INTRODUCCIÓN

El género Lycium L. (tribu Lycieae Hunz., subfam. Solanoideae, Solanaceae), comprende aproximadamente 97 especies leñosas de ambientes áridos, semiáridos y salobres alrededor del mundo (Levin et al., 2011), algunas ampliamente reconocidas por sus usos alimenticios y medicinales (^{Yao et al., 2018}). De estas especies, 27 se encuentran en Argentina (Bernardello, 2013). Una de estas especies, Lycium humile Phil., es conocida por varios nombres populares como bálsamo finito, chámpita, tomatillo, wicha, jume, sacha uva o waycha. Se trata de un sub-arbusto de hasta 20 cm de alto, que puede formar densas matas con flores blancas pentámeras solitarias y frutos negros, de tipo baya, que pueden ser consumidos como alimento (Rojas, 1991; Bahamonde et al., 2012; Bernardello, 2013; Bernardello, 2015; Cordero et al., 2020; Palchetti et al., 2021a).

Lycium humile es una especie halófita extrema, endémica del altiplano en las regiones de Puna y Prepuna de los Andes Centrales, donde crece entre los 2000 y 4000 m s.m. en las provincias Argentinas de Jujuy, Catamarca y Salta, en Bolivia y en Chile (Bahamondes et al., 2012; Palchetti et al., 2021). Se encuentra casi exclusivamente en vegas próximas a salares de altura, constituyendo un componente importante del ecosistema, en ambientes con alto grado de salinidad, fluctuaciones de temperatura extremas, escasas precipitaciones y alta radiación ultravioleta (Cabrera, 1957; Tálamo et al., 2010; Bahamondes et al., 2012; Fernández et al., 2016; Carilla et al., 2018; Palchetti et al., 2020, 2021a, 2021b).

Los miembros del género Lycium, entre ellos L. humile, se caracterizan por presentar adaptaciones al xerofitismo y halofitismo (Bernardello, 2013). Metcalfe & Chalk (1972) citan para Lycium antecedentes generales sobre la anatomía foliar y caulinar. Por otra parte, Bernardello (1982), describió la anatomía de hojas y tallos de 29 especies del género que habitan la República Argentina y Chile, mencionando tallos con sifonostelas anfifloicas, parénquima rico en arenas de cristales, hojas generalmente anfiestomáticas con diversos tipos de estomas, mesófilo dorsivental u homogéneo y cutícula foliar más gruesa en especies que viven en zonas secas y salitrosas. En tanto, Figueroa & Giménez (2015) señalaron para tallos de L. athium Bernardello, especie endémica de la provincia de Formosa, algunas adaptaciones al xerofitismo como elementos del xilema de pequeñas dimensiones y abundantes fibras. Finalmente, Palchetti et al. (2015, 2021b) y Rahman et al. (2021), describieron para L. humile la acumulación de ácido abscísico y prolina en el mesófilo y el desarrollo de parénquima acuífero como caracteres adaptativos al medio salino, sugiriendo que se trata de una de las especies de Solanaceae más tolerante a la sal.

El cambio climático y el calentamiento global han acelerado la frecuencia y severidad de factores de estrés abiótico como la sequía, la salinidad, la radiación ultravioleta y las altas temperaturas (^{Liu et al., 2022}). Se ha estimado que aproximadamente el 70% de la reducción del rendimiento de cultivos importantes se debe al impacto de estos factores ambientales (^{Wild, 2003}). Este hecho, sumado al crecimiento de la población mundial por el cual que se estima que para el año 2050 se necesitará un 70% más de provisión de alimentos (Tilman et al., 2011), ha alertado sobre la necesidad de encontrar alternativas que permitan realizar cultivos tradicionales bajo condiciones extremas de altas temperaturas, con poco riego, ampliando las superficies de cultivo a suelos empobrecidos, salinizados y poco favorables. En este contexto, especies adaptadas a ambientes extremos xéricos y salinos, como L. humile, que desarrollan estrategias anatómicas y fisiológicas para prosperar bajo condiciones de hipersalinidad, con déficit hídrico, temperaturas extremas, baja presión parcial de gases y alta radiación UV (Fhan & Cutler, 1992; ^{Hashemm & Mohamed, 2020}), se presentan como modelos para los mecanismos fisiológicos, morfológicos y moleculares de las respuestas al estrés, y como fuentes para la selección de genes que permitan mejorar la tolerancia de cultivos económicamente importantes (Ben Saad et al., 2010; ^{Wani et al., 2017}; Carrar & Di Iorio, 2022). Así, el objetivo del presente trabajo es identificar caracteres morfo-anatómicos y fitoquímicos de órganos vegetativos de L. humile asociados a la tolerancia a ambientes extremos de humedales salinos, a fin de evaluar su potencial como fuente de genes de resistencia para cultivos de importancia agronómica, así como para la obtención de metabolitos de interés comercial para la industria farmacéutica y cosmética.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

El material vegetal de L. humile fue colectado en febrero de 2018 en 4 poblaciones provenientes de las localidades de La Quebradita (población departamento Ambato, Loro Huasi (693) departamento de Santa María y de las vegas próximas al salar de Antofalla en las localidades de Antofalla (población 703) y Botijuela (población departamento de Antofagasta de la Sierra, en la provincia de Catamarca, Argentina (Fig. 1).

Fig. 1 Lycium humile. A, sitios de muestreo de diferentes poblaciones. Adaptado de Google Earth, image Landsat/ Copernicus, Us Dept of State Geographer, ©Google. Figura en color en la versión en línea https://www.ojs.darwin.edu. ar/index.php/darwiniana/article/view/1151/1313 

Las dos últimas localidades son consideradas como ambientes hipersalinos por su proximidad al salar.

De cada población se muestrearon 5 individuos incluyendo ejemplares de referencia que fueron depositados en la colección del INBIOFIV.

ARGENTINA. Catamarca. Depto. Ambato, Loc. La Quebradita (28° 0’ 25,86”S, 65° 50’ 56, 13” O, 3300 m s.m.), 22-II-2018 (fl), Cuello 682 (INBIOFIV). Depto. Santa María, Loc. Loro Huasi (26° 43’ 54,05” S, 66° 2’ 35,27” O, 3300 m s.m.), 22-II-2018 (fl), Cuello 693 (INBIOFIV). Depto. Antofagasta de la Sierra, Loc. Antofalla (25° 31’ 4,02” S, 67° 37’ 4,74” O, 3300 m s.m.), 20-II-2018 (fl), Cuello 703 (INBIOFIV). Loc. Botijuela (25° 44’ 28,54” S, 67° 49’ 23,59” O, 3400 m s.m.), 20-II-2018 (fl), Cuello 711 (INBIOFIV).

Estudios morfo-anatómicos e histoquímicos. Microscopía óptica y fluorescencia

De los individuos de cada población se tomaron muestras de hojas y tallos aéreos. Parte de las muestras se fijaron en FAA (formol, alcohol etílico, ácido acético, agua, 100:300:50:35, V/V), en tanto otra parte del material se secó bajo sombra en un cuarto con ventilación o se utilizó fresco para el estudio histoquímico.

Para estudios epidérmicos y de arquitectura foliar, cinco hojas maduras de cada ejemplar fueron diafanizadas (Dizeo de Strittmatter, 1973), posteriormente teñidas con Violeta de Cresil y montadas en agua glicerina (1:1, V/V) (D’Ambrogio de Argüeso, 1986; ^{Zarlavsky, 2014}). Las descripciones para establecer la arquitectura foliar, vascularización, distribución y tipo de estomas se realizaron utilizando la terminología de Hickey (1979) y Ellis et al. (2009).

Para la caracterización anatómica, del material fijado en FAA se realizaron cortes con micrótomo rotativo Microm HM 315 utilizando soportes de cera odontológica (Mercado & Ponessa, 2021). Las secciones obtenidas se decoloraron con hipoclorito de sodio 50%, se lavaron sucesivas veces con agua destilada, se tiñeron con coloración doble sucesiva Azul Astra - Safranina y se montaron en agua:glicerina (1:1, V/V) (D’Ambrogio de Argüeso, 1986; ^{Zarlavsky, 2014}).

Para visualizar diferentes grupos químicos, se realizaron cortes de material fresco o seco previamente rehidratado en agua destilada durante 10 min. Para la detección de flavonoides y ácidos hidroxicinámicos, las secciones se trataron con reactivo de Neu (2-aminoetil-difenillborinato, Sigma) 1% en MeOH absoluto (Neu, 1956) y KOH 10% (Liakopoulos, 2001), respectivamente. Los diferentes compuestos fueron detectados por su fluorescencia diferencial (Merck, 1980; Wagner & Bladt, 1996).

Para visualizar compuestos fenólicos y taninos, las secciones se trataron con FeCl₃ 10% en EtOH (^{Zarlavsky, 2014}) y Vainillin ácido clorhídrico (Tapia Torres et al., 1999), respectivamente. Para la detección de lípidos se utilizó Sudan IV (D’Ambrogio de Argüeso, 1986) y para la identificación de terpenos y aceites esenciales el reactivo de Nadi (David & Carde, 1964). Mucílagos, almidón y azúcares libres fueron identificados por su tinción diferencial con Azul de Toluidina O (^{Heslop-Harrison & Heslop-Harrison, 1981}), Lugol (IKI) y el reactivo de Schiff (PAS) (Ruzin, 1999), respectivamente. Finalmente, fucsina ácida y ácido pícrico se utilizaron para la detección de proteínas (Johansen, 1940) y el reactivo de Dragendorff para la identificación de alcaloides (Zarlavsky, 2014). Secciones de material fresco o rehidratado sin ningún tipo de tratamiento se utilizaron con fines comparativos como control.

Los preparados se observaron en un microscopio estereoscópico Olympus SZ, un microscopio óptico Karl Zeiss Axiostar plus con filtro de luz polarizada y cámara fotográfica Zeiss Axiocam ERc 5s adosada, y un microscopio óptico de fluorescencia Nikon Optiphot UV-1A: filtro de excitación 365 nm y filtro de barrera 400 nm.

Las mediciones de área y de espesores de tejidos se realizaron utilizando el software AxiostarPlus 4.8.2 (Carl Zeiss Ltd, Herts, UK), considerando n = 30 por individuo para cada parámetro cuantificado.

Microscopía electrónica de barrido (MEB) y espectroscopia elemental de difracción de rayos X (EDX)

Para la observación de las superficies epidérmicas y el análisis elemental se trabajó con material seco sin recubrimiento. Muestras de hojas enteras y cortes gruesos de 5 mm de espesor realizados a mano alzada, sin ningún tipo de tratamiento fueron adheridas a soportes de aluminio utilizando discos adhesivos de cinta de carbono.

Las observaciones y espectros EDX se realizaron en un microscopio electrónico de barrido ZEISS SUPRA-55VP (Carl Zeiss NTS GmbH, Germany) acoplado a un detector elemental de dispersión de rayos X (SiLi model INCA PentaFETx3Oxford Instrument), utilizando el software INCA SUITE V.4.13 en el Centro de Investigación y Servicios de Microscopía Electrónica (CIME), CONICET-UNT. Se trabajó a una distancia de 8 mm y la adquisición se realizó a 20Kv. La cuantificación elemental se calculó automáticamente por el software en base a estándares previamente incorporados.

Los análisis de EDX fueron repetidos para tres individuos por población, calculando los porcentajes de composición elemental para puntos seleccionados de los tricomas glandulares a nivel de la cabeza secretora, en el parénquima acuífero y en los idioblastos cristalíferos de transcortes de las hojas. Se utilizaron los porcentajes de masa elemental normalizada para realizar la comparación dentro y entre las muestras considerando siempre el mismo conjunto de elementos.

Análisis estadísticos

Para los parámetros cuantificados se calcularon los valores promedio y desvío estándar considerando cada población. Se realizaron análisis de la varianza y test de Tukey para comparaciones múltiples con un nivel de significación α = 0.05, utilizando el paquete estadístico Infostat (versión 1.1) (Di Rienzo et al., 2015).

RESULTADOS

Lycium humile es un sub-arbusto de hasta 20 cm de alto, que puede encontrarse formando densas matas. Presenta tallos amarillo grisáceos, inermes, glabros, ramificados, con ramas aéreas atenuadas hacia el ápice (Fig. 2A-B) y otras ramas subterráneas estoloníferas.

Las hojas son leptófilas de aspecto terete, con dimensiones uniformes entre las poblaciones analizadas (Tabla 1), simples alternas a veces fasciculadas, carnosas, obovadas, simétricas, con bases simétricas cuneada o convexa, margen entero y ápice convexo redondeado (Fig. 3A-B).

Fig. 2 Lycium humile. A, aspecto de vega en el Salar del Hombre Muerto, Antofalla (Catamarca). B, detalle de la rama en estado vegetativo. Referencias: hc, hoja carnosa; ta, tallo aéreo; rz, rizoma. Escala: 1 cm. Figura en color en la ver-sión en línea https://www.ojs.darwin.edu.ar/index.php/darwiniana/article/view/1151/1313 

Fig. 3 Lycium humile. A-B, diafanizado de hoja en haz y envés, respectivamente. C, epidermis superior. D, epidermis inferior. Referencias: 1°, vena primaria; 2°, vena de segundo orden; 3°, vena de tercer orden; a, areola; punta de flecha, estoma anisocítico; punta de flecha doble, estoma hemibraquiparacítico; Tg, tricoma glandular; vs, venula simple; vr, venula ramificada. Escalas: A-B, 500 µm; C-D, 50 µm. Figura en color en la versión en línea https://www. ojs.darwin.edu.ar/index.php/darwiniana/article/view/1151/1313 

Tabla 1 Dimensiones foliares de diferentes poblaciones de Lycium humile. 

Medias con igual letra no presentan diferencias significativas (p > 0,05). Los valores expresan media ± desvío estándar. La Quebradita (población 682), Loro Huasi (población 693), Antofalla (población 703) y Botijuela (población 711).

La venación primaria es pinnada reticulodroma, en la cual las venas secundarias se ramifican en un retículo de venas de menor orden. La vena primaria es única y masiva, nace en la base de la lámina y presenta un recorrido recto hacia el ápice. Se observan 6-8 venas secundarias que se unen a la vena primaria formando ángulos rectos a agudos, sin llegar al margen. Las venas secundarias acompañan el plegamiento involuto de la hoja. La venación terciaria, constituye el menor orden de venación, presenta un patrón reticulado irregular que se pliega de forma revoluta hacia la epidermis inferior. Se anastomosan en variados ángulos con otras terciarias, dando lugar a la formación de areolas poligonales irregulares, de desarrollo moderado, completas e incompletas con una, dos o más vénulas simples o ramificadas hasta dos veces (Fig. 3A-B).

En vista paradermal, las hojas son anfiestomáticas, con células epidérmicas poliédricas isodiamétricas, cuadrangulares de paredes anticlinales rectas a ligeramente curvadas, engrosadas en la epidermis superior con respecto a la inferior. Presentan estomas anomocíticos de dimensiones y tamaños poco variables entre las poblaciones analizadas, siempre en mayor densidad sobre la epidermis superior (Tabla 2, Fig. 3C-D). Ambas epidermis muestran tricomas glandulares, escasos sobre la lámina y más frecuentes hacia la base de la hoja, formados por un pie uni- a bicelular y una cabezuela pluricelular biseriada de hasta tres pares de células (Fig. 3D y 4H).

En transcorte, la hoja muestra contorno oval a subtriangular con cutículas delgadas (6,83 ± 3,83 µm). En la sección basal de la hoja la epidermis es uniestrata, mientras que, en la sección media y apical se encuentra acompañada por una hipodermis también uniestrata (Fig. 4A-E). Las células epidérmicas son poliédricas de aspecto cuadrangular de mayores dimensiones que las del estrato hipodérmico (Tabla 3, Fig. 4F). Se observan estomas ligeramente elevados respecto de la superficie epidérmica, con células oclusivas con un marcado reborde cuticular (Fig. 4G) y tricomas glandulares (Fig. 4H).

Tabla 2 Caracteres epidérmicos foliares de diferentes poblaciones de Lycium humile. 

Tabla 3 Espesor de tejidos en transcorte de lámina de diferentes poblaciones de Lycium humile. 

Fig 4 Lycium humile. Transcorte de hoja. A-C, región basal. D, sección media. E, sección apical. F, epidermis e hipo-dermis bajo luz polarizada. G, estoma. H, tricoma glandular. I, haz vascular del nervio medio. J-K, nervios de menor orden y arenas de oxalato de calcio bajo luz blanca y polarizada respectivamente. Referencias: co, colénquima; doble punta de flecha; idioblasto cristalifero; emp, empalizada; empi, empalizada incipiente; ep, epidermis; f, floema; flecha, grano de almidón; hip, hipodermis; pa, parénquima acuífero; ph, parénquima homogéneo; punta flecha, cristales de oxalato de calcio; vp, vaina parenquimática; x, xilema. Escalas: A-E, I, 100 µm; F-H, J-K, 20 µm. Figura en color en la versión en línea https://www.ojs.darwin.edu.ar/index.php/darwiniana/article/view/1151/1313 

En la base de la hoja, el mesófilo es homogéneo formado por células parenquimáticas con paredes delgadas (Fig. 4A) o con un parénquima en empalizada incipiente hacia la cara adaxial (Fig. 4B). Hacia la región media se evidencia un plegamiento involuto de los tejidos internos y una mayor diferenciación de los tejidos del mesófilo con un parénquima en empalizada bi- a triestrato, conformado por células cortas de disposición periférica, entorno a un parénquima acuífero central. El parénquima en empalizada es continuo en los márgenes y se halla interrumpido adaxial y abaxialmente a nivel del nervio medio (Fig. 4C). Finalmente, en la sección media y apical de la lámina foliar el plegamiento es completo, el parénquima en empalizada forma un anillo continuo o solo interrumpido adaxialmente (Fig. 4D-E).

El nervio medio, de posición central, presenta una vaina parenquimática en torno a un único haz bicolateral con casquetes de colénquima hacia ambos polos floemáticos, siendo de mayor desarrollo el abaxial (Fig. 4I). Los haces menores colaterales que también presentan vaina parenquimática, se disponen linealmente o curvados hacia la epidermis inferior en la base de la hoja (Fig. 4A-C y J); mientras que, en la sección media y apical de la hoja se acomodan periféricamente con polos xilemáticos exoscópicos equidistantes siguiendo el plegamiento involuto de los tejidos (Fig. 4D-E).

En el parénquima en empalizada se intercalan idioblastos cristalíferos con arenas cristalinas y cristales de oxalato de calcio de forma variable (Fig. 4F, I y J-K).

En resumen, para los caracteres anatómicos cuantificados, solo se observaron diferencias en los espesores de la epidermis e hipodermis, no así en el espesor de lámina y del tejido en empalizada calculado para la sección media de la hoja (Tabla 3), indicando una alta uniformidad morfológica.

La Tabla 4 muestra los resultados de los ensayos histoquímicos realizados en los tejidos foliares, los cuales fueron idénticos para las diferentes poblaciones.

Tabla 4 Histoquímica en transcorte de hoja de L. humile. En el caso de la autofluorescencia + indica presencia y - indica ausencia. En tanto para los test histoquímicos + indica positivo, ++ indica positivo con mayor intensidad en la reacción o coloración y - indica negativo en comparación con el control no tratado. *indica fluorescencia débil o secundaria enmascarada por la co-ocurrencia con otros compuestos. 

Fig. 5 Lycium humile. Histoquímica foliar. Mesófilo (A, C, E, G, I, K, M, O, Q, R) y Tricoma glandular (B, D, F, H, J, L, N, P, R, T). A-B, tejido fresco control. C-D, autofluorescencia bajo luz UV. E-F, fluorescencia luego de tratamiento con KOH5% para la detección de ácidos hidroxicinámicos. G-H, reactivo de Neu para la detección de flavonoides (doble punta de flecha) y otros compuestos fenólicos (punta de flecha). I-J, reacción con FeCl₃ para la identificación de fenoles. K-L, coloración con Sudan IV para lípidos. M-N, reactivo de NADI para la identificación de terpenos y aceites esenciales. O-P, fucsina ácida para la detección de proteínas. Q-R, ácido pícrico, indicador de proteínas. S-T, reactivo de Dragendorff para evidenciar alcaloides. Referencias: punta de flecha, reacción positiva. Escalas: A, C, E, G, I, K, M, O, Q, R, 50 µm; B, D, F, H, J, L, N, P, R, T, 20 µm. Figura en color en la versión en línea https://www.ojs.darwin.edu.ar/index.php/darwiniana/article/view/1151/1313 

El tejido fresco es verde, característico de la clorofila presente en las células del parénquima en empalizada y con contenido ámbar-amarillento en los tricomas glandulares y sobre las cutículas (Fig. 5A-B). Bajo luz UV se evidencia auto fluorescencia rojiza de la clorofila y azul en las cutículas, paredes tangenciales externas de las células hipodérmicas (como fluorescencia secundaria), paredes de los vasos xilemáticos y en parte del contenido de los tricomas glandulares (Fig. 5C-D). Estos últimos fluorescen ligeramente amarillo-anaranjado a nivel de la cabeza secretora (Fig. 5D). En presencia de KOH hay un ligero aumento en la fluorescencia azul en los diferentes tejidos (Fig. 5E-F), en tanto el reactivo Neu acentuó la fluorescencia amarillo-anaranjada de los tricomas glandulares, reflejó un cambio a amarillo en las cutículas y paredes de los vasos xilemáticos con una ligera fluorescencia secundaria azul, y realzó la fluorescencia azul de las paredes tangenciales externas de la hipodermis (Fig. 5G-H). La reacción para fenoles con FeCl₃ reveló resultados positivo en la capa externa de la cutícula, en los idioblastos cristalíferos próximos a los haces vasculares y en parte del contenido del tricoma glandular (Fig. 5I-J). No se detectó la presencia de taninos (Tabla 4). Se reveló la presencia de compuestos lipídicos y terpénicos en las cutículas, como gotas contenidas en las células del parénquima en empalizada, y en parte del contenido de los tricomas glandulares (Fig. 5K-N). Polisacáridos y otros azúcares reductores no fueron evidenciados, no obstante, algunos granos de almidón aislados se encontraron dispersos en el parénquima en empalizada. Proteínas (Figs. 5O-R) y alcaloides (Figs. 5S-T) fueron detectados en el parénquima en empalizada y en los tricomas glandulares.

Los análisis elementales de los diferentes sitios de colección permitieron determinar la presencia de Na+ y Ca2+ en los idioblastos cristalíferos, en menor medida en el parénquima acuífero y en los tricomas glandulares, sin mayores diferencias en cuanto a la acumulación de estos elementos entre las poblaciones bajo estudio (Tabla 5, Fig. 6A-E).

Tabla 5 Espectros EDX de tejidos foliares de diferentes poblaciones de L. humile. 

Fig. 6 Lycium humile. MEB (A, B) y EDX (C, D, E) de tejidos foliares. A, C, tricoma glandular. B, mesófilo con parénquima acuífero e idioblastos cristalíferos. D, E, espectros EDX del parénquima acuífero e idioblastos cristalíferos. Escalas: A, 10 µm; B, 100 µm. Figura en color en la versión en línea https://www.ojs.darwin.edu.ar/index.php/ darwiniana/article/view/1151/1313 

Los tallos presentaron sección circular con crecimiento secundario temprano (Fig. 7A). La epidermis uniestrata es frágil membranácea con tricomas glandulares y escasos estomas anomocíticos, restringidos a los segmentos jóvenes del tallo, se evidencia una hipodermis conformada por células de mayores dimensiones que las de la epidermis subyacente (Fig. 7B-C). Cortex con 3-5 estratos de aerénquima con cámaras de aire, 6-7 estratos de parénquima acuífero de disposición radial de células con paredes delgadas, de grandes dimensiones en relación al resto de las células corticales y 9-12 estratos de parénquima aerenquimático que forma un segundo nivel de cámaras de aire (Fig. 7A). A partir de este último estrato se desarrollan ramificaciones laterales (Fig. 7D) y la peridermis en las secciones basales del tallo. El sistema vascular se encuentra conformado por una estela anfifloica, en la que el floema externo e interno presentaron abundante parénquima y polos aislados de elementos de conducción. A continuación del floema externo se observa un anillo cambial, xilema continúo formando un anillo con abundantes fibra y elementos de vaso de 10,71 ± 8,53 µm de diámetro, sin diferencias significativas entre las poblaciones estudiadas. La médula aerenquimática mostró aspecto similar al cortex interno (Fig. 7E). Gran cantidad de idioblastos cristalíferos con arenas de cristales de oxalato de calcio se evidenciaron en el aerénquima interno, en el floema y la médula.

DISCUSIÓN Y CONCLUSION

Lycium humile es considerada una especie halófita que habita ambientes extremos, hipersalinos, de alta montaña caracterizados por una intensa radiación ultravioleta, baja presión parcial de oxígeno, déficit hídrico y temperaturas diarias extremas (Farías, 2020; Palchetti et al., 2021a). Muestra un hábito de crecimiento postrado formador de matas con hojas suculentas (Bahamonde et al., 2012; Bernardello, 2013; Bernardello, 2015; Palchetti et al., 2021a).

En el presente aporte se describe por primera vez la arquitectura foliar de L. humile con venas secundarias acompañando un plegamiento involuto de la hoja necesario para alcanzar la suculencia. Esta venación en tres dimensiones, con haces vasculares perisféricos exoscópicos (con el xilema siempre de disposición externa), equidistantes, formando un anillo en el cual el nervio medio participa, responde a un patrón de vascularización tridimensional de hojas suculentas de tipo III según la clasificación de Melo-de-Pinna et al. (2014 y 2016) y ^{Hernandes-Lopes et al. (2016}). Este sistema, en el que las venas están en más de un plano de la hoja, permitiría aumentar la suculencia manteniendo una mayor conectividad hidráulica de los tejidos periféricos (Ogburn & Edwards, 2018).

Fig. 7 Lycium humile. Transcorte de tallo. A, aspecto general. B, epidermis en transcorte con tricoma glandular. C, vista superficial de la epidermis con estoma anomocítico. D, ramificación lateral originada a partir del cortex interno. E, cilindro vascular. Referencias: aer, aerénquima; cor, cortex; cv, cilindro vascular; doble punta de flecha; arenas cristalinas; e, estoma; ep, epidermis; f, floema; hip; hipodermis; m, medula; pa, parénquima acuífero; rl, ramificación lateral; tg, tricoma glandular; x, xilema. Escalas: A, C, E, 100 µm; B-C, 20 µm. Figura en color en la versión en línea https://www.ojs.darwin.edu.ar/index.php/darwiniana/article/view/1151/1313 

La variación en la morfología y las estrategias desplegadas para alcanzar la suculencia en las hojas de numerosas plantas refleja la diversidad de linajes en los que este carácter ha evolucionado, sin embargo, poco que se conoce sobre la regulación molecular de dicho carácter (^{Heyduk, 2021}). Las observaciones disponibles se limitan a relativamente pocos taxones dentro de las Asteraceae, Oxalidaceae, Portulacineae, Aizoaceae Caryophyllales, y en varias familias de monocotiledóneas como Agavaceae, Iridaceae, Orchidaceae y Xanthorrhoeaceae, donde el desarrollo de la venación tridimensional parece variar según el grupo taxonómico (Heyduk et al. 2016; Melo-de-Pinna et al., 2014, 2016; ^{Hernandes-Lopes et al., 2016}; Ogura et al., 2018; Ogburn & Edwards, 2018; Heyduk, 2021).

En cuanto al número y distribución de estomas, en las poblaciones analizadas se observó una mayor densidad de estomas en la epidermis superior. Bernardello (1982) menciona que dentro del género las especies suelen ser anfiestomáticas con mayor densidad de estomas en la cara inferior, aunque según este autor el tipo y número de estomas no revisten de valor taxonómico. Palchetti et al. (2021a) informaron para L. humile un índice estomático idéntico para la epidermis superior con respecto a la inferior, diferencia que podría deberse a una disminución en el tamaño y aumento en el número de células de la epidermis inferior con respecto a la superior resultando en un índice estomático similar, pero con diferencias en términos de densidad.

Si bien Bernardello (1982) sugirió que especies de Lycium que viven en zonas secas y salitrosas presentan cutículas foliares más gruesas, L. humile mostró cutículas delgadas en comparación a los esquemas presentados por este autor para Lycium infaustum Miers, como principal ejemplo.

El mesófilo isolateral-radial con parénquima acuífero central de L. humile constituye una característica única diferente a los mesófilos dorsiventrales y homogéneos descriptos para otras especies del género (Bernadello, 1982; Metcalfe & Chalk, 1972). La suculencia de las hojas debida al parénquima acuífero, antes citado por Palchetti et al. (2021a) y el aerénquima en tallos aéreos de L. humile, son rasgos asociados a la tolerancia al ambiente de humedales salinos de altura. El parénquima acuífero además de funcionar como una reserva de agua, secuestraría el exceso de Na+ que tiende a acumularse a nivel celular en los tejidos (Grigore & Toma, 2017) y compartimentalizaría estos iones en las vacuolas para mantener su concentración en el citoplasma a niveles tolerables (Flowers & Colmer. 2015). Sin embargo en el presente trabajo se detectó una mayor presencia de Na+ y Ca2+ en los idioblastos cristalíferos, los cuales acumularon sales o cristales de estos elementos, que aunque estuvieron presentes en el parénquima acuífero, parecen estar diluidos o menos concentrados.

Mediante histoquímica se detectó la presencia de proteínas, fenoles y flavonoides en hojas. Palchetti et al. (2021a) y Rahman et al. (2021) citan para L. humile, al igual que para otras Solanaceae como la papa (Solanum tuberosum L.), el tomate (Solanum lycopersicum L.), el pimiento (Capsicum spp); y para otras especies de Lycium como L. barbarum L. (^{Zhang et al., 2019}; Li et al., 2022) y L. ruthenicum Murr (Li et al., 2019, 2022) la presencia de prolina, proteína asociada a mecanismos de tolerancia a ambientes salinos. Este aminoácido, junto a los fenoles y flavonoides, actuaría como agente antioxidante secuestrador de especies reactivas del oxígeno causantes de daño oxidativo y como osmoprotector (Ozgur et al., 2013; Flowers & Colmer, 2015; Slama et al., 2015; ^{Ahammed et al., 2018}; ^{Alam et al., 2019}; Reginato et al., 2019). Además, los fenoles y flavonoide son reconocidos filtros naturales frente a la radiación ultravioleta (Li et al., 2023) y cumplen numerosas funciones de defensa frente a organismos patógenos y otros factores abióticos de estrés (Kumar et al., 2020).

Los cristales de oxalato de calcio parecen ser un carácter común en el género y la familia (Metcalfe & Chalk, 1972; Bernardello, 1982), pero no fueron anteriormente descritos para esta especie. Es importante destacar que la formación de cristales de calcio es también considerada como un mecanismo de osmo-regulación interna de sales, encontrándose una relación positiva entre la salinidad y el desarrollo de cristales de esta naturaleza (Rains, 1972; Poblete et al., 1991; Apóstolo, 2005; Grigore & Toma, 2008).

Poblete et al. (1991) menciona la presencia de glándulas de sal foliares en L. humile, mientras que contradictoriamente, Palchetti et al. (2021a) citan ausencia de tricomas de cualquier tipo para ejemplares de la misma especie.

En el presente trabajo se describen tricomas glandulares (posiblemente los observados por Poblete et al., 1991) y se demuestra que sintetizan y acumulan fenoles, proteínas, alcaloides y aceites esenciales; y parecerían no estar relacionados de forma directa con la acumulación de Na+. No se observaron glándulas de sal propiamente dichas, tricomas ramificados ni otros tipos de tricomas glandulares mencionados por Metcalfe & Chalk (1972) y Bernadello (1982) para otras especies del género.

Los alcaloides y terpenos detectados en L. humile son un carácter común de la familia Solanaceae y del género Lycium (Qian et al., 2017), encontrándose este tipo de metabolitos con potencial medicinal, alimenticio y para la industria cosmestica (^{Heinrich et al., 2021}; ^{Xavier et al., 2023}) en L. barbarum (Gonçalves et al., 2018), L. chinense Mill. (^{Youn et al., 2013}) y L. europaeum L. (Bendjedou et al., 2021), entre otros.

Por otra parte, el tallo presenta características similares a las descriptas para L. chinense (Metcalfe & Chalk, 1972), con la particularidad de poseer parénquima acuífero y aerénquima, ambos tejidos característicos de especies adaptadas a ambientes xéricos y salinos (Fahn & Cutler 1992; Jáuregui et al., 2019; Mumtaz et al., 2021). El diámetro de los elementos de vasos fue considerablemente menor al descrito para otras especies de Lycium, en las cuales oscilaba entre los 125-150 μm (Bernardello, 1982), indicando su adaptaciones al xerofitismo, con la presencia de elementos de pequeñas dimensiones poco numerosos y acompañados de abundantes fibras (Baas & Carlquist, 1985), previamente identificados en L. athium Bernardello (Figueroa & Giménez, 2015). La presencia de abundantes fibras con paredes lignificadas se mencionó como una adaptación al ambiente salino en los tallos y raíces de Juncus gerardi Loisel. y Halophytum ameghinoi (Speg.) Speg. estos elementos otorgarían resistencia a la presión osmótica a la que se encuentra sometida la planta (Fernández et al., 2016; Grigore & Toma, 2008).

La uniformidad observada en los caracteres anatómicos cuantificados para las diferentes poblaciones de L. humile bajo estudio podría indicar una fuerte adaptación al ambiente hipersalino palustre con poca influencia del ambiente en la expresión del fenotipo o una baja diversidad genética entre poblaciones en relación a la proximidad geográfica de las mismas.

En tanto, L. ruthenicum como L. chinense (^{Zhao et al., 2010}; Liu et al., 2012) presentaron una moderada a baja diferenciación génica entre poblaciones. Las especies del género Lycium presentan polinización anemófila o por insectos dípteros, himenópteros y lepidópteros (Galetto et al., 1998) y dispersión de semillas por pequeños animales, lo que promueve la exogamia y el flujo de genes entre poblaciones (Levin & Miller, 2005). Esto explicaría la presencia de altos niveles de diversidad génica dentro de una población y una menor diversidad entre poblaciones (^{Hamrick & Godt, 1996}). Cabe destacar que la diversidad genética es de vital importancia para que una especie mantenga su potencial evolutivo frente a un entorno en constante cambio; la pérdida de diversidad génica o la uniformidad a menudo se asocia con una aptitud física reducida, por ello el mantenimiento de la variabilidad es un objetivo importante dentro de los planes de conservación de una especie (Liu et al., 2012). La información obtenida en este estudio proporciona valiosos datos de referencia que deben ser confirmados por estudios moleculares incluyendo un mayor número de muestras de poblaciones distribuidas en un rango geográfico más grande, que serán de importancia para futuros planes de conservación de esta especie endémica con un gran potencial como fuente de genes de tolerancia a factores abióticos.

En conclusión, las poblaciones de L. humile estudiadas, presentaron una alta consistencia en los caracteres anatómicos e histoquímicos desarrollados como respuesta al ambiente extremo del humedal salino de altura, se destacan: la suculencia foliar, el despliegue de mecanismos de osmorregulación para la acumulación de sales de Na+ y Ca2+ principalmente en idioblastos cristaliferos, la reserva de agua en parénquimas acuíferos, la síntesis de proteínas y metabolitos secundarios como flavonoides y otro fenoles con propiedades antioxidantes y fotoprotectoras, y el desarrollo de tallos con vasos de pequeñas dimensiones, abundantes fibras y aerénquima cortical. Estas características señalarían a la especie como un excelente prospecto para la búsqueda de genes relacionados a la tolerancia a importantes factores de estrés como la sequía, la salinidad, temperaturas extremas y la radiación ultravioleta; y para el aislamiento de metabolitos con potencial farmacológico y/o cosmético.