ARTÍCULOS ORIGINALES

Indicadores evolutivos y  de recuperación  medular en trasplante de Médula osea despues de irradiación corporal total

D.Dubner¹, M. del  R. Pérez¹, M. Barboza³, M. Sorrentino², A. Robinson², P. Gisone¹

¹Laboratorio de Radiopatología, ARN (Autoridad Regulatoria Nuclear);
²Servicio de Transplante de Médula Osea, Hospital Naval Pedro Mallo;
³Laboratorio de Inmunogenética, Hospital de Clínicas José de San Martín, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

Dirección postal: Dr. Pablo A. Gisone, Laboratorio de Radiopatología, Libertador 8250,1429 Buenos Aires, Argentina Fax: (54-11) 4379-8460. E-mail: pgisone@cae.arn.gov.ar

Resumen
El estrés oxidativo y el índice de madurez reticulocitaria (IMR) fueron estudiados en 27 pacientes sometidos a trasplante de médula ósea (TMO). En los pacientes con evolución no favorable, los lipoperóxidos mostraron un incremento entre el día 12-14 postransplante (mediana 1.83 µM rango 0.78-5.82) con respecto al precondicionamiento (mediana 1.05 µM rango 0.36-1.84 p<0.05).Los pacientes con evolución favorable revelaron un incremento de lipoperóxidos durante el condicionamiento (p<0.05) (mediana: 1.42 µM rango: 0.31-4.50) y un descenso significativo durante la tercera semana (mediana 0.77 µM rango 0.21-1.48) y cuarta semana postrasplante (mediana 0.60 µM rango 0.11-1.48) con respecto a los valores precondicionamiento (p<0.05  y  p<0.01 respectivamente). La actividad antioxidante total aumentó significativamente en los  pacientes que evolucionaron al óbito dentro de los 35 días postrasplante (n:3). El IMR reveló engraftment en los TMO alogénicos en el día 17 (rango 11-24) vs neutrófilos: día 21 (rango14-28 p<0.001). El incremento de lipoperóxidos durante los días 12-14 postrasplante fue predictor de evolución no favorable. El IMR resultó el más temprano detector de engraftment en TMO alogénicos. 

Palabras clave: Trasplante de médula ósea, Irradiación; Repoblación medular; Estrés oxidativo; Reticulocitos. 

Abstract
Prognosis and bone marrow recovery indicators in bone marrow transplantation after total body irradiation. Oxidative stress and reticulocyte maturity index (RMI) were studied in 27 patients who underwent bone marrow transplantation (BMT). Plasmatic lipoperoxide levels of those patients with unfavorable evolution were significantly increased on days 12-14 post-transplant (median 1.83 µM, range 0.78-5.82) compared with preconditioning levels (median 1.05 µM, range 0.36-1.84) (p <0.05). Patients with favorable evolution revealed significantly higher lipoperoxide levels during conditioning regime (median 1.42 µM, range 0.31-4.50) (p<0.05). Starting from the 3^rd post-transplant week a significant and continuous decrease was observed, with a  median of  0.77 µM (range 0.21-1.48  p<0.05) for the 3^rd, and a median of 0.60 µM (range 0.11-1.48 for the 4^th week (p<0.01). A significant increase in total antioxidant activity was observed  in the three patients who died up to the 35 days post-transplant. Recovery of bone marrow function was detected by RMI after a median time of 17 days (range 11-24) post-allogeneic transplantation. The threshold established for absolute neutrophil count was achieved after a median of 21 days (range 14-28) (p< 0.001). An increase of plasma lipoperoxides on days 12-14 post-transplant may be a predictive value of unfavourable evolution. RMI was the earlier indicator of engraftment in allogeneic BMT.

Key words: Bone marrow transplantation; Radiation; Engraftment; Oxidative stress; Reticulocytes.

El transplante de médula ósea (TMO) es un procedimiento que ha logrado, bajo ciertas condiciones, un cambio en la historia natural de la enfermedad hematológica maligna¹.
Los regímenes condicionantes para TMO generan mielotoxicidad a través de diferentes mecanismos de acción. Numerosos  estudios  han señalado a la producción de radicales libres como el principal mecanismo indirecto de daño radioinducido con baja transferencia lineal de energía (TLE) en sistemas biológicos², teniendo también un rol relevante  en la acción citotóxica de los fármacos citostáticos³. El estrés oxidativo asociado al efecto mieloablativo de los regímenes antedichos, se produce como la ruptura del equilibrio entre la generación de especies reactivas y la capacidad neutralizante de los sistemas antioxidantes⁴.
Este estado definido como el aumento de la concentración estacionaria  de especies reactivas, tiene en aquellos pacientes sometidos a irradiación de todo el cuerpo (ITC)  como medio condicionante, una respuesta bifásica en la mayor parte de los casos, que se expresa como un incremento pronunciado de ERO (especies reactivas del oxígeno) y lipoperóxidos (LP) durante el condicionamiento y un incremento tardío  debido a las condiciones sistémicas del enfermo durante su evolución.
Por otra parte, los parámetros hematológicos de recuperación medular permiten detectar el momento de engraftment del transplante. El análisis citométrico de las poblaciones reticulocitarias de sangre periférica provee una medida objetiva de la madurez reticulocitaria  a través de la correlación entre la intensidad de fluorescencia obtenida con un colorante específico y el contenido de ARN,  permitiendo estimar un índice de madurez reticulocitaria (IMR) definiendo poblaciones con alta, media y baja intensidad de  fluorescencia⁵.
La presencia de reticulocitos de alta fluorescencia podría  ser considerada como una expresión temprana de la actividad eritropoyética, y ésta un indicador de la reactivación hematopoyética global⁶. El objeto del presente trabajo es evaluar parámetros de estrés oxidativo como potenciales indicadores evolutivos y la expresión del IMR como instrumento de detección de recuperación  medular postransplante (pt), utilizando ITC como condicionante de TMO con el propósito  de contar con indicadores de rápida implementación  en la práctica hematológica y en la potencial evaluación y seguimiento de personas sobreexpuestas a radiaciones ionizantes.

Materiales y métodos

Descripción de los pacientes y del esquema de toma de muestras 

En este estudio fueron enrolados 27 pacientes. Las características clínicas de los mismos y el tipo de TMO están descriptos en la Tabla 1. El régimen condicionante pretrasplante consistió en quimioterapia (comenzada en el día -9) combinada con radioterapia (realizadas entre los días -4 y -1). Todos los transplantes incluidos en este estudio fueron grupos sanguíneos  compatibles.

 

La quimioterapia se administró de acuerdo a los siguientes esquemas: ciclofosfamida (CFM) (120 mg/kg), CFM (120 mg/kg) + mercapto-etan-sulfonato de sodio (MESNA) (120mg/kg), CFM (60 mg/kg) + Etopósido (VP16) (30 mg/kg/día) de acuerdo a protocolos del Servicio.
La ITC fue administrada con una unidad de telecobaltoterapia y el protocolo de irradiación consistió en la administración de 12 Gy (Gray) en cuatro días, fraccionado en dos aplicaciones diarias de 1.5 Gy cada una, con una tasa de dosis de 0.04 Gy/min.
El TMO fue realizado en el día 0.
Las muestras de sangre fueron obtenidas el día anterior al inicio del protocolo de quimioterapia, diariamente durante el condicionamiento y tres veces por semana después del TMO hasta el alta del enfermo.
La inclusión de pacientes fue precedida por un consentimiento escrito e informado.

Parámetros de estrés oxidativo 

La determinación de lipoperóxidos plasmáticos y de la actividad antioxidante total (AAT) fue efectuada en plasma obtenido de muestras de sangre anticoagulada con EDTA y mantenida a -70 °C hasta su análisis. El contenido de productos de lipoperoxidación fue estimado como TBARS (sustancias reactantes con el ácido tiobarbitúrico) de acuerdo a la técnica  de Jentzch et al⁷. La misma se basa en la reactividad del  ácido tiobarbitúrico con el malondialdehido  (MDA), un producto de la degradación lipoperoxidativa. El resultado fue expresado como equivalentes de  (MDA) en µmoles/L
La determinación de la AAT fue realizada por técnica desarrollada por Miller et al⁸ basada en la formación del radical catión ABTS⁺ a partir de la reacción del 2,2'-azinobis (3-ethylben-zothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) con una peroxidasa como la metamioglobina y peróxido de hidrógeno. Los resultados son expresados como equivalentes de Trolox^Ò (derivado hidro-solubre de la vitamina E) en mmoles/L. El rango de normalidad para cada uno de estos parámetros fue determinado utilizando sangre proveniente de 15 adultos normales.

Parámetros hematológicos 

Para el estudio de reticulocitos, las muestras de sangre anticoagulada con EDTA fueron mantenidas a 4 °C, hasta su análisis dentro de las 48 h posteriores a la extracción.
Para su análisis por citometría de flujo, los reticulocitos fueron teñidos con naranja de tiazol (Retic-COUNT, BD) de acuerdo al protocolo suministrado por el fabricante.
Las muestras fueron analizadas en un citómetro Facstar Plus^Ò (Becton Dickinson), registrándose la fluorescencia de un mínimo de 50 000 células rojas. El porcentaje de reticulocitos así como la intensidad media de fluorescencia fueron calculados a través del software Lysis II. Para la determinación del IMR, la población reticulocitaria fue dividida en regiones de baja, moderada y alta fluorescencia. El IMR fue expresado como el cociente entre el número de reticulocitos en el área de la alta fluorescencia y el número total de reticulocitos (%)⁹.

Criterios de engraftment

Se definió engraftment mieloide como un incremento postras-plante en el número absoluto de neutrófilos mayor de 500 /µl en dos muestras consecutivas. El momento de recuperación trompopoyética fue definido como segundo incremento sucesivo de plaquetas sobre el valor umbral de 20000/µl. El engraftment eritroide estuvo indicado por la observación de dos incrementos consecutivos del IMR posterior al nadir del período pancitopénico.
El engraftment  no verificado por neutrófilos hasta el día 21 postrasplante fue definido como engraftment tardío.

Análisis estadístico

El análisis estadístico de los resultados de estrés oxidativo fue realizado a través del test  t para muestras apareadas y la prueba de rangos señalados de Wilcoxon. Los valores hematológicos fueron analizados a través de ANOVA de una cola, seguida de corrección  de Bonferroni y test del signo. Para análisis de correlación fue utilizado el coeficiente de correlación r de Pearson.
Para el cálculo de valores predictivos relacionados con lipoperóxidos, el esquema utilizado para la definición de categorías fue el siguiente:

El valor predictivo positivo fue calculado como el porcentaje de verdaderos positivos entre todos los resultados positivos: verdaderos positivos/verdaderos positivos + falsos positivos
De la misma manera el valor predictivo negativo fue calculado como el porcentaje de verdaderos negativos entre todos los resultados negativos: verdaderos negativos/ verdaderos negativos + falsos negativos.

Resultados

Para la categorización de los pacientes  se consideraron las siguientes variables: momento del engraftment detectado a través de las tres series, y muerte antes de los 90 días.
Dado que se ha comunicado la importancia del número de leucocitos totales en el día 16 pt como indicador precoz de riesgo de óbito antes de los 90 días por causa de hemorragia, infección o falla del transplante, este parámetro también  fue considerado en el estudio¹⁰.
Se consideró como de ENF a aquellos pacientes que presentaron por lo menos dos de las siguientes características: engraftment tardío, recuento de leucocitos menor o igual a 200 /µl en el día 16, y/o muerte antes de los 90 días pt. Ocho pacientes de 27 se encuadraron dentro de la categoría de ENF.
Los pacientes con EF alcanzaron engraftment por neutrófilos antes del día 21, mientras que 12 de 19 lo hicieron por plaquetas y 18 de 19  lo hicieron por IMR en el mismo día. Entre los pacientes con ENF 4 de 8 alcanzaron engraftment por neutrófilos al día 21, 2 de 8 por plaquetas y 4 de 8 por IMR en el mismo día. Seis de 8 pacientes con ENF fallecieron dentro de los 90 días pt y ninguno con EF. Entre los fallecidos 3 murieron antes de los 35 días pt a causa de sepsis. Tres pacientes fallecieron entre los 35 y los 90 días. Dentro de este último grupo uno falleció a causa de  neumonía en el día 43, y  dos a causa de enfermedad injerto contra huésped (EICH) en los días 60 y 90 pt siendo este último una EICH crónica diagnosticada en el día 8.
Otros parámetros diferenciales entre grupo EF y ENF se presentan en Tabla 2.

  

En todos los pacientes los niveles de TBARS se mantuvieron superiores al de referencia en una población adulta de sujetos sanos (0.34 +/-0.14 µM) durante todo el período de seguimiento.
Entre los dias 12 y 14 se constataron los valores más altos de TBARS, que no resultaron significativos en el análisis del conjunto, esto es, de ambos grupos, comparados con los valores precondicionamiento (Fig. 1).

 

 Sin embargo, analizando el grupo de los pacientes con ENF se constató que  superaban el cuartilo del 25% por arriba de la mediana de los valores totales. Este grupo presentó un incremento significativo en los valores de TBARS ( p<0.05) entre los dias 12-14 pt con una mediana de 1.83 µM (rango 0.78- 5.82) respecto del valor precondicionamiento: 1.05 µM (rango 0.36-1.84) (Fig. 2).

 

En el grupo de pacientes con EF el comportamiento de los TBARS durante el condicionamiento evidenció un incremento significativo en relación a los valores precondicionamiento: 1.42 µM (rango 0.31-4.5) vs 1.17 µM (rango 0.36-1.84) (p< 0.05), seguido de  un  descenso significativo durante la tercera semana pt: 0.77 µM (rango 0.21-1.48) y cuarta semana pt: 0.60 µM (rango 0.11-1.48) con respecto a los valores precondicionamiento (p<0.05 y p<0.01 respectivamente) (Fig. 2).
La predictibilidad positiva y negativa del parámetro Incremento de TBARS para ENF durante la segunda semana pt fue de 86% y 73% respectivamente. La predic-tibilidad positiva y negativa para No incremento de TBARS para EF fue 82% y 80% respectivamente.
Aunque no se hallaron diferencias significativas en AAT en ambos grupos, los pacientes con EF presentaron valores discretamente inferiores a los considerados como normales: (1.46 ± 0.16 µM) y evidenciaron una tendencia a normalizar los mismos después de la recuperación medular. Este comportamiento no fue observado en pacientes con ENF (Fig. 3).

 

Considerando individualmente los 3 pacientes que fallecieron antes de los 35 días, se pudo constatar un incremento relevante de AAT con respecto al valor precondicionamiento en etapas finales de la evolución (Tabla 3).

 

El ácido úrico representa entre el 35-65% de la AAT¹¹, contribuyendo también la bilirrubina, pero en menor proporción. En este sentido nuestros resultados permitieron constatar que el aumento de la AAT se correlacionó con un aumento simultáneo de la uricemia (Fig. 4).

 

En todos los pacientes, el IMR descendió más rápidamente que el número total de reticulocitos, y en algunos pacientes alcanzó un nadir de cero después del condicionamiento. Después del período aplásico el aumento en el IMR precedió al incremento de reticulocitos totales por varios días (Fig. 5).

Analizando el comportamiento de neutrófilos e IMR en los TMO alogénicos, el engraftment fue detectado en el día 17 (rango 11-24) por IMR, y en el día 21 por neutrófilos (p<0.001) (Fig. 6). Las plaquetas, en estos pacientes revelaron engraftment sobre día 25 (rango 19-31) pt.
En pacientes sometidos a TMO autólogo (n:3) el engraftment fue detectado por IMR y neutrófilos coincidentemente sobre el día 12 pt (rango 10-21).

 

Discusión

La optimización de indicadores biológicos distintos a los métodos clínicos y hematológicos convencionales capaces de predecir engraftment temprano y curso evolutivo de pacientes sometidos a TMO, podría ser beneficioso en términos de toma de decisiones.
Un disbalance oxidativo debido a la enfermedad de base así como a los esquemas de administración de fármacos antes del TMO podrían justificar los niveles elevados de LP observados en nuestros pacientes, en relación a una población normal.
Ha sido comunicado que un incremento de los LP durante el condicionamiento es verificable en pacientes que reciben ITC adicional y no en aquellos sometidos sólo a quimioterapia mieloablativa, esto es, que el condicionamiento radiante podría ser capaz de generar mayor estrés oxidativo¹². Por otra parte, este comportamiento ha sido relacionado por algunos autores con la eficacia de la técnica de mieloablación¹³.
Aunque no fue el propósito de esta comunicación el  intentar establecer relaciones causales entre la eficacia de la técnica mieloablativa y el aumento de los LP durante el condicionamiento, en nuestro estudio aquellos  pacientes que presentaron elevación  significativa de los mismos durante el condicionamiento presentaron también EF. Sin querer sugerir que la eficacia del transplante en términos de engraftment y evolución, pudiese descansar sólo en la mieloablación y con independencia de otros factores, este hallazgo podría señalar la importancia del balance prooxidante-antioxidante durante el condicionamiento.
El aumento del Fe libre a expensas de la citólisis constituye un mecanismo que  favorecería la producción de especies reactivas a través de la reacción de Fenton, en el período pt. En pacientes sometidos a TMO la  saturación de la capacidad de unión entre Fe y proteínas, añadido a su alta producción a expensas de la muerte celular de la línea eritroide, generan una alta concentración de Fe libre, particularmente en el día 0 y durante la segunda semana pt¹⁴. Del mismo modo, la afectación de los sistemas antioxidantes individuales es manifiesta en pacientes sometidos a TMO¹⁵.
Aunque el número de pacientes de nuestra serie es demasiado pequeño para obtener conclusiones definitivas, postulamos que el comportamiento de los LP durante la segunda semana pt podría  servir como indicador evolutivo de ENF y señalaría un deterioro progresivo de los pacientes a partir de intercurrencias, que impediría el retorno a valores precondicionamiento de TBARS, tal como se constata en pacientes con EF. Del mismo modo, el no aumento de LP en el mismo período tiene una razonable predictibilidad para la EF.
En relación a la AAT, los pacientes con EF presentaron una tendencia a incrementar su actividad en el curso del seguimiento evolutivo. Entre los pacientes con ENF, sólo en aquellos  que evolucionaron al óbito dentro de los 35 días pt se constató un incremento significativo de AAT coincidiendo con el aumento de bilirrubina y ácido úrico.
Coincidentemente con otros autores, nuestros valores de AAT precondicionamiento no presentaron diferencias significativas con los valores normales de una población de sujetos sanos. La no comprobación del descenso de AAT  pt, tal como fue comunicado por otros autores¹² podría deberse a la utilización de técnicas de capacidad antioxidante total distintas, o al hecho de que en nuestro trabajo no se midieron componentes antioxidantes individuales, excepto los antedichos.
La AAT incluye ascorbato, tioles proteicos, bilirrubina, urato y alfa-tocoferol. Dado que el sistema antioxidante es un complejo de interacciones y sinergismos, se ha postulado que la medición de valores totales como los utilizados en este trabajo no puede sustituir a la determinación de un perfil completo de los sistemas individuales¹⁶.

En relación a los parámetros de repoblación  medular, puede decirse que antes de los análisis automatizados, la accesibilidad del recuento de neutrófilos se imponía sobre el recuento de  la población reticulocitaria para el seguimiento del engraftment, dado que este último procedimiento resultaba engorroso e impreciso¹⁷.
Considerando que la restauración de la actividad hematopoyética  comienza por la línea eritroide¹⁸, el análisis de precursores reticulocitarios podría dar cuenta de la actividad hematopoyética total de la MO¹⁹.
El análisis por citometría de flujo de  subpoblaciones reticulocitarias fue desarrollado en los años 80 con el fin de monitorear la actividad eritropoyética en diversas patologías, a través de la utilización de colorantes fluorescentes que se combinan con el RNA ribosomal²⁰. La utilización de naranja de tiazol permitió superar ciertas limitaciones inherentes a otros colorantes fluorescentes y obtener una señal estable entre 30 y 90 min post-marcación²¹. Otra ventaja de esta técnica es que permite minimizar el error asociado a las transfusiones de sangre entera o glóbulos rojos sedimentados sobre el contaje del número total de reticulocitos²².
Nuestros resultados confirman que el corrimiento hacia la región de alta fluorescencia a partir de los reticulocitos de alto contenido de ARN y verificado a través del IMR, antecede de modo significativo al método convencional del recuento manual o automatizado de reticulocitos, neutrófilos y plaquetas en sangre periférica en pacientes con TMO alogénico^{23, 24}.
Es importante destacar que nuestro estudio no pudo comprobar en los trasplantes autólogos, tal como ha sido comunicado por otros autores²⁵, una ventaja del IMR en relación a neutrófilos. Esta discordancia podría estar en  relación al escaso número de pacientes autólogos reclutados.
Otro aspecto relevante de estos resultados, es la confirmación de la segunda semana como la de mayor valor predictivo de ENF de acuerdo a los LP, y en coincidencia con otros predictores tempranos como el recuento leucocitario.
En conclusión, el seguimiento de los LP durante la evolución postrasplante de pacientes sometidos a TMO puede constituir un útil aliado como predictor evolutivo temprano. Del mismo modo, el IMR se presenta como un método cuantitativo y de fácil implementación para la detección temprana de engraftment.
Serán necesarios estudios adicionales con mayor  número de pacientes para dilucidar la utilidad de la técnica de IMR en TMO autólogos en relación a las técnicas convencionales.
Dado que  la experiencia internacional  es desalentadora en cuanto a la utilización de TMO en la aplasia medular radioinducida a partir de accidentes radiológicos, ambas técnicas podrían ser utilizadas en radiopatología como predictores evolutivos y de repoblación medular asociadas a terapias adyuvantes y sustitutivas.

Agradecimientos: Expresamos nuestro agradecimiento a la Dra. Mónica Saracco pos sus valiosos consejos en la puesta a punto de la técnica de IMR.

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Recibido: 5 de Febrero de 2002
Aceptado: 18 de Septiembre de 2002