Importancia pronóstica de la expresión de MDR-1 en la leucemia mieloblástica aguda

Arbelbide J.¹, Garcia Rivello H.², C. Tacchi M. C.¹, Fantl D.¹, Cardenas M. P.¹, Penchasky D.¹, Viñuales S.¹, Morandi A.², Nucifora E. M.¹

¹ Servicio de Hematología,
² Servicio de Anatomía Patológica, Hospital Italiano de Buenos Aires

Resumen
   Una proporción importante de pacientes con leucemia mieloblástica aguda (LMA) presentan recaída o resistencia con el tratamiento. Uno de los mecanismos involucrados en la resistencia a drogas, es la presencia de la glicoproteína P 170 (gp-P 170) resultante de la expresión del gen MDR-1 sobre las células leucémicas. El objetivo de este trabajo es valorar el impacto pronóstico de la expresión de MDR-1 en una población de pacientes tratados por LMA. Se evaluó retrospectivamente la expresión de MDR-1 en una cohorte de 55 pacientes con LMA, mayores de 16 años, que recibieron tratamiento quimioterápico desde 1990 hasta el 2000. Se evaluó sobre biopsia de médula ósea, la expresión de MDR-1/gp-P 170 por inmunohistoquímica. Mediante una curva ROC, se estableció que una expresión de MDR-1 > 50% en células blásticas, resultó significativa para el logro de remisión completa. Esta expresión de MDR-1+ correlacionó con la presencia de leucocitosis: (p:0.002), expresion de células CD34+ (p:0.006), menor tasa de remisión completa (p:0.001), mayor tasa de recaída (p:0.02) y de estudios citogenéticos no favorables (p:0.02). La SLE fue de 21.2% ES:9.3 con un seguimiento de 22 meses para el grupo MDR-1+ versus 56.4% ES:12.5 con un seguimiento de 78 meses en los casos MDR-1- (p:0.007). Se puede concluir que la expresion de MDR-1 ha demostrado ser un factor pronóstico de resistencia a la quimioterapia. Estos pacientes presentan una menor tasa de remisión completa, una mayor tasa de recaída por persistencia de enfermedad residual post-tratamiento, lo que produce una menor sobrevida global.  

Palabras clave: MDR-1; Multirresistencia a drogas; Leucemia mieloblástica aguda.

Abstract
   An important number of patients with Acute Myeloid Leukemia (AML) experience relapse or resistance to chemotherapy. One of the mechanisms involved in this resistance is the presence of glycoprotein P170 (gp-P 170), which results of the MDR-1 gene in leukemic cells. The objective of this article is to assess the prognostic impact of the expression of MDR-1 in a group of patients treated for AML. The expression of MDR-1 was retrospectively assessed in a cohort of 55 patients with AML, older than 16 years old, who received chemotherapy from 1990 to 2000. The presence of MDR-1/gp-P170 was evaluated on bone marrow biopsy by immunohistochemistry. A ROC curve established that an expression of > 50% of MDR-1 on blastic cells was significant for the achievement of complete remission. The expression of MDR-1+ correlated with the presence of leucocytosis (p:0.002), expression of CD34+ cells (p:0.006), less achievement of complete remission (p:0.001), more rate of relapse (p:0.02) and of non-favorable cytogenetics (p:0.02). The event-free survival was of 21.2% SE:9.3 with a follow up of 22 months for the group of MDR-1+ versus 56.4% SE 12.5 with a follow-up of  78 months for the MDR-1- group (p:0.007). It can be concluded that the expression of MDR-1 is a prognostic factor of resistance to chemotherapy. These patients present a lower rate of complete remission, a higher rate of relapse with persistence of post treatment residual disease, which produces a shorter global survival.

Key words: MDR-1; Multidrug resistance; Acute myeloid leukemia; AML.

   Si bien durante las últimas décadas, con el tratamiento quimioterápico se ha obtenido una mayor tasa de remisión completa^{1, 4} y sobrevida libre de eventos en los pacientes con leucemia mieloblástica aguda (LMA)^{5, 11}, aún hay una proporción importante de pacientes que experimenta recaída o resistencia al tratamiento muriendo como consecuencia de las complicaciones de la enfermedad. Uno de los mecanismos involucrados en la resistencia a las drogas quimioterápicas, es la presencia de la glicoproteína P (gp-P) 170 resultante de la expresión del gen MDR-1 sobre las células leucémicas¹². La actividad de la bomba dependiente de energía de la gp-P 170 permite la eliminación de drogas relacionadas y no relacionadas con la quimioterapia, causando resistencia al tratamiento. La exposición a drogas quimioterápicas induce la sobreexpresión de la gp-P 170 en células blásticas¹³,  actuando como un mecanismo de defensa adaptativo ante la exposición a un estímulo letal, independiente de que la droga sea sustrato o no de la gp-P 170. La expresión de MDR-1 ha sido identificada como un factor pronóstico independiente adverso para la obtención de remisión completa y sobrevida en pacientes con LMA^{14, 20}. Se ha observado que las células leucémicas CD34+ que coexpresan MDR-1 tienen un aumento de la actividad funcional de la gp-P 170, lo que les confiere una mayor resistencia a drogas, correlacionando con una menor respuesta al tratamiento quimioterápico y presencia de niveles elevados de enfermedad  residual mínima en pacientes con LMA²¹. El objetivo de este trabajo es valorar el impacto pronóstico de la expresión de MDR-1 en una población de pacientes con LMA tratados en nuestra institución. 

Material y métodos

   Pacientes: Se evaluó en forma retrospectiva la expresión de MDR-1 en una cohorte de 55 pacientes consecutivos mayores de 16 años, con diagnóstico de LMA, que ingresaron a nuestro hospital desde marzo de 1990 hasta marzo del 2000. Se excluyeron del análisis a los casos que fallecieron antes de ser evaluables para el logro de remisión completa. La edad media fue de 45 ± 14 años, hubo 23 mujeres y 32 varones, 45 LMA fueron primarias y 10 secundarias. Se clasificó a la LMA según los criterios de la French-American-British classi-fication (FAB) y se estableció que hubo: M0: 2 pts, M1: 14 pts, M2: 13 pts, M3: 9 pts, M4-M5: 13 pts, M6: 1 pte, M7: 1 pte y 2 pts con LMA secundaria a mielodisplasia no pudieron clasificarse. Se realizó inmunofenotipificación por citometría de flujo desde 1992 y estudios citogenéticos con técnicas de bandeo habituales. Se consideró el estudio citogenético como de pronóstico favorable(F) cuando tenia: t(15;17), t(8;21) o inv16; intermedio(I): Citogenético normal, trisomía 8, 11q23, y desfavorable(D): alteraciones citogenéticas complejas que comprometen más de 2 cromosomas, monosomía 5 o 7, inv(3q), 20q, 21q, t(6;9), t(9;22).
    Tratamiento: Todos los pacientes recibieron tratamiento quimioterápico de inducción con Ara-C 200 mg/m²/día en infusión continua (día 1-7) e idarrubicina 12 mg/m²/día (día 1-3). Se realizó tratamiento de consolidación con alta dosis de Ara-C 2 gr/m²/dosis cada 12 horas (día 1-4) combinada con Mitoxantrona 12 mg/m²/día (día 1-3) (consolidación 1) y VP16 200 mg/m²/día (día 1-5) (consolidación 2). Los pacientes con Leucemia Promielocítica (M3) realizaron inducción con ATRA 45 mg/m² e Idarrubicina 12 mg/m²/d día 6 a 9 y consolidaciones con idarrubicina 12 mg/m²/dosis día 1 a 3. Se consideró remisión completa a la recuperación de la hematopoyesis normal con menos del 5% de blastos en médula ósea y normalización del hemograma. El empleo de trasplante de médula ósea como parte de la terapéutica quedó a decisión del médico tratante según los factores de mal pronóstico que presentaba cada paciente.

Evaluación de MRD-1 y CD34:

   Se realizaron cortes histológicos de 5 micrones de espesor de biopsias de médula ósea fijadas en Bouin e incluidas en parafina para estudios morfológicos de rutina (hematoxilina-eosina, Giemsa, reticulina).
    En todas las muestras se cuantificó la proporción de blastos con respecto a la población hematopoyética, empleando criterios morfológicos habituales.
    Para evaluar la expresión de MDR-1/Pgp 170 se empleó el anticuerpo monoclonal clon C494 (Signet, EEUU) en una dilución 1:80 en PBS. Este anticuerpo detecta específica-mente un epitope citoplasmático que se expresa únicamente en la proteína MDR-1/Pgp 170 transmembrana y presenta patrón de membrana.
    El estudio de la expresión de CD34 se realizó con el anticuerpo monoclonal Qbend10 (Biogenex, EEUU) en una dilución 1:100 en PBS.
    Las tinciones inmunohistoquímicas se realizaron con la técnica de estreptavidina biotina (sistema Multilink, Biogenex, EEUU) y revelado con diaminobencidina (Biogenex). La contracoloración nuclear fue realizada con hematoxilina.
    Se emplearon métodos de recuperación antigénica con citrato de sodio 0.01M en horno de microondas. El procedimiento se realizó en forma automatizada en el instrumento para inmunohistoquímica Optimax 2.6 (Biogenex, EEUU).
    La evaluación de la expresión de los marcadores se realizó en los blastos, y fue considerada positiva o negativa (no se evaluó la intensidad de la marcación). Se evaluaron 30 campos de gran aumento (400x) en cada muestra para establecer la proporción de blastos positivos con MDR-1 y CD34 sobre el total de blastos.
    Evaluación: Dado que existen diferentes trabajos con distintas técnicas para evaluar la expresión del MDR-1, se estableció en este trabajo mediante una curva ROC, un valor de corte para la expresión de MDR-1 que resultó significativo para el logro de la remisión. Posteriormente, se correlacionó el MDR-1 con la presencia de factores pronósticos desfavorables para LMA como: edad, LMA secundaria, estudio citogenético desfavorable y leucocitosis. Se evaluó el impacto del MDR-1 sobre las recaídas, sobrevida libre de eventos y sobrevida global.
    Estadística: Se utilizó el Chi cuadrado con corrección de Fisher para el análisis de variables no paramétricas, el test de Spearman para correlacionar variables no paramétricas, las variables paramétricas se analizaron utilizando ANOVA considerándose una p < 0.05 como significativa. La duración de la remisión (RC) se midió desde la fecha en que se documentó la RC hasta la recaída. Para la duración de la remisión se utilizó el método actuarial de Kaplan y Meier y las comparaciones fueron hechas por log-rank test. Con la finalidad de determinar el valor pronóstico de la expresión de MDR-1 para la sobrevida libre de eventos, se excluyó del análisis a los pacientes que no lograron remisión completa con el tratamiento de inducción y reinducción (8 pacientes).

Resultados

   La expresión de MDR-1 demostró tener significación estadística para la obtención de remisión completa según la curva ROC (Fig. 1), con un área bajo la curva 0.76     (p: 0,006), siendo el valor de corte significativo para   MDR-1 > 50%.
    Se realizó una correlación entre la expresión de MDR-1 y otros factores de mal pronóstico en LMA como: edad (p: ns), leucocitosis: (p: 0.002) por Spearman y LMA secundaria (p: ns), LMA M3 (p: 0.006), estudios citogenéticos favorables vs no favorables (p:0.006) por ANOVA. Se evaluó cuáles de estos factores pronósticos fueron significativos para el logro de remisión completa en esta población (Tabla 1). Los factores pronósticos desfavorables con significancia estadística fueron: la expresión de MDR-1 (p:0.001) y CD34 (p: 0.05), observándose una mayor tasa de remisión cuando el estudio citogenético es favorable (p: 0.07), siendo leucemias promielocíticas la mayoría de estos casos.

 

 

Análisis del MDR-1 según los valores de corte:

   Observamos una expresión de MDR-1 en blastos > 50% en 31 de los 55 pacientes evaluables (56.4%). En la Tabla 2 se evalúa la asociación entre la expresión de MDR-1 con variables clínicas y pronósticas de la LMA. Se logró remisión completa (RC) con una inducción en 43 pts (78.1%), 12 pacientes realizaron reinducción obteniendo RC 5 pts (41.6%). Se observó recaída en 23/48, siendo en el grupo de MDR-1- de 7/24 (29.1%) vs. MDR-1 + 16/24 (66.6%) p: 0.02. En el análisis actuarial por Kaplan Meier para sobrevida libre de eventos (SLE) en 48 pts evaluables se observó una SLE del 21.2% ES: 9.3 con una media de seguimiento de 22 meses (IC 95%: 11-32) para el grupo con MDR-1 + y una SLE de 56.4% ES: 12.5 con una medía de seguimiento de 78 meses (IC 95%: 51-105) para MDR-1-, siendo la SLE menor para el grupo que expresa MDR-1 + (p: 0.007 por log rank test) (Fig. 2). La sobrevida global por Kaplan Meier fue mayor en el grupo sin expresión de MDR-1- 41.2% ES:10.1 con una media de seguimiento de 59 meses (IC 95%: 36-82) vs 6.4% ES: 5.7 con una medía de 27 meses (IC 95%: 12-41), p: 0.048 por log rank test (Fig. 3).

 

 

 

Discusión

   La expresión de MDR-1 en las LMA de novo ha demostrado ser un factor pronóstico adverso para el logro de la RC y sobrevida libre de eventos^14-20.
    El desarrollo de mecanismos de resistencia al tratamiento quimioterápico constituye el mayor problema para el manejo de pacientes recaídos o refractarios. Algunos autores han evaluado la expresión de MDR-1 en las recaídas de LMA, encontrando que los pacientes que son refractarios o recaídos expresan más frecuentemente MDR-1 que las LMA de novo^{22, 24}. La expresión de MDR-1 en LMA varía desde el 27 al 75 % según lo reportado por diferentes autores^{22-23, 25-31} siendo en nuestro trabajo del 56.4%. Estas diferencias cuantitativas en la expresión del MDR-1 en los diferentes estudios, es el resultado del uso de diferentes técnicas metodológicas y estadísticas en su evaluación. La expresión de MDR-1 se puede analizar utilizando métodos inmunocitoquímicos o inmunohistoquímicos, citometría de flujo, métodos que evalúan la función de la bomba de la P-gp 170 midiendo el eflujo de drogas y cuantificación de la expresión del ARN del MDR-1 o el ARN mensajero (ARNm) por reacción de la polimerasa por transcriptasa reversa (RT-PCR)^32-34. La obtención de un valor de corte significativo para la expresión del fenotipo MDR-1+ no está claramente establecida; varios autores han establecido diferentes valores de corte: 5%^{23, 30, 35}, 20%^{28, 36, 37} y 30%²⁹ de células leucémicas positivas. Sin embargo, la utilización de estos valores de corte pre-establecidos en forma arbitraria pueden no contribuir en forma significativa al pronóstico. Por este motivo, establecimos para nuestra cohorte un valor que correlacionara el porcentaje de células positivas para la expresión de MDR-1 con la respuesta al tratamiento quimioterápico, observando mediante la realización de una curva ROC que el valor de corte significativo es > al 50%. De manera similar que en otros trabajos, no se encontró asociación significativa entre la expresión de MDR-1 con edad y sexo. Se encontró una correlación significativa entre la expresión de MDR-1 + y la leucocitosis (p:0.05), en concordancia a lo reportado por otros autores^{28, 36.}. También se observó correlación en la co-expresión de MDR-1 + y CD34+ en células leucémicas (p: 0.006), esta asociación reportada en la literatura disminuye la respuesta al tratamiento, encontrándose niveles elevados de enfermedad residual mínima en estos pacientes^{29, 38-40}. La falta de expresión de MDR-1 se encontró asociada a estudios citogenéticos favorables (p: 0.02), especialmente a la presencia de t(15; 17)  característica de la leucemia promielocítica (p: 0.006), como ha sido documentada en otras series de casos^{28, 41, 42}. En nuestro trabajo, la expresión de MDR-1 ha demostrado ser un factor pronóstico de resistencia a la quimioterapia, observándose en estos pacientes una menor tasa de remisión completa (p: 0.001), resultados similares a los publicados por otros autores^{14, 28, 29, 37}. La menor duración de la RC en los pacientes con expresión de MDR-1 se debe a la presencia de una mayor enfermedad residual post-tratamiento, lo que se evidencia en una mayor tasa de recaída (p: 0.02), una menor sobrevida libre de eventos (p: 0.007) y una menor sobrevida global (p: 0.048).
    En conclusión, creemos que la detección del fenotipo MDR-1+  a través de la gp-P 170 permite identificar a los pacientes que pueden resultar resistentes al tratamiento clásico de inducción en leucemias mieloblásticas agudas de novo. Esta información permitiría modificar la estrategia terapéutica a implementar en estos casos, utilizando agentes que bloqueen la función de la gp-P 170 o drogas con niveles intracelulares que no estén modificados por esta bomba. Los trabajos realizados con drogas como el PSC-833^{43, 44} que modulan la actividad de la bomba gp-P 170 han demostrado incrementar la toxicidad de los regímenes empleados, lo que dificulta el uso de estos agentes, pero aún la experiencia en la modulación de la bomba es bastante limitada. La mayor tasa de recaída observada para el subgrupo de pacientes con expresión de MDR-1 que logra  remisión completa, requeriría la implementación de otras alternativas terapéuticas en función del nivel de enfermedad residual mínima, para obtener mejores resultados.

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Recibido: 30 de abril de 2003
Aceptado: 24 de junio de 2003