Alcanos lineales de la cera cuticular de hojas de Populus alba, Populus deltoides (Salicaceae), Robinia pseudoacacia (Fabaceae), Ulmus pumila (Ulmaceae) y Fraxinus americana (Oleaceae) en Tandil, Buenos Aires, Argentina

María L. Bakker & Patricia I. Alvarado

Facultad de Ciencias Veterinarias, UNPCBA, Pinto 399, 7000 Tandil, Buenos Aires, Argentina; bakker@vet.unicen.edu.ar (autor corresponsal).

Resumen. Bakker M.L. & P.I. Alvarado. 2006. Alcanos lineales de la cera cuticular de hojas de Populus alba, Populus deltoides (Salicaceae), Robinia pseudoacacia (Fabaceae), Ulmus pumila (Ulmaceae) y Fraxinus americana (Oleaceae) en Tandil, Buenos Aires, Argentina. Darwiniana 44(1): 58-63.
     Se coleccionaron hojas maduras de ejemplares adultos de Populus alba, Populus deltoides, Robinia pseudoacacia, Ulmus pumila y Fraxinus americana del Campus Universitario, Tandil, Buenos Aires, Argentina (37° 19’S, 59° 08’O) en febrero de 2004. La cera cuticular fue extraída, purificada, y el contenido y proporción relativa de n-alcanos de número impar de carbonos (C₂₃→C₃₅) fue cuantificado mediante cromatografía gas-líquido capilar. La concentración total de n-alcanos (mg/kg MS) fue P. alba (6935) > Robinia (1571) > P. deltoides (1379) > Ulmus (880) > Fraxinus (467). Los n-alcanos más abundantes en todas las especies fueron C₂₇ y C₂₉ que constituyeron entre 10 y 51% y entre 35 y 76% del total respectivamente, excepto en Fraxinus donde los más abundantes fueron C₂₉ y C31 que constituyeron el 31 y 49% del total respectivamente. P. alba y P. deltoides difirieron no solo en la concentración total de n-alcanos sino también en la proporción relativa de C₂₇ y C₂₉, siendo C₂₉ el n-alcano más abundante en la segunda especie (76%) igual que en Robinia (75%). La presencia de n-alcanos de número par de carbonos no fue detectable o resultó muy baja en general en todas las especies, con excepción de C₂₆, C₂₈ y C₃₀, este último se destacó particularmente en Fraxinus.

Palabras clave. Populus;Robinia;Ulmus;Fraxinus; Alcanos lineales; Cera cuticular.

Abstract. Bakker M.L. & P.I. Alvarado. 2006. Cuticular wax linear alkanes in leaves of Populus alba, Populus deltoides (Salicaceae), Robinia pseudoacacia (Fabaceae), Ulmus pumila (Ulmaceae) and Fraxinus americana (Oleaceae) from Tandil, Buenos Aires, Argentina. Darwiniana 44(1): 58-63.
     Mature leaves of adult individuals of Populus alba, Populus deltoides, Robinia pseudoacacia, Ulmus pumila and Fraxinus americana from the University Campus, Tandil, Buenos Aires, Argentina (37° 19’S, 59° 08’W) were collected on February 2004. The cuticular wax was extracted, purified, and the content and relative proportion of odd-carbon numbered n-alkanes (C₂₃→C₃₅) was quantified by capillary gas-liquid chromatography. Total concentration of n-alkanes (mg/kg DM) were P. alba (6935) > Robinia (1571) > P. deltoides (1379) > Ulmus (880) > Fraxinus (467). Most abundant n-alkanes in all species were C₂₇ and C₂₉ accounting for 10-51% and 35-76% of total, respectively, except Fraxinus where most abundant were C₂₉ and C31 accounting for 31% and 41% of total, respectively. P. alba and P. deltoides differed not only in total concentration of all n-alkanes but also in relative proportion of C₂₇ and C₂₉, being C₂₉ the most abundant in the latter species (76%) as well as in Robinia (75%). The occurrence of even-carbon numbered n-alkanes was either undetectable or very low in all species in general, except for C₂₆, C₂₈ and C₃₀, the latter being prominent in Fraxinus.

Keywords. Populus;Robinia;Ulmus;Fraxinus; Linear alkanes; Cuticular wax.

Original recibido el 30 de marzo de 2005;
aceptado el 15 de noviembre de 2005.

INTRODUCCIÓN

     La parte aérea de las plantas está cubierta por cutícula cerosa compuesta principalmente por n-alcanos de cadena larga, alcoholes, cetonas y ésteres, incluyendo además triterpenoides, esteroles y flavonoides en menor cantidad. Las caracteuna rísticas físicoquímicas de la cera determinan funciones vitales para las plantas como la reducción de la pérdida de agua no estomática, reducción del depósito de polvo, polen y contaminantes ambientales, protección contra la radiación ultravioleta, bacterias y hongos, y participación en una variedad de interacciones con los insectos (referencias citadas en Kunst & Samuels, 2003). Los n-alcanos más abundantes en la mayoría de las plantas superiores son los de número impar de carbonos en el rango de C₂₁ a C₃₅ y tanto la concentración como la proporción relativa están determinadas genéticamente, por lo que pueden diferir marcadamente entre distintas especies y dentro de una misma especie, aunque también se observan diferencias entre partes morfológicas de una misma planta y variaciones relacionadas con la edad, el desarrollo y las condiciones ambientales (Dove & Mayes, 1996; Dove et al., 1996; Post-Beittenmiller, D. 1996; Cameron et al., 2002; Maffei et al., 2004 y referencias citadas en estos tres últimos). Los n-alcanos de cadena larga son prácticamente indigestibles para la mayoría de los mamíferos herbívoros y se excretan cuantitativamente en las heces, de manera que las diferencias que existen en la proporción relativa de n-alcanos entre especies y partes de planta permiten estimar las proporciones de las mismas en la dieta de los animales que las ingieren (Mayes & Dove, 2000).
     El objetivo de este trabajo fue la identificación de un material vegetal abundante, de fácil obtención, que posea una alta concentración de n-alcanos de cadena larga y en una proporción relativa tal que, adicionando pequeñas cantidades del mismo a un alimento con bajo contenido de n-alcanos, permita distinguirlo de otros componentes vegetales de la dieta. Los resultados de este trabajo brindan además información original sobre la composición de los n-alcanos de la cera cuticular de hojas de algunas especies de árboles de amplia presencia local, que puede ser de utilidad para estudios taxonómicos y de los efectos de la contaminación ambiental y el cambio climático sobre la vegetación de la zona.

MATERIALES Y MÉTODOS

     El material analizado se coleccionó de ejemplares adultos de Populus alba L. (BAL 7294), Populus deltoides Bartr. ex Marshall (BAL 7293), Robinia pseudoacacia L. (BAL 7292), Ulmus pumila L. (BAL 7296) y Fraxinus americana L. (BAL 7298) del Campus Universitario de Tandil, provincia de Buenos Aires, Argentina (37° 19’S, 59° 08’O), en el mes de febrero de 2004. De cada una de las especies se seleccionó un solo ejemplar, del cual se coleccionaron al azar y en forma manual, entre 20 y 25 hojas maduras de las ramas inferiores, incluyendo los pecíolos. Las hojas se lavaron individualmente con agua corriente fría, se dejaron secar al aire a temperatura ambiente entre 24 y 48 horas, y luego se molieron con un molinillo eléctrico. Una alícuota de ~0,1000 (Populus), o ~0,2500 g (otros) de muestra molida se pesó en un tubo de vidrio de borosilicato (150 x 20 mm) con tapa a rosca provista de un sello interno de teflón, y se agregó ~0,1100 g de una solución de 0,4 mg/g de n-docosano (C₂₂) (SIGMA) y 0,8 mg/g de n-tetratriacontano (C₃₄) (SIGMA) en n-undecano (C₁₁) (ICN) como estándares internos. Otra alícuota de ~1,0000 g se pesó en una bandejita de aluminio y se secó en estufa a 75 °C hasta peso constante para la determinación del contenido de materia seca (MS).
     La extracción y purificación de la cera cuticular se realizó según el método propuesto por Mayes et al. (1986). Se agregó al tubo 10 ml de una solución 1 M de hidróxido de potasio en etanol y se calentó en bloque seco a 90 °C durante 16 horas. Luego de enfriar el tubo hasta 65 °C, se agregaron 7 ml de n-heptano (ANEDRA) y 2 ml de agua destilada, se agitó en forma manual y se recolectó la fase de n-heptano en otro tubo, repitiéndose esta operación con el nuevo agregado de 7 ml de n-heptano. La fase de n-heptano se evaporó a seco en bloque seco a 90 °C, bajo un evaporador con flujo continuo de aire. El residuo seco se rediluyó en 1,5 ml de n-heptano y se purificó pasándolo por una columna de ~5 ml de sílicagel 60 (MERCK). El extracto purificado se evaporó a sequedad con las mismas condiciones ya mencionadas y se guardó hasta el análisis.
     El análisis de los n-alcanos se realizó mediante cromatografía gas-líquido capilar con un equipo HP 6890 con inyector automático y detector de ionización de llama. Se usó una columna DB-1 (J&W) (15 m x 0,53 mm d.i., espesor del film: 1 µm) y helio como gas portador a 10 ml/min con flujo constante. El extracto purificado se rediluyó en 400 µl de n-heptano (MERCK) y se inyectaron 0,5 µl, sin división de flujo. Las condiciones de la corrida cromatográfica fueron: temperatura del inyector y detector: 340 °C; temperatura del horno: 150 °C durante 2,5 min; rampa 1: 8 °C/min hasta 190 °C; rampa 2: 4 °C/min hasta 270 °C; rampa 3: 3 °C/min hasta 300 °C durante 5 min. La cuantificación de los n-alcanos de número impar de carbonos (C₂₃→C₃₅) se realizó mediante calibración con tres niveles de una solución de n-tricosano (C₂₃), n-pentacosano (C₂₅), n-heptacosano (C₂₇), n-nonacosano (C₂₉), n-dotriacontano (C₃₂) y n-tritriacontano (C₃₃) (SIGMA-ALDRICH) en n-heptano, con la adición de C₂₂ y C₃₄ como estándares internos, y n-hentriacontano (C₃₁) y n-pentatriacontano (C₃₅) se cuantificaron usando los factores de respuesta (FR) de C₃₂ y C₃₃, respectivamente. La validación del método cromatográfico se realizó con once niveles de concentración de los n-alcanos mencionados (rango desde 0,0005 hasta 0,6 µg/µl) inyectados por duplicado: la respuesta del detector para todos los n-alcanos y el rango de concentración especificado es lineal (y=a+FRx), los valores de a son cercanos a cero (0,009-0,01), los FR son cercanos a uno (0,95-1,03) y los coeficientes de determinación (R2) son superiores a 99, 98%; los límites de detección (Señal/Ruido=3) y cuantificación (Señal/Ruido=10) para todos los n-alcanos están dentro de los rangos 0,08-0,16 y 0,25-0,50 ng/µl, respectivamente; la precisión dentro del día y entre días es muy alta, los coeficientes de variación de las réplicas no superan el 3% y el valor promedio para todos los n-alcanos y rango de concentración especificado es inferior al 0,5%. La selectividad del método cromatográfico se comprobó mediante la adición de estándares de los n-alcanos a extractos de muestras y el ajuste de las condiciones de corrida para obtener una resolución de los picos cromatográficos mayor a 1,5 (100%). La recuperación de todos los n-alcanos analizados con el método de extracción empleado es prácticamente completa (88-105%) y la incorporación de los estándares internos corrige cualquier variación que pueda ocurrir durante el proceso (Oliván & Osoro, 1999).
     Los valores se presentan como la concentración de cada n-alcano en la muestra en mg/kg MS. La concentración total de n-alcanos (mg/kg MS) se obtuvo sumando las concentraciones de los n-alcanos de número impar de carbonos del rango considerado (C₂₃→C₃₅). En este trabajo se destaca la presencia pero no se cuantificaron los n-alcanos de número par de carbonos presentes dentro del rango estudiado ya que, en comparación con los n-alcanos de número impar de carbonos, en la mayoría de las especies vegetales están en general en muy baja concentración (<10 mg/kg MS).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

     Los cromatogramas del extracto purificado de la cera cuticular de las hojas se muestran en la Fig. 1. La presencia de n-alcanos de número par de carbonos dentro del rango estudiado fue no detectable o muy baja en general en todas las especies, con excepción de n-hexacosano (C₂₆), n-octacosano (C₂₈) y n-triacontano(C₃₀), este último se destacó particularmente en Fraxinus americana. La concentración y proporción relativa de n-alcanos de número impar de carbonos se muestran en la Tabla 1. La concentración total de n-alcanos (mg/kg MS) fue, de mayor a menor, Populus alba (6935) > Robinia pseudoacacia (1571) > Populus deltoides (1379) > Ulmus pumila (880) > Fraxinus americana (467). Los n-alcanos más abundantes en todas las especies fueron C₂₇ y C₂₉ que constituyeron entre 10 y 51% y 35 y 76% del total, respectivamente, excepto en Fraxinus americana donde los más abundantes fueron C₂₉ y C₃₁ que constituyeron 31 y 49% del total, respectivamente.

Fig.1. Cromatogramas del extracto purificado de cera cuticular de hojas de A, Populus alba. B, Populus deltoides. C, Robinia pseudoacacia. D, Ulmus pumila y E, Fraxinus americana. Cantidad de muestra (g): (0,1000 (Populus), (0,2500 (otros); inyección: 0,5 µl del extracto purificado en n-heptano; columna: DB-1 (15 m x 0,53 mm, 1 µm); gas portador: helio a 10 ml/min; inyector y detector: 340 °C; horno: 150 °C x 2,5 min, 8 °C/min hasta 190 °C, 4 °C/min hasta 270 °C, 3 °C/min hasta 300 °C x 5 min. Estándares internos: C₂₂ y C₃₄. Tiempo de retención promedio (min): C₂₃: 11,64; C₂₅: 14,75; C₂₇: 17,94; C₂₉: 21,06; C₃₁: 24,05; C₃₃: 26,89; C₃₅: 29,69. Los picos que se destacan entre los n-alcanos de número impar de carbonos son los n-alcanos de número par de carbonos en orden de serie.

Tabla 1. Concentración y proporción relativa de n-alcanos de número impar de carbonos (C₂₃→C₃₅) de cera cuticular de hojas de Populus alba, Populus deltoides, Robinia pseudoacacia, Ulmus pumila y Fraxinus americana del Campus Universitario de Tandil, Buenos Aires, Argentina, en febrero de 2004.

     Según nuestro conocimiento no hay información disponible sobre la cantidad y proporción relativa de los n-alcanos de la cera cuticular de hojas de árboles en la Argentina; los primeros datos de especies de plantas forrajeras de la zona del sudeste de la provincia de Buenos Aires fueron reportados por Alvarado et al. (2001) y Bakker et al. (2001). No encontramos información de otros países sobre la composición de los n-alcanos de la cera cuticular de las hojas para las especies que analizamos en este trabajo. Los trabajos disponibles sobre el género Populus son un estudio sobre la relación entre la cera cuticular y el crecimiento en híbridos comerciales con alta producción de biomasa (Cameron et al., 2002) y varios estudios sobre el impacto de los niveles de CO₂ y O₃ en la estructura de la cera cuticular y las consecuencias que traen estos cambios en la interacción entre la planta y los insectos, realizados con Populus tremuloides (The Aspen FACE Experiment). Las dos especies del género Populus que analizamos en este trabajo difieren marcadamente no solo en la concentración total de n-alcanos sino también en la proporción relativa de C₂₇ y C₂₉. En Populus deltoides, tanto el contenido total de n-alcanos [expresado en relación a una superficie promedio de hoja estimada de 115 cm² (~6 µg/cm²)] como las proporciones relativas de C₂₇ (17%) y C₂₉ (76%), fueron cercanos a los de cultivos controlados de los híbridos P. deltoides x P. nigra y P. nigra x P. maximowiczi en diferentes momentos del año en New York (42° 47’ N, 76° 07’O) (5-12 µg/cm², C₂₇: 20-30%, C₂₉: 60-80%) reportados por Cameron et al. (2002). En comparación, Populus alba L. se destacó por la alta concentración total de n-alcanos con una alta proporción relativa de C₂₇. Los resultados que obtuvimos indican que la cantidad y composición de los n-alcanos de la cera cuticular de las hojas de P. alba serían adecuadas para la utilización de este material como marcador natural de la ingestión.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se llevó a cabo en la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNCPBA, Tandil, en el marco del proyecto PICT 9788 financiado por la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica de la Argentina.

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