados con procesos de corrosión influenciada microbiológicamente. Con 5 mM de molibdato se obtuvo una reducción de células libres a niveles no detectables y de seis órdenes de magnitud en las biopelículas, con una disminución del sulfuro de alrededor del 100%. Con 75 mM de nitrato se observó una reducción de cuatro y dos órdenes de magnitud en las células libres y en las adheridas en forma de biopelículas, respectivamente, con una disminución del sulfuro de alrededor del 80%. La reducción de la tasa de corrosión observada sustenta la posibilidad de emplear estas sales como biocidas no convencionales no contaminantes del medio ambiente, para el control y mitigación efectiva de los procesos de biocorrosión interna de tanques de almacenamiento y de líneas de transporte en sistemas industriales de gas natural y petróleo.

Palabras clave: Biocorrosión; Bacterias sulfato-reductoras; Sulfuro de hidrógeno; Reducción desasimilatoria; Biocida; Tasa de corrosión

ABSTRACT

Evaluation of molybdate and nitrate on sulphate-reducing bacteria related to corrosion processes in industrial systems. The sulfate-reducing bacteria growth kinetics and the biotransformation of sulfate into hydrogen sulfide were studied under laboratory conditions, using batch and continuous assays to determine the effect of molybdate and nitrate as metabolic inhibitors. The microorganisms were isolated from water coming from a natural gas dehydration plant, where they were associated with Microbiologically Influenced Corrosion (MIC) processes, and later cultured in planktonic and sessile states. The addition of 5 mM molybdate showed a growth reduction to levels of non - detectable floating cells and a six order of magnitude reduction in biofilms, concomitant with a sulfide decrease of around 100% in all cultures inhibited by this compound. The addition of 75 mM nitrate showed a four order of magnitude reduction in free bacterial cells and a two order of magnitude reduction in adhered bacterial cells, respectively, as well as a sulfide decrease of around 80%. The decreased corrosion rate detected suggests that these inorganic salts could be nonconventional biocides for an effective and environmentally non contaminant way of controlling and mitigating internal biocorrosion processes in storage tanks and pipelines in natural gas and petroleum industrial systems.

Key words: Biocorrosion; Sulfate-reducing bacteria; Hydrogen sulfide; Dessasimilatory reduction; Biocide; Corrosion rate

INTRODUCCIÓN

El control de la corrosión es un elemento sobresaliente en la preservación de la integridad de sistemas industriales en el mundo y representa uno de los principales costos de operación y mantenimiento en sistemas de almacenamiento y transporte ⁽³²⁾. Cuantificar los costos asociados a la corrosión no ha sido fácil y resulta controversial. En los Estados Unidos, las pérdidas por corrosión de tuberías de gas natural fueron estimadas en 1996 en cerca de 840 millones de dólares por año, y en 2001 se estimó que el costo anual de todas las formas de corrosión en la industria del gas y el petróleo fue de 13.400 millones de dólares, de los cuales la corrosión influida microbiológicamente representó cerca de 2.000 millones de dólares.
En términos generales se ha estimado que el 40% de toda la corrosión interna de tuberías en la industria del gas puede ser atribuida a corrosión microbiológica ^{(37, 64)}. Otras estimaciones consideran que el daño producido por el sulfuro de hidrógeno proveniente de la actividad de las bacterias sulfato-reductoras (BSR) ocasiona gastos de alrededor de 4.000 a 6.000 millones de dólares anuales ⁽⁶⁵⁾. En Colombia, los costos asociados a los problemas de corrosión metálica se estimaron en 1997 en 1.300 millones de dólares, aproximadamente el 1,2% del producto interno bruto ⁽⁸⁾, sin que se tenga certeza del daño atribuible a los microorganismos.
Las BSR son mayoritariamente microorganismos anoxigénicos estrictos y se consideran los principales agentes productores de biocorrosión. Poseen una amplia diversidad filogenética que incluye: bacterias gramnegativas mesofílicas pertenecientes a la división δ- Proteobacteria, bacterias gram-positivas formadoras de esporas (bajo contenido G+C), bacterias termofílicas y Archaea termofílicas. Dentro de las δ-Proteobacterias se destacan géneros tales como Desulfobacter, Desulfobulbus, Desulfonema, Desulfovibrio, Desulfobaculum y Desulfosporosinus ⁽⁵³⁾. Estos microorganismos emplean como fuente de carbono alquilbencenos, n-alcanos, xantanos, ácidos grasos y productos orgánicos polares formados por bacterias oxigénicas a partir de hidrocarburos ⁽²²⁾. Otras fuentes de carbono, energía y electrones las constituyen los ácidos grasos volátiles como el lactato y el acetato, hallados naturalmente en pozos de gas natural y petróleo ^{(20, 34)}.
Las BSR emplean el anión sulfato como aceptor final de electrones y lo biotransforman por vía desasimilatoria en sulfuro de hidrógeno ^{(40, 41)}. El sulfuro de hidrógeno es un gas ácido altamente corrosivo soluble en agua, donde se comporta como un ácido fuerte. Este compuesto precipita al combinarse con metales pesados y forma, en la mayoría de los casos, una película negra de sulfuro de hierro (FeS), que puede producir taponamientos y pérdidas localizadas de metal denominadas picado (del inglés pitting). La producción de H2S afecta los equipos empleados para la extracción, el transporte, el almacenamiento, la refinación y la distribución del crudo. El proceso de corrosión iniciado o acelerado por este agente puede llegar a perturbar drásticamente las capacidades de producción y a incrementar los costos relacionados con la implementación de medidas y programas de control, mitigación y monitoreo, y finalmente, puede disminuir el valor comercial del hidrocarburo recuperado ⁽²⁴⁾.
Tradicionalmente el control de los procesos corrosivos por BSR y sulfuro ha incluido métodos químicos, como el uso de agentes biocidas. Sin embargo, estas sustancias son tóxicas, costosas, corrosivas, poco efectivas contra biopelículas y sus residuos ejercen un impacto negativo sobre el ambiente ^{(28, 50, 56)}. Los compuestos de molibdeno se han usado ampliamente en la industria, incluso como inhibidores de corrosión anódicos ^{(19, 21, 60)}, y han demostrado ser más amigables con el ambiente ^{(35, 36)} y capaces de bloquear los procesos de respiración y producción de energía celular que involucran la reducción del sulfato ^{(10, 13, 14, 25, 54, 55, 62, 63)}. De igual forma, en presencia de nitrato es posible conseguir una completa remoción del sulfuro del sistema ^{(39, 48)}, ya que las BSR pueden utilizar este compuesto como aceptor final de electrones alternativo ⁽²⁶⁾ y, por vía desasimilatoria, producir amonio o nitrógeno gaseoso ⁽¹⁶⁾, gas inocuo en términos de corrosión. En suma, estos compuestos tienen potencial para controlar la actividad sulfurogénica e inhibir el crecimiento de BSR.
El objetivo de este estudio fue determinar bajo condiciones de laboratorio la aplicabilidad de sales que contienen molibdeno y nitrato como agentes biocidas no convencionales, para controlar la producción de H₂S e inhibir el crecimiento de las BSR en sistemas industriales a bajo costo, con alta efectividad y reduciendo el impacto sobre el ambiente. Estos datos constituyen la base experimental para realizar la aplicación en sistemas reales y desarrollar una innovadora alternativa para controlar y mitigar la biocorrosión.

MATERIALES Y MÉTODOS

Origen y recolección de muestras
Se recolectó el condensado acuoso retenido en el filtro de entrada de cada uno de los tres compresores ubicados en una estación de deshidratación de un sistema de transporte de gas natural ubicado al norte de Colombia. Se realizaron tres monitoreos en los meses de febrero, abril y mayo de 2003; se evaluaron nueve muestras en total. Las muestras fueron recolectadas en medio PBS (phosphate buffer solution) para bacterias sulfato-reductoras, con la siguiente composición (g/l): NaCl, 8,7; KH₂PO₄, 0,4; K₂HPO₄, 1,23; ácido ascórbico, 1,0; pH 7,1. El transporte de las muestras se realizó a 4 °C y su procesamiento antes de las 48 horas luego de recolectadas en campo.

Medios de cultivo
Para el aislamiento primario se empleó el medio sintético GT2L desarrollado por la CIC, el cual contiene (g/l): K₂HPO₄, 0,56; extracto de levadura, 1,0; peptona universal, 1,0; MgSO₄.7H₂O, 3,45; Na₂SO₄, 1,0; NaCl, 5,0; CaCl₂.2H₂O, 0,15; Fe(NH₄)₂(SO₄)₂.6H₂O, 0,392; lactato de sodio, 4 ml/l; pH 7,1. Para el mantenimiento de los aislados se empleó el medio del American Petroleum Institute ⁽¹⁾. Además se empleó un medio semisintético preparado con el agua de producción esterilizada por filtración y suplementada con (g/l): extracto de levadura, 0,5; peptona universal, 0,5; Na2SO4, 1,0; NaCl, 3,2; lactato de sodio, 4 ml/l. Para la preparación de los inóculos y la ejecución de las corridas experimentales en el biorreactor, se usó el medio de cultivo GT2L de mantenimiento (GT2Lm), el cual contiene (g/l): K₂HPO₄, 0,01; extracto de levadura, 1,0; peptona universal, 1,0; MgSO4.7H2O, 2,0; Na₂SO4, 0,63; NaCl, 5,0; FeSO₄. 7H₂O, 0,001; lactato de sodio, 5,18 ml/l; pH 7,3. La concentración del ión lactato en el medio alimentado se aumentó en un 45% con respecto al valor teórico necesario para la reducción de todo el sulfato presente en el sistema al iniciar la alimentación, con el fin de asegurar que no fuese un sustrato limitante.

Aislamiento y recuento
El aislamiento se llevó a cabo mediante siembra por agotamiento empleando los medios sintéticos y semisintéticos solidificados por adición de 15 g/l de agar-agar, incubados bajo atmósfera de anaerobiosis. El recuento se realizó mediante el método de extinción por dilución seriada (EDS) ⁽⁴⁷⁾. Se incubó a 32 °C por espacio de 30 días, con revisión e informe cada tres días. El promedio para todas las muestras procesadas fue de 106 bacterias por mililitro.

Caracterización y mantenimiento de cepas
A partir de las siembras en medio sólido se aislaron tres tipos diferentes de BSR (CIC-05, CIC-06 y CIC-07), las que se caracterizaron mediante la descripción de su morfotipo macro y microscópico, la presencia de enzimas, la utilización de sustratos y el crecimiento bajo diferentes valores de pH y de temperatura. El mantenimiento en el laboratorio se realizó por repiques sucesivos sobre caja de Petri por agotamiento y criopreservación a -70 °C con dimetilsulfóxido (DMSO) al 30% (50:50 v/v).

Cinética de crecimiento
Inicialmente se cultivó cada cepa aislada por separado en estado planctónico (libre o flotante) mediante estrategia de propagación tipo lote homogéneo simple, y posteriormente en estado sésil (adheridas a biocupones), bajo cultivo continuo tipo quimiostato. Para el desarrollo de todos los cultivos se empleó un biorreactor fabricado en la CIC de tipo continuo, fase única, con control y medición de temperatura, presión interna, pH, agitación, muestreo, alimentación y desfogue de medio de cultivo ^{(29, 45)}. Se empleó agitación axial mecánica con un mezclador tipo hélice a 60 rpm, y la alimentación del medio de cultivo se realizó mediante una bomba peristáltica a razón de 100 y 190 ml/h. La temperatura se ajustó a 32 °C mediante cámara de calentamiento, y luego se controló con un termómetro ubicado sobre la tapa del reactor. Para la inmovilización pasiva de las células bacterianas se emplearon biocupones prepesados de forma circular fabricados con acero al carbono API-5LX-65, con una preparación de superficie por Sand Blasting, 0,5 cm² de área expuesta, con un portabiocupón tipo RENA (Reusable Nonconventional Appliance) fabricado con teflón ⁽²⁾. La propagación tipo lote tuvo una duración de ocho días y cada una de las corridas con las tres BSR se realizó en cuatro oportunidades. Los cultivos continuos tipo quimiostato se realizaron durante 31, 32 y 33 días para las BSR-CIC-05, CIC-06 y CIC-07, respectivamente. La alimentación de medio fresco y el monitoreo del sistema se iniciaron cada tres días, cuando se alcanzó el nivel máximo de bacterias, según los datos generados en el cultivo lote.

Cinética de inhibición con molibdato y nitrato de sodio
Se desarrollaron ensayos preliminares sobre la base de la respuesta dosis-efecto para seleccionar la concentración inhibitoria mínima de molibdato y nitrato. Se ensayaron seis concentraciones de molibdeno (Na₂MoO₄.2H₂O, PM=241,95 g/mol): 2, 5, 10, 20, 25 y 50 mM, y seis concentraciones de nitrato (Na₂NO₃, PM=107,99 g/mol): 10, 20, 25, 50, 75 y 100 mM. Las corridas en el biorreactor fueron efectuadas con un cultivo mixto de BSR empleando la concentración inhibitoria mínima (nitrato: 75 mM y molibdeno: 5 mM), bajo las mismas condiciones de cultivo extrínsecas empleadas para establecer la cinética de crecimiento. El cultivo mixto de células libres fue evaluado diariamente por triplicado durante 10 días, adicionando las sales en el quinto día de cultivo. En el caso de la biopelícula formada en el quimiostato, las corridas tuvieron una duración total de 39 días con adición de las sales en el día 21 de cultivo. Una vez adicionadas las sales, se retiraron 7 biocupones en total cada 3 días, para evaluar las células adheridas y la tasa de corrosión.

Procedimientos analíticos
En las corridas efectuadas con el biorreactor se realizó el seguimiento de los siguientes parámetros:
(i) Concentración de ion sulfato. Se determinó la formación de sulfato de bario por método turbidimétrico, realizando las mediciones por duplicado con un rango de detección de 20 a 200 mg/l.
(ii) Concentración de sulfuro. Se estableció mediante técnica potenciométrica empleando un electrodo selectivo (Orion 96- 16 Ionplus Sure-Flow Solid State) para S2- y HS- disuelto. Todas las mediciones fueron realizadas por triplicado usando una solución fijadora de sulfuro. El rango de detección fue de 3,2 a 3200 mg/l de sulfuro disuelto.
(iii) Concentración de ion nitrato. Se determinó por medición colorimétrica de paranitrosalicilato sódico, que es directamente proporcional a la cantidad de nitrato en la muestra ⁽⁵⁸⁾.
(iv) Concentración de ion amonio. Se estableció mediante técnica potenciométrica empleando un electrodo selectivo (Orion 931801) para NH4+ disuelto. Todas las mediciones fueron realizadas por triplicado, con un rango de detección de 1,7 a 1700 mg/l de amonio disuelto.
(v) Medición gravimétrica de la velocidad de corrosión. Se realizó midiendo la pérdida de peso de los biocupones descritos en el numeral de cinética de crecimiento, los cuales fueron removidos a diferentes tiempos durante el curso de los cultivos en quimiostato. Teniendo en cuenta el peso perdido, el tipo de material y el tiempo y el área de exposición, se calculó la tasa de corrosión expresada en milésimas de pulgada por año (mpy, del inglés mils per year). Como control se usaron bio-cupones limpios colocados en medios de cultivo estériles contenidos en jarras de anaerobiosis y analizados luego de 33 y 39 días. Se realizó una inspección visual a 20X con una lupa estereoscópica (Leica MZ APO), para determinar la extensión del picado en la superficie: número de picados por unidad de área ^{(3, 46)}.
(vi) Valor de pH y presión interna. Las mediciones se realizaron con un electrodo doble unión para fermentación en línea, rellenable y autoclavable, ajustado a la tapa del reactor. La presión se controló con un manómetro, también ubicado en la tapa del biorreactor, de 0 a 100 psi.
(vii) Densidad poblacional de BSR. Se emplearon las siguientes técnicas:
- Extinción por dilución seriada (EDS). Los recuentos se realizaron por triplicado mediante diluciones progresivas 1:10, en donde el factor de extinción equivale a la cantidad de bacterias presentes expresadas en bacterias/ml ^{(1, 6, 4)}.
- Densidad óptica (DO). Cada muestra fue leída tres veces en un espectrofotómetro a 630 nm, y se informaron unidades de absorbancia (A) ^{(27, 65)}.
- Medición de ATP total (HY-LiTE II®-MERCK). Cuantifica la actividad biológica por medición luminométrica del ATP total. La luz emitida expresada como unidades relativas de luz (URL) es directamente proporcional a la cantidad de bacterias presentes en la muestra. El buen estado del equipo, los reactivos y el correcto procedimiento se verificaron mediante la utilización de patrones de 10 ng/ml de ATP suministrados por el fabricante.
- Medición de actividad hidrogenasa de BSR (Hydrogenase Test®-Caproco). La actividad enzimática es informada en rangos (negativa, débil, moderada y fuerte), expresada en nM de hidrógeno transformado por minuto (nM H₂/min). El buen estado de los reactivos y correcto procedimiento se verificaron mediante la utilización de controles negativos (agua desionizada estéril y cepa BPA CIC-01-E. coli) y controles positivos, representados por las BSR CIC-09, CIC-12 y CIC- 63, pertenecientes al cepario de la CIC.
- Determinación de BSR por enzimoinmunoensayo (RapidChek II®-Strategic Diagnostic Inc.). Emplea anticuerpos policlonales purificados para detectar la enzima adenosin-5'-fosfosulfato (APS) reductasa, común a todas las BSR. En términos generales, se considera que la cantidad de enzima presente es directamente proporcional a la cantidad de bacterias viables capaces de producir biocorrosión. Los resultados se expresan en bacterias/ml. Se aplicaron los mismos controles descritos para la prueba anterior.
- Determinación de actividad bacteriana total por microscopía de epifluorescencia en biopelículas. Se realizó el recuento directo de células bacterianas coloreadas con naranja de acridina mediante un microscopio de epifluorescencia (Eclipse E400 Nikon Corporation) ⁽⁵⁾. Como control negativo se empleó agua tipo 1A filtrada dos veces a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2 µm, y como control positivo la BSR CIC-09. La biopelícula fue removida sumergiendo los biocupones en PBS y aplicando ultrasonido (35 kHz durante 2 minutos). Las células suspendidas fueron filtradas sobre una membrana de policarbonato y contadas por EDS.

Bioensayos de toxicidad aguda
Se cuantificó la concentración letal sobre especies acuáticas bajo corta exposición (24 a 48 horas), para un biocida convencional y para la sal de molibdato evaluada, siguiendo la metodología propuesta por el Instituto Colombiano del Petróleo, ICP.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Caracterización y mantenimiento de cepas
Las BSR empleadas en la investigación forman parte actualmente del cepario de la CIC, y los resultados de su caracterización se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Caracterización de las BSR aisladas de agua de producción de un sistema de gas natural.

Procedimientos analíticos
Al comparar los resultados de las diferentes técnicas empleadas para realizar el seguimiento individual de las BSR durante los cultivos lote y continuo, se encontró que:
(i) Extinción por dilución seriada (EDS). Tiene un alto grado de precisión y reproducibilidad, por lo que se considera el Gold Standard para la valoración de procesos de biocorrosión en sistemas industriales ^{(1, 47)}. Su mayor limitación es el prolongado tiempo de respuesta y su representatividad, dependiente de la cultivabilidad de las BSR en medios de cultivo artificiales. Sin embargo, con base en las observaciones del estudio, es posible obtener resultados parciales confiables a los doce días luego de la incubación y no es necesario esperar los 28 días recomendados por norma.
(ii) Densidad óptica. Poblaciones inferiores a 104 bacteria/ ml no pueden ser cuantificadas por este método. Es útil para el seguimiento de la etapa inicial y media de un cultivo, pero no para la fase estacionaria y/o de declive, ya que las BSR muertas también absorben luz por lo que interfieren en el registro espectrofotométrico.
(iii) Medición de ATP total. Existe una gran dispersión sin reproducibilidad en estos resultados. No se halló una relación directamente proporcional constante entre los niveles de ATP detectados y la cantidad de bacterias viables presentes, posiblemente porque la cantidad de ATP varía según la fisiología y el estado de activación metabólica de las bacterias. De acuerdo con los resultados de este estudio y de otros autores ⁽⁷⁾, no hay consistencia al comparar las URL obtenidas a partir de cultivos bacterianos diferentes con el mismo recuento obtenido por EDS.
(iv) Medición de actividad hidrogenasa de BSR. Esta enzima puede acelerar los procesos de corrosión por la despolarización del cátodo, al catalizar una oxidación reversible del hidrógeno molecular a protonado (H₂ → H₃O⁺ +2e-) ⁽⁵⁹⁾. Por esta razón, durante mucho tiempo su detección ha sido considerada una valiosa herramienta para predecir la aparición de la biocorrosión. Sin embargo, trabajos recientes han informado que en sitios con una alta tasa de corrosión se han aislado BSR hidrogenasa negativas ⁽¹⁷⁾, y otros autores han observado una tasa de corrosión acumulada alta (0,44 mm/año), sin actividad hidrogenasa alguna ⁽¹¹⁾. Lo anterior coincide con nuestros resultados durante las evaluaciones de las velocidades de corrosión, donde no se encontró relación directa entre la aparición de actividad enzimática hidrogenasa y aumento del ataque al metal, de acuerdo con las mpy medidas. Por otra parte, se debe tener en cuenta que aunque la gran mayoría de las bacterias sulfurogénicas poseen esta enzima, su expresión y actividad pueden estar sujetas a mecanismos de represión o inducción poco conocidos. Bryant et al. ⁽¹¹⁾ plantean que el mecanismo de control de expresión enzimática es un cambio metabólico de quimioorganótrofo a quimiolitótrofo, debido a la presencia en el medio de muy bajos niveles de fuentes de carbono (lactato y acetato), lo que obliga a la BSR a emplear el hidrógeno producido catódicamente como una fuente de energía alternativa. Sin embargo, esta afirmación no coincide con los resultados de esta investigación, ya que las BSR evaluadas mostraron en algunos casos una fuerte actividad enzimática, a pesar de ser cultivadas en un medio con 3200 ppm de lactato de sodio, concentración muy superior a la encontrada en las cabezas de pozo (1000 ppm en promedio) ⁽³⁴⁾. En conclusión, una población de BSR puede ser alta sin que esto implique la activación de la enzima hidrogenasa, y ésta puede estar activa sin que esto implique necesariamente un aumento de la agresividad del ataque al metal.
(v) Determinación de BSR por enzimoinmunoensayo. El principal inconveniente de esta prueba es el limitado rango, que no permite detectar poblaciones inferiores a 10³ y superiores a 10⁶ bacterias/ml. Sin considerar las muestras con concentraciones fuera del rango, se encontró buena correlación entre la cantidad de BSR estimada por EDS y la determinada por este kit, con la ventaja de que este último es un método rápido y sencillo, aplicable bajo las condiciones de campo.
(vi) Determinación de actividad bacteriana total por microscopía de epifluorescencia. Esta prueba es bastante dispendiosa por el tiempo que insumen la preparación de la muestra y el recuento de las bacterias en el microscopio. Además, tiene un límite de detección de 10⁴ bacterias/ ml. Sin embargo, teniendo en cuenta que la variación entre sus resultados y la EDS se considera despreciable, al ser en la mayoría de los casos de un orden de magnitud o como máximo de dos órdenes, se puede considerar que esta técnica permite valorar en forma confiable las biopelículas integradas por BSR.

Cultivos lote y quimiostato individuales de BSR
Los resultados analizados para cada cepa son el promedio de los obtenidos durante todas las corridas efectuadas en cada caso. Luego del tratamiento matemático de los datos experimentales a partir de los cuales se generaron curvas que correlacionan la concentración de bacterias con el tiempo (Figura 1), se concluyó que la velocidad de crecimiento de las cepas estudiadas corresponde a una cinética de reacción de orden 1, lo que significa que esta velocidad es directamente proporcional a la concentración de bacterias detectadas en el biorreactor. Bajo esta estrategia y con las condiciones de experimentación definidas, las tres curvas individuales de crecimiento bacteriano se dividen en dos fases: crecimiento y declive. En la Tabla 2 se presenta un resumen de los parámetros de crecimiento y cultivo en lote de las tres cepas. Por otra parte, en términos generales se observó una tendencia a la alcalinización del medio durante las corridas, que concuerda con lo informado según la teoría de la despolarización del hidrógeno catódico de las celdas de corrosión y la biotransformación de sulfato en sistemas industriales (Figura 2). Con respecto al proceso de inmovilización de células, en los cultivos continuos se observó que éste es independiente de la cantidad de bacterias planctónicas. La formación pasiva de la biopelícula está mediada principalmente por mecanismos inherentes a la fisiología y actividad metabólica de los microorganismos, ya que bajo las mismas condiciones extrínsecas de crecimiento, preparación de superficie y tipo de material metálico, la velocidad de formación, el proceso de maduración y crecimiento de las BSR sésiles difiere de una cepa a otra (Figura 3).

Figura 1. Crecimiento de las BSR en cultivo lote.

Tabla 2. Parámetros de crecimiento y cultivo individual en lote de BSR aisladas.

Figura 2. Comportamiento del pH en cultivos lote individuales.

Figura 3. Inmovilización de BSR sobre biocupones en cultivos continuos.

Influencia de la concentración de sulfato sobre la reducción del nitrato
La enzima nitrato reductasa que contiene molibdeno y es sintetizada en condiciones de anoxia total, es inducida por nitrato y reprimida por sulfato ⁽¹⁶⁾. Por lo tanto, y según los resultados de las pruebas de concentración inhibitoria mínima obtenidos en este estudio, es necesario que la concentración de nitrato sea por lo menos seis veces superior a la de sulfato. Bajo estas condiciones, las BSR efectúan la reducción del nitrato y se observa una disminución de la cantidad de sulfuro disuelto, lo que puede o no estar ligado con una disminución en la cantidad de bacterias, tal como también fue encontrado por Nemati et al. ⁽⁴⁸⁾.

Influencia de la concentración de sulfuro sobre la reducción del nitrato
Según McCready et al. ⁽⁴⁴⁾, el sulfuro a razón de 0,7 mM puede ser inhibitorio para la vía de la reducción del nitrato y el crecimiento de Desulfovibrio sp, cuando el cultivo se realiza con 5 mM de nitrato como aceptor final de electrones. Sin embargo, en este estudio la adición de 75 mM de ion nitrato al cultivo mixto de BSR en estado planctónico y sésil, con un promedio de 4,25 mM de sulfuro, sí indujo la reducción del nitrato, como lo evidencia el consumo de este ion y la reducción en un 80% de la cantidad de sulfuro disuelto.

Influencia del nitrato sobre la sulfato-reducción
En el cultivo lote, la adición de 75 mM de nitrato produjo un cambio en el tipo de aceptor final de electrones empleado, ya que la concentración de sulfato se mantuvo constante mientras que el nitrato fue consumido a razón de 4,3 mM NO₃-/día. Este cambio estuvo acompañado de una reducción del sulfuro disuelto de alrededor del 80% y de una reducción en la población libre de cuatro órdenes de magnitud (Figura 4). En el quimiostato el comportamiento fue similar: existe un cambio permanente en el aceptor final de electrones empleado, ya que la concentración de sulfato se mantiene constante mientras que el nitrato es consumido en un 55% a razón de 2,2 mM NO₃ -/día; esto se acompaña de una reducción del sulfuro disuelto de alrededor del 80% y de una disminución de las células flotantes de cinco órdenes de magnitud (Figura 5). Para la biopelícula generada sobre los cupones sólo se observó una disminución de dos títulos bacterianos. De acuerdo con los potenciales de reducción, el par NO₃ -/NO₂ - (+0,43 E_o´V) es un aceptor de electrones más favorable que el par SO₄ ^2-/HSO₃ - (-0,52 E_o´V), por lo que el rendimiento energético y de crecimiento es mayor cuando se cultiva con nitrato como aceptor final de electrones ⁽⁴⁰⁾. Por lo tanto, se esperaría que las BSR exhibieran una tasa de crecimiento mayor y que no se presentara la disminución observado en el título poblacional. Una explicación a este fenómeno es que las BSR están adaptadas al consumo de sulfato: de hecho, éste se consume a mayor velocidad (4,7 mM SO₄ ^2-/día) que el nitrato (4,3 mM NO₃ -/día) durante el cultivo lote, y las bacterias pueden experimentar un aumento del tiempo de duplicación debido al cambio de vía metabólica de sulfato a nitrato reducción, lo que puede causar una fase de latencia en el crecimiento de hasta cuatro días, mientras se produce la activación de la nitrato reductasa ⁽¹⁶⁾. En conclusión, el decrecimiento de la concentración de sulfuro y la población bacteriana luego de la adición del nitrato fue progresivo y lento, y podría ser entonces el resultado, no de un proceso de inhibición sino de adaptación metabólica, que es necesario dilucidar con estudios bioquímicos adicionales.

Figura 4. Influencia del nitrato sobre el cultivo lote mixto de BSR en estado planctónico.

Figura 5. Influencia del nitrato sobre el cultivo continuo mixto de BSR en estado planctónico.

Producto final de la nitrato reducción por BSR
El grupo de microorganismos estudiados sigue la ruta de reducción de nitrato a nitrógeno gaseoso (desnitrificación) y no la de nitrato a amonio (nitratoamonificación). Esto se concluye teniendo en cuenta el aumento de la presión interna del biorreactor luego de la adición del nitrato y que no se detectó amonio por medición con el electrodo de ión selectivo ni un aumento marcado en el valor de pH, lo que sugeriría la formación de NH₄ +.

Producción de sulfuro e influencia sobre la sulfato-reducción
El sulfuro es un precursor que genera los iones necesarios (HS- y H₃O⁺) para el ataque localizado inicial y/o la formación de FeS, que posteriormente se deposita sobre el metal, y una concentración de 3,12 mM se considera crítica para sistemas de producción de petróleo ⁽⁵⁹⁾. El promedio de la concentración máxima de sulfuro disuelto producido por las tres cepas al ser cultivadas por separado fue de 5,7 y 4,2 mM en estado planctónico y sésil, respectivamente. Para los cultivos mixtos, el promedio de sulfuro disuelto antes de la adición de las sales de nitrato y molibdato fue de 5,1 mM para células libres y de 3,3 mM para la biopelícula. Por lo tanto, la actividad individual y en asociación de las BSR aisladas tiene un alto potencial de generar corrosión mediada microbiológicamente. Con respecto a la inhibición producida por la sulfato-reducción, la información disponible sobre la toxicidad real del sulfuro es vaga. Algunos investigadores informan la inhibición basados en el sulfuro total ^{(15, 31)} y otros en el sulfuro no disociado ^{(42, 43)}, teniendo en cuenta que las bacterias tienen dos niveles umbrales de inhibición que dependen del pH: uno para el H₂S no disociado y otro para el sulfuro disuelto ⁽⁵¹⁾. Algunos informes plantean que el sulfuro es absorbido dentro de la célula y destruye proteínas, lo que provoca inactivación celular ⁽¹²⁾. Si este planteamiento fuese cierto, las BSR no podrían recuperar su actividad una vez que el sulfuro es removido, tal como lo demuestra la experimentación en biorreactores ⁽⁵⁷⁾. Otra teoría establece que la inactivación de las BSR obedece a la ausencia de elementos metálicos traza, fundamentales para su desarrollo y que precipitan en forma de sulfuros metálicos ⁽⁹⁾. En el caso particular de este estudio, se tomaron como parámetros de inhibición/toxicidad por sulfuro el crecimiento celular, la reducción del sulfato y el efecto de las formas de sulfuro presentes, las cuales, según el valor de pH registrado en las diferentes corridas del biorreactor (7,1 a 8,1), deben ser formas disociadas (HS^- y S^-2) en un 70% y no disociadas (H₂S) sólo en un 30%. Se concluye que esta inhibición no se observó, en concordancia con lo hallado por otros autores ^{(52, 57)}, según los cuales el proceso de respiración celular con sulfato como aceptor final de electrones se puede ver inhibido con concentraciones de sulfuro superiores a 15 mM.

Influencia del molibdato sobre la sulfato-reducción
El molibdato altera el crecimiento celular al competir en el sistema de transporte de sulfato interfiriendo con la formación de adenosin fosfosulfato (APS) por parte de la enzima ATP sulfurilasa, que cataliza el primer paso en la vía de reducción desasimilatoria del sulfato ^{(54, 38)}. Es así como en el cultivo lote, la adición de 5 mM de molibdato produjo un bloqueo completo de la sulfato-reducción y disminuyó hasta niveles no detectables la cantidad de sulfuro disuelto y la población bacteriana (Figura 6). En el quimiostato el comportamiento fue similar: ausencia de consumo de sulfato y producción de sulfuro, con una reducción a niveles no detectables de las bacterias planctónicas (Figura 7). En el caso de las BSR adheridas en forma de biopelículas sobre los cupones, se obtuvo una disminución de seis órdenes de magnitud. La inhibición de la producción de sulfuro con concentraciones menores de molibdato fue también encontrada por Nemati et al. ⁽⁴⁹⁾, por lo que se concluye que su eficiencia depende de la composición y del estado metabólico de la comunidad microbiana.

Figura 6. Influencia del molibdato sobre el cultivo lote mixto de BSR en estado planctónico

Figura 7. Influencia del molibdato sobre el cultivo continuo mixto de BSR en estado planctónico.

Velocidades de corrosión de BSR en cultivos individuales En la Tabla 3 se muestran las tasas de corrosión promedio determinadas para cada una de las BSR aisladas. Los resultados muestran un proceso activo de disolución metálica del acero al carbono, que es proporcional a la cantidad de microorganismos (según blanco de control), que concuerda con los obtenidos en otros estudios (17 a 35 mpy) ^{(11, 18, 59)} y que se considera severo (> 10 mpy) ⁽⁴⁶⁾. El ataque bacteriano se da en tres etapas: (a) adsorción de células y productos metálicos de corrosión (siderita, magnetita, pirita y mackinawita) que generan microceldas de corrosión galvánica, las cuales producen un pico de penetración de hidrógeno ^{(37, 23)}; (b) pasivasión del metal por formación de una película de sulfuros metálicos y biopolímeros; y (c) proceso corrosivo severo localizado bajo los depósitos bacterianos ⁽⁵⁹⁾. Teniendo en cuenta el segundo paso, las variaciones en la tasa de corrosión al inicio y al final del cultivo, y que se emplearon las mismas condiciones extrínsecas de crecimiento, se puede concluir que el ataque está determinado principalmente por las características meta-bólicas y fisiológicas intrínsecas de cada bacteria. Con respecto a la densidad de picado, se observa que este parámetro también muestra una corrosión excesiva (> 2.E+02 picado/ m²) ⁽³³⁾, pero no refleja el aumento de la tasa de corrosión general, de lo que se concluye que el tamaño y profundidad del picado (parámetros no medidos) son el mecanismo determinante para la expansión del ataque bacteriano (corrosión bajo depósitos).

Tabla 3. Tasas de corrosión promedio de cada BSR aislada en cultivo continuo.

Velocidades de corrosión de BSR en cultivos mixtos
En la Tabla 4 se muestran las tasas de corrosión promedio determinadas para el cultivo mixto de BSR aisladas y el efecto de la adición de las sales. Se presentó un aumento de aproximadamente 59% en la tasa de corrosión máxima promedio producida por el cultivo mixto de BSR con respecto a los cultivos individuales, lo que evidencia una actividad sinérgica y aditiva en la bioca-tálisis de la corrosión. La disminución en la cantidad de bacterias viables descrita para el molibdato mostró una notable incidencia sobre la tasa neta de corrosión: se pasó de una tasa de corrosión considerablemente severa a una moderada, lo que equivale a una reducción del 88% ⁽³⁾. En el caso del nitrato, hubo un cambio menos significativo (reducción del 57%) en la tasa de corrosión, tal como se esperaba según la leve reducción en la población lograda con esta sal. Como se observa, no hubo cambios en la cantidad de defectos registrados por unidad de área al inicio y al final de las corridas; por lo tanto, se refuerza lo afirmado para los cultivos individuales, en el sentido de que el incremento de la tasa de corrosión depende principalmente del aumento en la profundidad y tamaño de los daños y no de su cantidad. Finalmente, en términos generales la inspección visual de todos los biocupones expuestos a los cultivos individuales y mixtos de BSR reveló la misma morfología de daño: pérdida de metal agrupada superpuesta sobre una depresión de mayor tamaño, con forma redondeada. El daño se desarrolló justo debajo de los depósitos, con una expansión concéntrica circular con respecto al cúmulo de bacterias. El defecto se caracteriza, además, por presentar excavaciones con bordes definidos, redondeados, no angulosos, tipo sacabocado, agrupados a manera de panal de abejas. La morfología de este daño coincide con la descrita en la literatura para los cultivos de BSR sésiles ^{(11, 30)}.

Tabla 4. Tasas de corrosión promedio del cultivo continuo mixto de BSR aisladas.

Bioensayos de toxicidad aguda
Se realizaron empleando un cladócero (Daphnia pulex) y un alga unicelular (Scenedesmus cf. subspicatus). Para el glutaraldehído, uno de los biocidas convencionales comúnmente empleado, se obtuvo una concentración letal 50 (CL50) para D. pulex de 65 ppm y una concentración efectiva 50 (CE50) para S. cf. subspicatus de 320 ppm. Para el molibdato de sodio, se registró una CL50 para D. pulex de 981 ppm y una CE50 para S. cf. subspicatus de 2000 ppm. Las concentraciones letales encontradas de molibdato de sodio para los cladóceros y las algas son 15 y 6,2 veces más altas que las encontradas para el glutaraldehído, respectivamente.
Teniendo en cuenta que la concentración comúnmente aplicada como tratamiento para el control del desarrollo de microorganismos en agua de producción es mayor a 200 ppm, se puede considerar que la disposición final de los residuos que contienen glutaraldehído a un cuerpo de agua representa una seria amenaza para los productores de los ecosistemas acuáticos (microalgas) y los consumidores primarios (zooplancton), quienes son la base de los ecosistemas acuáticos. En el caso del molibdato, la concentración mínima efectiva está muy por debajo de aquellas que producen algún tipo de daño ambiental, según los ensayos de ecotoxicidad en los que se emplean estos bioindicadores de contaminación. Esto reduciría el impacto ambiental generado por los procesos de control químico tradicionales.

Agradecimientos: la CIC agradece el apoyo prestado por el Programa Nacional de Ciencias Básicas del Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología "Francisco José de Caldas", COLCIENCIAS.

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Recibido: 13/11/06
Aceptado: 04/12/07