En su revisión, publicada en esta revista, el Dr. Pablo Goldschmldt describe las limitaciones de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR) para detectar el coronavirus asociado a síndrome respiratorio agudo grave 2 (SARS-CoV-2), cuando se la utiliza como única prueba de infección y evaluación del riesgo para la salud pública1. En la práctica clínica, la técnica se considera como referencia para la detección de genoma viral en la fase aguda de la infección. Pero no es lo mismo detectar genoma viral que diagnosticar una enfermedad. La PCR puede ser excelente para detectar secuencias del virus, pero no para hacer diagnóstico de enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). Evidencia de esto es la gran cantidad de resultados positivos obtenidos en personas sanas. Se estima que una tercera parte de las infecciones por SARS-CoV-2 son asintomáticas, y que casi tres cuartas partes de las personas que reciben un resultado positivo de PCR y no presentan síntomas en el momento del testeo, permanecerán asintomáticas2. Por otro lado, en personas con síntomas respiratorios inespecíficos, considerar que el hallazgo de una secuencia viral establece causalidad tampoco es correcto, dado que no se realiza una búsqueda sistemática con la misma técnica de todos los otros posibles patógenos que pueden presentar el mismo cuadro clínico. Algunos agentes virales conocidos asociados a enfermedad respiratoria en seres humanos incluyen los virus sincitial respiratorio, parainfluenza, influenza A y B, adenovirus, coronavirus, ri-novirus, metapneumovirus y bocavirus3. Además, se han detectado poliomavirus en pacientes con cuadros respiratorios4. Por otro lado, afecciones como fiebre, diarrea y enfermedades respiratorias pueden ser causadas por virus desconocidos o no diagnosticados5. Algunos cuadros alérgicos también producen síntomas similares.
Es crucial interpretar de manera correcta un resultado positivo cuando la PCR se aplica al diagnóstico de enfermedades infecciosas, aun cuando en términos estrictamente técnicos, sea un verdadero positivo. El diagnóstico molecular para detectar microorganismos de importancia en la práctica clínica significó una gran revolución por sus ventajas en comparación con métodos tradicionales de cultivo microbiológico, principalmente en el acortamiento de los tiempos en el diagnóstico y en la practicidad. Sin embargo, desde su uso en este ámbito, también se reconocieron las principales limitaciones. Un punto crucial es que su sensibilidad de detección excede en muchos casos la significancia clínica. Los ensayos de PCR pueden detectar patógenos en concentraciones por debajo de los métodos considerados de referencia. Distinguir si un resultado representa un falso positivo y establecer su importancia clínica fue y sigue siendo un desafío. Para definir si tales hallazgos indican latencia, procesos de enfermedad o colonización subclínica se requieren pautas interpretativas basadas en la correlación de resultados con la clínica y con las normas existentes, antes de utilizarlos para decisiones de diagnóstico y tratamiento6.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) definió como caso confirmado de COVID-19 a toda persona con infección por el virus confirmada en laboratorio, con independencia de los signos y síntomas clínicos7. También estableció que la confirmación de la infección aguda por SARS-CoV-2 se basa en la detección de secuencias virales mediante pruebas de amplificación de ácidos nucleicos, y que para el testeo deben recolectarse principalmente muestras respiratorias8.
En microbiología, la jerarquización de un resultado positivo depende de factores como el contexto clínico y epidemiológico, el sitio de toma de muestra y, en muchos casos, la cuantificación del patógeno. La definición de un diagnóstico se complementa con estudios generales de laboratorio (como hemograma y marcadores de inflamación de fase aguda) y otros, como los estudios por imágenes.
La complejidad de la interpretación de un resultado positivo de PCR para agentes microbianos es mayor al tener en cuenta que la detección de secuencias genéticas en un sitio anatómico no estéril, como es el tracto respiratorio, no necesariamente implica la presencia de partículas virales completas, infectivas y capaces de transmitirse a otras personas. En la estrategia de testeos masivos aplicada para detección de SARS-CoV-2 por PCR, es aún más difícil jerarquizar los resultados, dado que se han obtenido en contextos clínicos y epidemiológicos variables, a diferencia de la vigilancia tradicional de virus respiratorios como el virus influenza, donde el análisis de una muestra por PCR u otra técnica solo se realiza ante la sospecha clínica en un paciente sintomático.
En la rRT-PCR, un parámetro fundamental que debe considerarse cuando una muestra presenta señal, es el valor de ciclo umbral (Ct, por su sigla en inglés). Este se define como el número de ciclos de amplificación necesarios para que la señal de fluorescencia del producto generado en la reacción cruce un valor umbral determinado9. El Ct proporciona una medida relativa de la concentración de la secuencia diana en una muestra y de su interpretación depende la clasificación de una persona como positiva o negativa y, por lo tanto, como caso confirmado o no, con todas las consecuencias epidemiológicas y socioeconómicas que ello implica, tanto en el nivel individual como comunitario.
En uno de sus documentos, la OMS informa que el Ct necesario para detectar virus es inversamente proporcional a la carga viral del paciente10. Es importante destacar que muchos factores influyen en el valor de Ct, además de la cantidad real de copias de secuencia diana presentes. La toma de muestra es crítica y de su correcta realización depende que el resultado refleje, en mayor o menor medida, la carga viral del paciente. A diferencia de muestras como, por ejemplo, el plasma, en las que se puede partir de un volumen definido, en las muestras respiratorias hay mayor variabilidad, y estandarizar el volumen de secreción obtenido con hisopo o por lavado bronco alveolar es mucho más difícil y depende de múltiples factores técnicos. Otras variables que afectan el Ct incluyen la forma de establecer la línea umbral en cada corrida, los diferentes equipos de extracción de material genético, el tipo de PCR utilizada (sean de uso doméstico o kits comerciales que detectan diferentes regiones genéticas), y la combinación de estos dos últimos factores, que puede incluso cambiar en cada laboratorio en el tiempo, según su disponibilidad en el mercado. Todas estas variables dificultan la comparación inter e intralabo-ratorio para definir puntos de corte.
Si bien es difícil predecir en qué proporción influyen todos estos factores en los valores de Ct, es necesario evaluar la capacidad de la técnica para diferenciar entre personas infectadas e infecciosas de las que no lo son, con una certeza razonable, para evitar el aislamiento de aquellas que no representan una amenaza para la salud pública. Un cuerpo creciente de evidencia muestra que tal objetivo no puede lograrse con precisión mediante el abordaje binario de resultados de PCR positivos o negativos. Una revisión de la Universidad de Oxford evaluó estudios que comparan el cultivo del SARS CoV-2 en líneas celulares (considerado el mejor indicador de infección e infectividad) con los resultados de la rRT-PCR11. En uno de ellos, donde se usó como diana el gen E, se observa que todas las muestras con valores de Ct de 13 a 17 tuvieron resultados positivos en el cultivo. La tasa de recuperación viral disminuyó en forma progresiva hasta 12% para un Ct de 33. No se obtuvo cultivo positivo a partir de muestras con Ct >3412. En otro estudio se encontró infectividad de células Vero solo en muestras con Ct menor a 2413.
Sobre la base de estos datos, puede inferirse que, según el protocolo utilizado, una mayor o menor proporción de resultados informados como positivos en función del punto de corte del Ct considerado en cada laboratorio serían falsos positivos, dado que no corresponden a muestras infectivas. La interpretación de la rRT-PCR no validada contra el cultivo viral propicia falsos positivos que implican el aislamiento de muchas personas que no están enfermas ni son infecciosas11.
Otro aspecto para considerar son los valores predicti-vos de una prueba diseñada para auxiliar en el diagnóstico de una patología. Al aplicar una prueba, necesitamos saber la probabilidad de que su resultado indique el diagnóstico correcto. La sensibilidad y la especificidad determinadas por el fabricante o diseñador no dan esa información. Los valores predictivos positivo y negativo (VPP y VPN, respectivamente) en la práctica clínica dependen críticamente de la prevalencia de la condición en la población testeada, que puede ser diferente a la de un estudio publicado que evalúe la utilidad de la prueba14.
Es de esperar que el desempeño y los valores predictivos de la PCR cambien en cada escenario donde se aplica: el manejo clínico de la COVID-19, las investigaciones de conglomerados de casos y la vigilancia de salud pública15. Por ejemplo, en pacientes internados, la técnica puede tener un menor VPN y ante una alta sospecha clínica con una prueba negativa, la conducta es repetir el análisis con otro método o tomar una nueva muestra. En cambio, en los testeos de personas ambulatorias sin síntomas o con cuadros clínicos inespecíficos atribuibles también a otros patógenos o causas no investigadas con la misma intensidad que SARS-CoV-2, se prevé un VPP menor. Dado que las pruebas positivas obtenidas en circunstancias tan variadas se consideran de manera equivalente como casos confirmados, puede haberse producido una sobrestimación de casos reales de enfermedad COVID-19, principalmente en función de la utilización de la técnica en la población general, fuera del circuito clínico tradicional de vigilancia de virus respiratorios.
Varias medidas pueden ayudar a minimizar los resultados falsos y las posibles consecuencias. En los laboratorios de diagnóstico, es fundamental el entrenamiento del personal y la realización de controles de calidad internos y externos. En centros de referencia con capacidad para realizar cultivo viral, se recomienda evaluar su correlación con los valores de Ct por PCR para definir niveles de corte predictivos de infectividad, como se aconseja en la revisión de Heneghan11.
DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERESES: No hubo conflicto de intereses durante la realización del editorial.