Detección de secuencias homologas al Gen Env del virus del tumor mamario murino (Mmtv) en Cáncer de mama de pacientes argentinas

Stella M. Melana¹, Maria Alejandra Picconi², Carlos Rossi³, Juan Mural³, Lidia Virginia Alonio², Angelica Teyssie²,  James F. Holland¹, Beatriz G.T. Pogo¹

¹Departamento de Oncología Médica, Mount Sinai School of Medicine, New York University, New York;
²Servicio Virus Oncogénicos, Departamento Virología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán;
³Servicio de Ginecología, Hospital Nacional Prof. Alejandro Posadas, Haedo, Provincia de Buenos Aires

Dirección postal: Dra. María Alejandra Picconi. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán, Av. Vélez Sarsfield 563, 1281 Buenos Aires, Argentina.
FAX: (54-11) 4301-7428 E-mail: oncovir@sudnet.com.ar

Resumen
En los últimos años se ha renovado el interés en la investigación sobre la posible etiología viral del cáncer de mama humano. En publicaciones previas se ha demostrado la presencia de secuencias homólogas al gen env del virus del Tumor Mamario Murino (MMTV) en alrededor del 38% de cánceres de mama de mujeres procedentes de Estados Unidos e Italia; estas secuencias están generalmente ausentes en otros tumores y en tejido mamario normal. En el presente trabajo se analizó la presencia de una secuencia de 250 pb similar a la del gen env de MMTV en biopsias de pacientes argentinas con cáncer de mama. Se detectó este fragmento retroviral en el 31% (23/74) de los tumores analizados, mientras que sólo se obtuvo un caso positivo en tejido de mama normal y ninguno en fibroadenomas. En 46 pacientes con cáncer se analizaron células mononucleares de sangre periférica, detectando la secuencia en el 17% (2/12) de las pacientes portadoras de tumores env positivos y en el 3% (1/34) de aquéllas cuyos tumores eran env negativos. Los datos de Argentina son similares a los obtenidos en Estados Unidos e Italia donde la incidencia de cáncer de mama es también semejante. Estos resultados apoyarían la hipótesis de un probable agente viral implicado en la génesis de esta neoplasia y alientan los estudios en marcha.

Palabras claves: Cáncer de mama. Retrovirus; Oncogénesis viral; Virus del tumor mamario murino.

Abstract
Detection of murine mammary tumor virus (MMTV) env gene-like sequences  in breast  cancer from Argentine patients. In the last years research on the possible viral etiology of human breast cancer has been revised. Previous studies have demonstrated the presence of a Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) env gene-like sequence in about 38% of breast cancers from American and Italian women; these sequences are generally absent in other tumors and in normal mammary tissue. In the present study we have analyzed the presence of a 250-bp sequence of the MMTV env gene in breast cancer biopsies from Argentine patients. The retroviral fragment was present in 31% (23/74) of the tumors, only in one normal mammary tissue and in none of the fibroadenomas analized. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 46 cancer patients were also analyzed; the sequence was found in 17% (2/12) of the PBMC from env positive tumor patients and in 3% (1/34) of the env negatives. The results from Argentine samples are similar to those from USA and Italy, where the breast cancer incidence is alike. These findings support the hypothesis of a viral agent involved in the genesis of this neoplasia and encourage the continuation of these studies.

Key words: Breast cancer. Retrovirus; Viral oncogenesis; Mouse Mammary Tumor Virus.

El cáncer de mama es la tercera neoplasia más frecuente en el mundo y la primera en población femenina. Cada año se detectan alrededor de un millón de casos nuevos en el mundo¹, de los cuales el 50% podrá tener una sobrevida superior a los cinco años, según el estadio y el tratamiento recibido. El riesgo de desarrollo de esta neoplasia es mayor en Europa Occidental y Norte-américa, mientras que se informa una menor incidencia en Asia y Africa¹.
El cáncer de mama afecta a una de cada ocho mujeres en los EE.UU.². En Argentina esta neoplasia representa la primera causa de muerte por cáncer en mujeres, registrándose anualmente alrededor de 5.000 fallecimientos por esta enfermedad³. Es probable que existan diferencias de incidencia en las distintas regiones o provincias de nuestro país; sin embargo los datos nacionales se asemejan a los descriptos en los países industrializados.
Se ha estimado que sólo un 30% de los cánceres de mama estarían asociados a factores de riesgo endógenos (ej. hormonas) o hereditarios⁴. Por lo tanto, una gran proporción podría estar relacionada con factores exógenos ambientales, incluyendo las infecciones virales.
En la actualidad se acepta que entre el 15 y el 20% de los cánceres humanos están asociados con infecciones virales^5-7. Desde que Bittner descubriera el virus del tumor mamario murino (MMTV) en 1936, numerosas investigaciones se realizaron evaluando una probable etiología viral del cáncer de mama humano^2,8,9. Sin embargo los resultados obtenidos fueron contradictorios debido a la inespecificidad de las reacciones inmunológicas que detectaban anticuerpos contra MMTV en pacientes con cáncer de mama. Por otro lado la presencia de secuencias retrovirales endógenas HER similares al MMTV en el genoma humano dificultó la detección de posibles retrovirus exógenos asociados con esta neoplasia^{10, 11}.
En la última década este tema fue retomado y utilizando una nueva tecnología como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha sido posible investigar la presencia de secuencias virales homólogas al MMTV en tumores de mama humanos^{2, 9, 12}. Para ello se seleccionó un fragmento del gen env del MMTV que muestra muy baja homología con las secuencias retrovirales endógenas o con cualquier otro gen humano. Se demostró su presencia en el 38% de los cánceres, sólo en el 2% de tejido de mama normal y no se detectó en otros tumores¹². Estas secuencias se encontraron expresadas como ARN en el 66% de los tumores que las contienen¹³. No se observaron diferencias con respecto a la evolución clínica y la histopatología entre los tumores que contenían o no las secuencias, con excepción de un aumento en la expresión del receptor de laminina en los tumores positivos, considerándose a éste un marcador de progresión y mal pronóstico¹⁴.
En dos tumores de mama se demostró que existe una estructura proviral que incluye todos los genes del MMTV¹⁵. Esta estructura de 9.9 Kb presenta 95% de homología al MMTV y 50% a los endógenos solamente en el gen de la transcriptasa reversa, gen altamente conservado dentro de los retrovirus¹⁵. Las características moleculares del provirus (marcos de lectura abiertos y codones de terminación conservados, presencia del superantígeno y de elementos que responden a los glucocorticoides) sugieren la existencia de un virus con capacidad replicativa^{15, 16}.
Todo parece indicar que las secuencias retrovirales detectadas no serían de origen endógeno y tampoco debidas a polimorfismos, apoyando así el probable rol de un retrovirus exógeno en la génesis de al menos un subgrupo de estos cánceres¹⁷.
En el presente trabajo se analizó la presencia de secuencias similares al gen env de MMTV en biopsias de pacientes con cáncer de mama provenientes de Argentina.

Material y métodos

Pacientes: Se incluyeron biopsias frescas y fijadas provenientes de 74 pacientes con cáncer de mama. En 46 de ellas se obtuvo una muestra de sangre entera a fin de analizar la presencia retroviral en tejido sano (células mononucleares sanguíneas) de las mismas pacientes. Como controles de tejido mamario no neoplásico se incluyeron 5 fibroadenomas y 10 muestras de tejido de mama normal procedentes de mamo-plastias reductoras.

Extracción de ADN: En las biopsias frescas de mama, el ADN fue extraido y purificado según fue previamente descripto¹⁸. Brevemente, el tejido fue sometido a digestión con proteinasa K y posterior extracción con fenol-cloroformo. Finalmente, el ADN fue precipitado con etanol absoluto, resuspendido en 50 µl de buffer TE estéril (Tris ClH 10 ^–2 M, EDTA 10^-3 M, pH 8) y congelado a –20°C hasta su procesamiento. En los cortes histológicos de las biopsias, el ADN fue extraído y purificado en forma similar a lo descripto para las muestras frescas, excepto que el tejido fue previamente desparafinado por tratamiento con n-octano y posteriores lavados con etanol absoluto y etanol 70%.
Las muestras de sangre fueron recogidas con anticoagu-lante EDTA y conservadas a 4°C no más de 72 horas. Las células mononucleares fueron separadas por centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque (Linphoprep, Gibco Life Technologies). La extracción del ADN se efectuó en forma semejante al tejido fresco. Los ADN purificados fueron reconstituidos con agua estéril.

Amplificación del gen b-globina: A fin de controlar la integridad de los ADN obtenidos a partir de las muestras, se amplificó un fragmento de 260 pb del gen de b-globina mediante PCR empleando los primers GH-20 y PC04¹⁹.

Amplificación del gen env del virus MMTV: Se amplificó un fragmento de 250 pb del gen env del virus MMTV empleando los primers 2N: 5' CCT ACA TCT GCC TGT GTT AC-3' y 3N: 5' ATC TGT GGC ATA CCT AAA GG 3'. Las reacciones contenían: 250 ng. de ADN de la muestra, 100 pmoles de cada primer en PCR beads (Amersham Pharmacia Biotech., UK Ltd.). Se aplicaron 40 ciclos de: 94^oC, 1 min 30 seg; 55^oC, 1 min 30 seg y 72^oC, 1 min 30 seg. Los productos de las reacciones fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa 2.0% teñidos con bromuro de etidio (5 µg/ml), durante 1 hora a 100 V. Como marcador de peso molecular se utilizó 1kb plus ladder (Gibco BRL). Los geles fueron tratados con solución desnaturalizante (150 mM NaCI, 0.5N NaOH) durante 20 minutos y luego neutralizados con solución neutralizante (Tris -HCI pH: 8.0, CI Na 150 mM) durante otros 20 minutos. Luego fueron transferidos a filtros de nylon (Nytran-S&S) usando la técnica de Southern Blot¹⁸. Los ADN fueron inmovilizados con luz UV (UV Crosslinker-Fisher Scientific) durante 1 minuto. La hibridación fue realizada utilizando la oligosonda sintética¹² 2aN: 5'-CCG TAC GTG CTG CTA CCT GTA marcada radioactiva-mente con (³²P) y ATP por el método de marcado del extremo terminal 5' y purificado por columnas de Sephadex G-25 (MicroSpin G-25-Amersham Pharmacia Biotech., UK Ltd.). Los filtros fueron prehibridados con Rapid Buffer (Amersham Pharmacia Biotech., UK Ltd.) durante 15 min. e hibridados con la sonda durante 3 hs. a 42^oC. Las condiciones de lavados fueron las recomendadas por el fabricante del buffer de hibridación. Las membranas fueron expuestas a películas Kodak X-Omat durante 16 y/o 72 horas.

Resultados

Todas las muestras fueron amplificables para el gen de la globina por lo que se consideraron aptas para el estudio. El fragmento de 250 pb del gen env de MMTV fue detectado en el 31% (23/74) de los tumores analizados (Tabla 1). La Fig. 1 muestra los productos de la PCR luego de la electroforesis en agarosa e hibridación por Southern blot.

 

 

Como se resume en la Tabla 1, sólo dos de los pacientes con tumores env positivos y una de los pacientes con tumor env negativo mostraron también dicha secuencia en sus células sanguíneas.

Discusión

El estudio de un probable rol etiológico de retrovirus exógenos en el cáncer de mama humano tuvo dificultades debido a la presencia de secuencias retrovirales homólogas endógenas y la falta de métodos de detección suficientemente sensibles y específicos. A principios de los 90, iniciamos la búsqueda empleando una nueva metodología y estrategia cuyos resultados alentadores permitieron avanzar en los estudios^{2, 9, 12-14, 15, 17}.
El presente trabajo forma parte de un programa multicéntrico internacional en el que participaron países de Africa, Asia, América y Europa que presentan distinta incidencia de cáncer de mama. Los resultados obtenidos demuestran que la frecuencia de detección de las secuencias retrovirales en pacientes argentinas (31%) es comparable con aquéllas obtenidas en pacientes norteamericanas (38%¹⁷, 37%²⁰), italianas (37%¹⁴) y de otros países latinoamericanos (México y Brasil, 33%) donde la incidencia de la enfermedad es similar. Estos resultados contrastan con los obtenidos en muestras de cáncer de mama de ciertos países africanos como Túnez²¹ donde la enfermedad es predominante y tiene característica de gran malignidad (57-80%); por otro lado, en muestras de países asiáticos donde la incidencia de cáncer de mama es menor, el porcentaje de las secuencias es también bajo (China, 9.8% y Japón 11%) (resultados a publicar).
En los tejidos de mama no neoplásicos no se detectó la secuencia retroviral, con excepción de una muestra de mama normal. La presencia del retrovirus en las células mamarias de esta paciente podría representar un factor de riesgo de desarrollo de la neoplasia.
La positividad hallada en células mononucleares sanguíneas de pacientes cuyos tumores de mama fueron env positivo (17%) podría deberse a la presencia de células tumorales en la sangre. Este hallazgo ya había sido descripto en trabajos previos, aunque nunca pudo confirmarse su asociación con invasión²². Sin embargo existen antecedentes que en varios casos se detectaron secuencias retrovirales en células mononucleares luego que las pacientes desarrollaron metástasis (resultados no publicados).
La presencia de secuencias retrovirales en células sanguíneas de una paciente cuyo tumor era env negativo es más difícil de explicar. Las reacciones de detección fueron repetidas y los resultados confirmados. Si bien se tomaron todas las precauciones correspondientes¹², no puede descartarse una potencial contaminación durante la manipulación de la muestra. Esta aparente discrepancia entre los resultados del tumor y la sangre podría también atribuirse a una heterogeneidad del tumor debida a la distribución de las secuencias retrovirales; es decir, podría haber porciones del tumor env negativas y otras env positivas. Esta posibilidad podría ser confirmada mediante ensayos de hibridación in situ. Otra alternativa sería que la secuencia se hubiera dañado o perdido durante la manipulación de la muestra del tumor.
Stewart y col. postularon la posible naturaleza zoonótica del cáncer de mama humano a través de la transmisión de un virus similar al MMTV, teniendo como vector al ratón Mus domesticus²³. Este roedor, de amplia distribución en regiones con alta incidencia de cáncer de mama (Europa Occidental, América, Australia y Nueva Zelanda), presenta un elevado número de copias provirales del MMTV endógeno. Serán necesarias nuevas investigaciones a fin de establecer mediante estudios filogenéticos si las secuencias halladas representan un nuevo virus adaptado al hombre o una verdadera zoonosis²⁴. Por otro lado, la probable asociación etiológica con un agente infeccioso alienta la posibilidad del control de esta patología mediante el desarrollo de una vacuna²⁵.
Para establecer que un virus presente en un tumor está relacionado con su patogénesis se deben demostrar ciertos criterios virológicos y epidemiológicos^26,27. El aislamiento de partículas virales, la demostración de infectividad o de inducción de transformación celular, la integración del genoma viral total o parcial en el DNA del tumor, son algunos de los requisitos virológicos en los cuales se está activamente trabajando²⁸.
En conclusión, la frecuencia de las secuencias virales en cáncer de mama en las muestras argentinas revela un patrón común con la de otros países de América y Europa donde el cáncer de mama es también de alta incidencia. Este estudio aporta datos que contribuyen a cumplir los postulados epidemiológicos de causalidad en relación con la hipótesis de una asociación entre retrovirus y cáncer de mama humano, al menos en un subgrupo de pacientes.

Agradecimientos: Los autores agradecen la valiosa asistencia técnica de Silvia Núñez y Joaquín V. González (Instituto Malbrán) y de la Lic. Paula Bos (Mount Sinai School of Medicine), destacando la dedicada colaboración de la Sra. Silvana Giuliano (voluntaria de LALCEC, Hospital Posadas). Las muestras de tejido de mama normal fueron provistas gentilmente por el Dr. J. Guerrisi (Servicio de Cirugía Plástica, Hospital Cosme Argerich, Buenos Aires).
Este trabajo fue subsidiado en parte por la Fundación Mosoteguy (Argentina) y T.J. Martell Foundation for Leukemia, Cancer and AIDS Research, the Hellen Block Memorial Fund and the Chemotherapy Fund (EEUU).

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Recibido: 7-02-2002
Aceptado: 29-04-2002