Detección de micrometástasis de carcinoma de colon en ganglios linfáticos

 Roma A.¹, Alvarez C.²,  Paes De Lima A.², Denninghoff V.¹, Elsner B.^1-2

¹Servicio de Patología, CEMIC; ²Departamento de Patología, Hospital de Clínicas José de San Martín, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

Resumen
En el carcinoma colorrectal la diseminación a los ganglios linfáticos es un factor pronóstico reconocido. La presencia de ganglios linfáticos con micrometástasis en muchos casos no puede ser detectada por técnicas rutinarias. Se estudiaron prospectivamente 162 ganglios linfáticos de 30 pacientes con carcinoma de colon, los cuales según los resultados de las técnicas rutinarias fueron clasificados como Dukes A (2), Dukes B (19) y Dukes C (9). Un paciente con enfermedad colónica benigna se uso como control negativo. Todos los ganglios se seccionaron en mitades, una de las cuales se almacenó en nitrógeno líquido para su ulterior estudio por técnicas de biología molecular, mediante la expresión del antígeno carcinoembrionario (CEA). La otra mitad fue fijada en formaldehído e incluida en parafina para su estudio anatomopatológico e inmunohistoquímico. Del total de los casos se detectó un aumento del 50%  de la sensibilidad en la detección de micrometástasis mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (RT-PCR) para los Dukes A-B y se detectó la expresión de dicho antígeno en el total de los casos Dukes C. Estos resultados evidencian una mayor sensibilidad en la detección de micrometástasis utilizando RT-PCR en comparación con las técnicas rutinarias, incluyendo la inmunohistoquímica.

Palabras clave: Carcinoma colorrectal. Dukes B. Micrometástasis. RT-PCR. CEA.

Abstract
Dissemination of lymph  nodes is a known prognostic factor in colorectal carcinoma. Micrometastases in lymph nodes can be missed when studied by routine techniques. We analyzed 162 lymph nodes from 30 patients with colonic carcinoma and using routine techniques, they were classified as follows: two Dukes A; nineteen Dukes B; and nine Dukes C. A patient with benign colon disease served as negative control. Lymph nodes were all sectioned in halves, with one of the halves stored in liquid nitrogen for molecular biology examination by carcinoembryonic antigen expression. The other formalin-fixed and paraffin embedded halves were saved  for both pathologic and immunohistochemical examination. For Dukes A and Dukes B tumors, reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) had a 50% higher sensitivity in the detection of micrometastases. The expression of carcinoembryonic antigen (CEA) was detected in all Dukes C cases, which were considered as positive controls. These results showed that RT-PCR has a higher sensitivity in the detection of micrometastases than routine techniques, including immunohistochemistry.

Key words: Colorectal carcinoma. Dukes B. Micrometastasis. RT-PCR. CEA.

   La sobrevida de los pacientes con carcinoma colorrectal disminuye con la diseminación metastásica de la enfermedad. Ello implica que la correcta valoración del estadio tumoral es esencial para la determinación del pronóstico y un adecuado tratamiento^1-2. En pacientes con un estadio II según la clasificación del T.N.M., la sobrevida a 5 años es del 80%, en cambio con un estadio III, que presenta metástasis ganglionares, la sobrevida cae al 45-50%². La cirugía es el tratamiento habitual para los pacientes con carcinoma colorrectal en el estadio II, agregándose la quimioterapia adyuvante para el estadio III³. La exacta determinación del estadio tumoral permite un adecuado tratamiento, aumentando la sobrevida de los pacientes. Trabajos publicados^3-5 citan la presencia de ganglios linfáticos con "mínima cantidad de tumor" la cual no puede ser detectada por las técnicas rutinarias, incluyendo la inmunohistoquímica (IHQ)^2,6,7. Se ha utilizado el término de "micrometástasis"⁶ cuando esa mínima cantidad de tumor es menor de 2 mm.  Para aumentar la sensibilidad y detectar las micrometástasis, se sugirió realizar cortes seriados a distintas alturas, posibilitando evaluar los ganglios linfáticos en su totalidad. Se encontró que hasta el 33% de los ganglios linfáticos diagnosticados como negativos en los cortes rutinarios con hematoxilina-eosina contenían micrometástasis al ser reexaminados mediante cortes seriados a distintas alturas del mismo^6,8. Este método generalmente ha sido utilizado en casos donde los cortes iniciales mostraban características sospechosas de malignidad y no así en las disecciones de ganglios regionales, debido a la impracticabilidad y el costo técnico-médico de evaluar decenas de ganglios linfáticos en su totalidad^6,8.  Varios autores describen que se puede lograr un aumento de la positividad al emplear una de las técnicas de biología molecular: la reacción en cadena de la polimerasa reversa (RT-PCR)^{2, 9, 10-12}. El objetivo de nuestro trabajo fue evaluar el aumento de la sensibilidad en la detección de micrometástasis ganglionares en pacientes con carcinoma colorrectal estadio II, según la clasificación del T.N.M., mediante la detección del antígeno carcinoem-brionario (CEA) por RT-PCR nested. 

Materiales y métodos

Se estudiaron 162 ganglios linfáticos de 30 pacientes con carcinoma colorrectal. Los mismos fueron clasificados según la nomenclatura de Dukes, utilizando el estudio rutinario de hematoxilina y eosina de la siguiente manera:  A: 2 casos, B: 19 casos y C: 9 casos. Como control negativo se utilizó un paciente con enfermedad colónica benigna (angiodisplasia). Del total de los pacientes, 15 eran de sexo femenino y 15 de sexo masculino, con una edad media de 65.7 años (entre 37 y 87 años). La localización tumoral fue en 11 casos en colon sigmoide, 8 en recto, 7 en ciego y 4 en colon ascendente, con un tamaño tumoral medio de 5.3 cm (entre 3 y 10.4 cm). El diagnóstico histológico en todos los casos fue de adenocarcinoma, 24 moderadamente diferenciados, 4 pobremente y 2 bien diferenciados. Los ganglios linfáticos fueron disecados en fresco en las piezas de resecciones colónicas. Se eligió un ganglio rotulado como W, debido a tener un tamaño mayor a 1cm o por ser  macroscópicamente sospechoso de tener metástasis, y por separado se eligieron 5 ganglios peritumorales macroscópi-camente negativos (rotulados como Z).  De sólo 11 pacientes se obtuvo ganglio W. Todos los ganglios se seccionaron en mitades para ser estudiados simultáneamente con técnicas más sensibles. Una de las mitades fue fijada en formaldehído al 10% e incluida en parafina para su estudio patológico e inmuno-histoquímico (IHQ) con anticuerpos monoclonales y policlo-nales para la detección de CEA y citoqueratinas (CK AE1-AE3, Dako, CA, USA). La otra mitad se almacenó en nitrógeno líquido para ser estudiada por técnicas de biología molecular, se extrajo ARN total (ARNt) por técnica de columna (Promega, WI, USA). La pureza y el rendimiento del ARNt fue medido     por espectroscopia. Entre 250ng y 1 µg de ARNt fue utilizado para la transcripción reversa.  Solamente el ARN mensajero (ARNm) que codifica para la proteína CEA fue transcripto a ADN complementario (cDNA). El mismo fue amplificado y reamplificado usando primers outer y nested secuencia-específicos (Invitrogen, CA, USA) homólogos a una región que codifica para el CEA, cuya secuencia nucleotídica fue la siguiente: A: 5'-TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG-3'; B:    5-'TGTAGCTGTTGCAAATGCT TTAAGGAAGAAGC-3'; C:    5'-GGGCCACTGTCGGCATATCATGATTGG-3' ⁸. La primera PCR usando los primers A y B amplificó un fragmento de 160 pares de bases (pb) que fue seguida de una segunda PCR usando los primers B y C para obtener un producto de 131pb según técnica descripta por Gerhard y col⁸. Se amplificó en condiciones similares mediante técnica de RT-PCR nested, un fragmento de 315-248pb correspondiente al ARNm de la enzima gliceroaldehído 3'-fosfodeshidrogenasa (GAPDH) como control de amplificación, verificando de esta manera una buena calidad de extracción de ARNm y ausencia de inhibidores de reacción en la muestra¹³. Se contaba con controles positivos y negativos. Todas las RT-PCR nested fueron evaluadas mediante electroforesis en geles de poliacri-lamida al 9% en buffer TBE1X, visualizadas con bromuro de etidio bajo luz ultravioleta y fotografiadas (Fig. 1 y 2).

   Se efectuó un test de kappa Yule's Q (variables discretas, no ordenadas, simétricas) para establecer el grado de asociación entre ambas formas diagnósticas.

Resultados

En la totalidad de los ganglios diagnosticados mediante hematoxilina y eosina como Dukes B, no se observó positividad para CEA y citoqueratinas mediante IHQ (Tabla 2). Dentro de este grupo, según se muestra en la Tabla 1, se observó positividad para la detección del ARNm que codifica para el CEA en nueve casos con la técnica de RT-PCR nested, otros nueve casos fueron negativos, y por último en un caso no se obtuvo material amplificable (MNA) por RT-PCR nested. Consideramos un ganglio como MNA cuando la RT-PCR nested para GAPDH es negativa, indicando degradación del ARN. Cinco de los nueve casos positivos por RT-PCR nested tenían ganglios W, macroscópicamente agrandados o sospechosos, donde se detectó ARNm de CEA en los cinco.

   

 

En todos los casos Dukes C, la IHQ para CEA y citoqueratinas mostraron positividad en las células neoplásicas de los ganglios metastásicos. Como se muestra en la Tabla 1, en siete de los nueve Dukes C estudiados se observó positividad para la detección del ARNm que codifica para el CEA. En los dos casos restantes no se obtuvo material amplificable (MNA). Cabe destacar que en uno de los casos el material disecado como W evidenció que el mismo no correspondía a un ganglio linfático; la determinación de CEA mediante RT-PCR del mismo fue negativa, por lo tanto fue considerado como un control negativo intra-ensayo.
   La IHQ en ambos Dukes A fue negativa, como se muestra en la Tabla 1, pero en uno de ellos se identificó ARNm que codifica para el CEA mediante la RT-PCR nested.
   Los controles positivos y negativos dieron los resultados esperados.
   El test estadístico realizado arrojó una asociación moderada entre el diagnóstico clásico y el diagnóstico mediante técnicas de BM de los ganglios con un estadio II según la clasificación del T.N.M., con un índice de asociación de 0.5.

Discusión

En el carcinoma colorrectal la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos peritumorales es el factor pronóstico más reconocido¹ pero aproximadamente el 20% de los pacientes sin metástasis, en el estudio rutinario fallecen por su  tumor. Estos datos sugieren que pacientes con un estadio Dukes B están subclasificados por falta de detección de metástasis, fundamentalmente a los ganglios linfáticos. Se han publicado varios trabajos donde se evaluó mediante IHQ ganglios linfáticos histoló-gicamente negativos y se demostró un aumento de la detección de células neoplásicas entre el 10 y el 23%^{6, 10-12}. Greenson y col.¹⁴ concluyeron que pacientes con Dukes B con células positivas para citoqueratina en los ganglios linfáticos pericolónicos tenían una sobrevida semejante a la de pacientes Dukes C y por otro lado los pacientes Dukes B sin la presencia de células tumorales tenían un pronóstico comparable a los Dukes A.  Sin embargo la sensibilidad para evidenciar metástasis por técnicas rutinarias incluyendo la IHQ no es lo suficientemente alta para detectar la totalidad de las mismas y por lo tanto se planteó la utilización de técnicas más sensibles, como PCR^6,10-12. Mori y col.¹¹ estudiaron una variedad de carcinomas evaluando por RT-PCR la presencia de metástasis en ganglios linfáticos mediante la expresión del ARNm que codifica para CEA, detectando un aumento de positividad del 26 al 66% usando RT-PCR en ganglios linfáticos histológicamente negativos. En el trabajo realizado por Liefers y col.² de los pacientes con estadio II sin micrometástasis, sólo 1/12 (8%) tuvo recurrencia a los 15 meses. En contraste, en el grupo de pacientes con micrometástasis la recurrencia se eleva al 49-58% con seguimiento de 36-60 meses respectivamente². Los pacientes con estadio II con microme-tástasis en los ganglios linfáticos podrían ser considerados como pacientes de alto riesgo¹¹. Por definición, los adenocarcinomas Dukes C poseen metástasis ganglio-nares diagnosticadas mediante exámenes histopatoló-gicos (hematoxilina y eosina), por lo tanto fueron considerados controles positivos de metástasis según el diseño experimental del ensayo para la detección de CEA y citoqueratinas mediante IHQ y la RT-PCR nested desarrollado. En cambio en uno de los dos casos Dukes A, que considerábamos podrían ser controles negativos, se detectó ARNm para CEA mediante BM. Con solo dos casos no se pueden hacer afirmaciones concluyentes. Según los resultados obtenidos en nuestro trabajo se evidenció un aumento de la detección de micrometástasis en un 50% de los Dukes B (Tabla 3). En conclusión, la técnica RT-PCR desarrollada para el CEA es específica, sensible y de gran utilidad para la detección de micrometástasis en ganglios linfáticos peritumorales en pacientes con carcinoma de colon, pudiendo modificar la estadificación y tratamiento de los pacientes con estadio II. Dada la cantidad de casos, nuestro trabajo debe ser considerado un  generador de hipótesis, prospectivo, por lo que en él la biología molecular no puede ser utilizada como modificadora de la clasificación inicial ni guía de tratamiento.

Agradecimientos: A Valeria P. Melia, de la Unidad de Investigación Dr. Baron, por la traducción al inglés del trabajo. A Hugo Krupitzki por el asesoramiento estadístico.

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Recibido: 26 de agosto de 2002
Aceptado: 27 de junio de 2003