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Medicina (Buenos Aires)

versión impresa ISSN 0025-7680versión On-line ISSN 1669-9106

Medicina (B. Aires) v.63 n.5 Buenos Aires sept./oct. 2003

 

Comportamiento diastólico durante la fase de "hipercontracción" post- isquémica en el miocardio atontado de conejo

González G. E., Mangas F., Depetris Chauvin A., Monroy S. , Donato M., Morales C., Gelpi R. J.*

Laboratorio de Fisiopatología Cardiovascular, Departamento de Patología, Facultad de Medicina. Universidad de Buenos Aires

Resumen
El objetivo del estudio fue determinar si la fase de "hipercontracción" (HC) que ocurre al comienzo de la reperfusión (R) en el miocardio atontado, presenta alteraciones diastólicas, y si la R con bajo Ca2+ modifica las mismas. Corazones aislados e isovolúmicos de conejos fueron divididos en 2 grupos. El grupo 1 (G1, n=11) fue perfundido con Ringer ([Ca2+]=2mM) y sujeto a 15 min de isquemia y 30 de R. El grupo 2 (G2, n=10) se reperfundió 10 min con Ringer ([Ca2+]=1mM) que fue incrementado a 1.5 y 2 mM a los 30 min de R. Se evaluó: la contractilidad miocárdica (+dP/dtmáx), la rigidez diastólica (presión diastólica final (PDFVI)) y la relajación (t1/2 y cociente +P/-P). Al minuto de R la contractilidad se recuperó en G1 (76.88±5.37% vs valor preisquémico) y fue atenuada en G2 (48.22±3.40% vs. valor preisquémico; P<0.05 vs G1). La PDFVI en G1 se incrementó desde el inicio de la R, aunque se correlacionó negativamente con el grado de HC (r= - 0.7477; p=0.008), o sea a mayor HC menor PDFVI. La R con bajo Ca2+ atenuó el aumento de PDFVI (P<0.05 vs G1) al minuto y a los 30 min. La relajación se enlenteció en forma continua hasta los 2 min en ambos grupos, (G1 vs G2, NS). En conclusión: La fase de HC se acompaña de alteraciones diastólicas. El grado de HC está en relación inversa con la PDFVI. Durante la R la rigidez continuó aumentando, mientras que la relajación se normalizó. La perfusión con bajo Ca2+ atenuó la HC y mejoró las alteraciones diastólicas solamente en lo referente a la rigidez.

Palabras clave: Isquemia. Miocardio atontado. Hipercontracción post-isquémica. Bajo calcio.

Abstract
The objective was to determine whether  "hypercontraction" (HC) that occurs at the beginning of reperfusion (R) in stunned myocardium is accompanied by diastolic alterations and determine if the R with low Ca2+ Ringer's solution modifies these alterations. Isolated isovolumic rabbit hearts were divided into 2 groups. Group 1 (G1, n=11) was perfused with Ringer's solution ([Ca2+]=2mM) and subjected to 15min of global ischemia and 30min of R. Group 2 (G2, n=10) was R during the first 10 min with ([Ca2+ ]=1mM), which was increased to 1.5 mM and 2 mM in the perfusate at 30 min of R. The left ventricular +dP/dtmáx, left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) (stiffness index), and relaxation rate (t1/2 and +P/-P ratio) were measured, from the beginning of R every 10sec for 2min, and then at 5 and 30min. At 60 sec of R the +dP/dtmáx in G1 was increased (76,88±5,37% vs preischemic value)  and was attenuated in G2 (48,22±3,40%; P<0.05 vs G1). The LVEDP in G1 was increased early in the R, although it was negatively correlated with HC degree (r=-0.7477; p=0.008). This increase was attenuated in G2 (P<0.05 vs G1) at 60 secR. There was a delay in the relaxation at 60 secR in both group (G1 vs G2, NS). In conclusion: HC is accompanied by diastolic alterations. The improvement of HC is inversely related with LVEDP. During R the stiffness during the relaxation rate was normal. The R with low Ca2+ attenuated the HC and the diastolic stiffness.

Key words: Ischemia. Stunned myocardium. Post-ischemic hypercontraction. Low calcium.

En la disfunción ventricular postisquémica ("miocardio atontado") se han descripto dos etapas muy bien delimitadas1,2. Una primer etapa, al comienzo de la reperfusión y de corta duración, en la cual la contractilidad miocárdica tiende a recuperar niveles similares a los pre-isquémicos, y una segunda etapa más tardía, en la cual la disfunción ventricular se estabiliza en los valores que permanecerá durante el tiempo que dure dicha disfunción, para después comenzar a disminuir hasta la recuperación total.
   Si bien varios estudios reprodujeron esta fase de "hiperfunción" precoz1,3, la mayoría de los trabajos han estudiado el significado y los mecanismos fisiopatológicos involucrados en la segunda de las fases mencionadas, esto es el período en el cual esta entidad fisiopatológica se estabiliza4-10. Por otro lado, los pocos trabajos que han estudiado con detenimiento el comportamiento de la función ventricular en los primeros minutos de la reperfusión han hecho especial referencia al componente sistólico3, 11-13. Esta fase precoz fue denominada por los diferentes autores como fase de hipercontracción, de hiperfunción postisquémica o de rebote1. El mecanismo responsable de este fenómeno sistólico permanece en discusión, habiendo sido atribuido a hiperemia reactiva post-oclusión arterial1, o alteraciones en el transporte de calcio11.
   Si bien algunos trabajos previos mostraron que esta fase precoz de hiperfunción en la reperfusión se acompaña de alteraciones diastólicas13-15, la descripción de estas alteraciones fue enfocada más a la disociación diastólica entre relajación y rigidez que existe en la reperfusión precoz comparada con la tardía13,16, y no a la secuencia temporal de estas alteraciones diastólicas que ocurren en la repefusión precoz. De lo anteriormente mencionado, se desprende que un estudio detallado de las alteraciones diastólicas y sistólicas de esta fase de hipercontracción no ha sido abordado con anterioridad. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue determinar las alteraciones diastólicas que ocurren precozmente en la reperfusión, así como también la relación existente entre estas alteraciones diastólicas y el grado de recuperación transitoria de la función sistólica. Un segundo objetivo fue determinar, al menos, parte de los mecanismos involucrados en esta fase precoz de la reperfusión. Para esto se perfundieron los corazones desde el comienzo de la reperfusión con una solución de Ringer conteniendo bajo calcio.

Material y métodos

Modelo experimental

Se utilizaron conejos neozelandeses con un peso de 2 a 2.5 kg., los que  fueron anestesiados con ketamina (75 mg/kg)        y tiopental sódico (35 mg/kg). Seguidamente, se abrió el tó-   rax, se identificó y disecó la aorta, posteriormente se realizó un ojal en la pared de la misma, a través del cual se colocó una cánula que fue fijada con hilo de seda. A través de esta vía se introdujo solución de Ringer (ClNa 118 mM, Cl2Ca 2 mM, ClK 5.9 mM, SO4Mg 1.2 mM, CO3HNa 20 mM y dextrosa 11.1 mM) heparinizada para lavar la sangre de todo el árbol coronario. Seguidamente se extrajo rápidamente el corazón de la cavidad torácica. Estas maniobras se realizaron en un tiempo no mayor de 60 segundos, para evitar el deterioro del preparado. Una vez removido el corazón, se lo colocó por intermedio de la cánula en un sistema de perfusión retrógrada según la técnica de Langendorff. El corazón se perfundió con solución de Ringer mantenida a una temperatura constante de 37°C, y  equilibrada con una concentración de 95% de O2 y 5% de CO2, lo cual permitió mantener un pH de 7.38-7.42 que también fue mantenido constante durante todo el experimento. Una vez colocado el corazón en el sistema de perfusión se extrajo la orejuela izquierda del mismo y se colocó, en la cavidad del ventrículo izquierdo, a través del anillo mitral, un balón de látex unido a un tubo rígido de polietileno. Se suturaron dos electrodos, unidos a un marcapasos, a la aurícula derecha e izquierda que permitió mantener una frecuencia cardíaca constante de 175 ± 10 lat/min.

Análisis de datos

El balón de látex colocado en la cavidad del ventrículo izquierdo fue conectado a través de un tubo de polietileno, a un transductor de presión Deltram II (Utah Medical System) conectado a una computadora con una plaqueta conversora analógica-digital que permitió obtener registros de la presión ventricular izquierda y su derivada (dP/dt) en tiempo real. El balón se llenó con solución acuosa hasta lograr una presión diastólica final (PDFVI) de 8-12 mmHg; este volumen se mantuvo constante durante todo el experimento. La presión desarrollada se obtuvo restando la PDFVI a la presión sistólica pico. Si se considera que la rigidez ventricular diastólica se expresa a través de la relación dP/dV, entonces, en el corazón isovolúmico la PDFVI es un índice directo de rigidez ventricular.
   También se obtuvieron registros de la presión de perfusión coronaria (PPC) a través de otro transductor de presión conectado a la línea de perfusión en un punto inmediatamente anterior a la cánula colocada en la aorta. En un corazón perfundido a flujo coronario constante, la presión de perfusión coronaria indica la resistencia vascular coronaria.
   Para evaluar la relajación se utilizó el t1/217, que es el tiempo que tarda la presión ventricular en caer hasta un 50% de su valor máximo, y el cociente entre la máxima velocidad de ascenso y disminución de la presión ventricular (+P/-P)18. La constante de caída de la presión isovolúmica (tau, t) no fue utilizada porque durante la isquemia y al comienzo de la reperfusión, la caída de la curva de presión pierde la exponencialidad y por lo tanto no se puede calcular la constante de tiempo, tau12.
   Durante el período isquémico, los corazones se mantuvieron a una temperatura constante por inmersión en una cámara termostatizada conteniendo solución acuosa. El flujo coronario, controlado con una bomba de perfusión, se reguló para conseguir una PPC de 80±6 mmHg.

Protocolo experimental

Una vez que los corazones se colocaron en el sistema de perfusión fueron estabilizados durante un período de 10 min. Posteriormente, se realizó un período de 15 min de isquemia mediante el cierre de la bomba de perfusión coronaria, el cual fue seguido de 30 min de reperfusión. Durante el período de reperfusión se obtuvieron registros de las variables mencionadas cada 10 seg hasta los 2 min y luego a los 5 y 30 min de dicho período.
   Se realizaron 2 grupos experimentales, en el grupo 1 (grupo control) los corazones fueron perfundidos con solución de Ringer con una concentración de 2 mM de Ca2+. En el grupo 2 se utilizaron los mismos tiempos de isquemia y reperfusión que en el grupo anterior, pero la reperfusión se realizó durante los primeros 10 min con solución de Ringer conteniendo una concentración de 1mM de Ca2+; dicha concentración fue elevada a 1.5 mM a los 10 min y a 2 mM a los 20 min de reperfusión (Fig. 1). Esta normalización escalonada del calcio se realizó para evaluar si la restitución tardía del calcio lograba una recuperación igual o mayor que la observada en el grupo control.

   Los resultados fueron expresados como la media ± error estándar, y las variables se evaluaron por análisis de varianza seguido por la prueba de Bonferroni para comparaciones múltiples. Se consideró como diferencia estadísticamente significativa a un valor de p < 0.05.

Resultados

La contractilidad miocárdica se incrementó progresivamente desde el inicio de la reperfusión, constituyendo la fase de "hipercontracción" postisquémica. La Figura 2 muestra la respuesta contráctil evaluada con la +dP/dtmáx en ambos grupos experimentales: atontado y perfusión con bajo calcio. La +dP/dtmáx en el grupo de corazones perfundidos con calcio 2 mMol alcanzó un valor máximo de 621 ± 77 mmHg/seg/a los 60 segundos de reperfusión que luego se redujo a 391 ± 25 mmHg/seg a los 5 min de dicho período, a partir de un valor pre-isquémico de 730 ± 39 mmHg/seg. Al final de la reperfusión, como es característico del miocardio atontado, el estado contráctil quedó reducido a un 70.94 ± 4.24% de su valor preisquémico (p<0.05 vs valor pre-isquémico). La reducción del Ca2+ en el líquido de perfusión durante la etapa inicial del período de reperfusión atenuó significativa-mente la fase de hipercontracción, presentando a los 60 segundos de dicho período valores que alcanzaron un 51.31 ± 4.85% del valor preisquémico (p<0.05 vs G1).

   La Figura 3 (panel superior) muestra el comportamiento de la PDFVI (rigidez miocárdica) y de la presión de perfusión coronaria (PPC, panel inferior), antes de la isquemia y durante la reperfusión en ambos grupos. La PDFVI aumentó significativamente a los 60 segundos de la reperfusión, cuando la fase de hipercontracción post-isquémica es máxima (p<0.05 vs valor pre-isquémico), y siguió incrementándose hasta los 30 minutos de la reperfusión. La perfusión con bajo calcio atenuó significativamente el aumento de la PDFVI durante la fase de hiperfunción (p<0.05 vs G1) y al final del período de reperfusión (p<0.05 vs G1). La presión de perfusión mostró un comportamiento similar en ambos grupos estudiados, poniendo de manifiesto que los cambios sistólicos y diastólicos observados durante el período de hiperfunción no estarían relacionados a cambios en la circulación coronaria por lo menos en estas condiciones experimentales.

   La Figura 4 muestra la relación que existe entre 2 índices de contractilidad miocárdica y la PDFVI. Existe una correlación negativa significativa entre la PDVI y la PDFVI (r=-0.7477; p=0.008), y la +dP/dtmáx y la PDFVI (r=-0.68; p=0.02). Esto sugiere que un mayor incremento de la contractilidad en la fase de hiperfunción se acompaña de menor rigidez. También se observa que cuando los corazones se reperfundieron con bajo calcio la relación entre las variables mencionadas desapareció.

   La Figura 5 muestra el comportamiento de la relajación ventricular evaluada a través del t1/2 y el cociente +P/-P considerando los mismos tiempos destacados en los gráficos anteriores. Como se puede observar, en ambos grupos experimentales existe un enlentecimiento de la velocidad de relajación en el momento de la fase de hipercontracción sistólica, no observándose diferencias entre el grupo atontado y el perfundido con bajo calcio. En la reperfusión tardía ambos grupos normalizaron progresivamente el tiempo de relajación hasta alcanzar valores cercanos al control al final del período de reperfusión.

Discusión

En el presente trabajo hemos estudiado el comportamiento de la función ventricular sistólica y diastólica durante los primeros 2 min de reperfusión, después de 15 min de isquemia, en un modelo de corazón aislado e isovolúmico de conejo. El seguimiento en función del tiempo se realizó evaluando los cambios cada 10 segundos, durante los dos primeros minutos, y después cada 5 min hasta los 30 min. Cuando consideramos el componente sistólico observamos una tendencia de la contractilidad a retornar a un valor cercano al pre-isquémico al minuto de la reperfusión. Esta etapa transitoria ha sido descripta por otros autores y la denominaron fase de hipercontracción o de rebote1. Galinanes y col.19 mostraron en ratas, que el grado de "hipercontracción" sistólica varía de acuerdo con el tiempo de duración de la isquemia, siendo máximo con isquemias de entre 10 y 20 min de duración. En nuestro estudio encontramos, con una isquemia de 15 minutos de duración, un grado de "hipercontracción" sistólica muy cercano al mostrado por Galinanes y col.19. Sin embargo, en ese trabajo no se analizó el comportamiento diastólico. Cuando esta subfase del ciclo cardíaco es analizada, al inicio de la reperfusión encontramos hallazgos relacionados con las dos fases de la diástole, esto es en la relajación y en la rigidez ventricular. En primer lugar, observamos un enlentecimiento de la relajación en el mismo momento de la fase de hipercontrac-ción sistólica. Esta alteración lusitrópica se mantiene hasta los 90 segundos, tiempo en el que el estado contráctil ya está disminuyendo y se encuentra cerca de su valor de estabilización que ocurre a los 5 min aproximadamente, alcanzando un valor aproximado del 70% con respecto a su valor pre-isquémico. En segundo lugar, también observamos un aumento de la rigidez miocárdica. Sin embargo, y en forma muy interesante, este aumento de la rigidez está en relación inversa con el grado de hipercontracción alcanzado, es decir, cuando la fase de hipercontracción es mayor, el aumento de la presión diastólica final es menor, observándose incluso que en aquellos casos en los que la hipercontracción es igual o aun mayor que el valor preisquémico, la rigidez miocárdica es normal. Esta relación inversa podría interpretarse como el resultado de un mecanismo común causante de ambos fenómenos: el aumento del calcio citosólico al comienzo de la reperfusión. Esta sobrecarga de calcio podría provocar una contractura activa (aumento de la PDFVI), con la consecuente disminución en el estado contráctil. Meissner y col. 20 mostraron que existe una relación directa entre PDFVI y el calcio diastólico, aunque estos hallazgos fueron descriptos a los 30 minutos de la reperfusión. Nuestros datos sugieren que quizás un mecanismo similar exista al comienzo de la reperfusión ya que la reperfusión con bajo calcio atenuó el aumento de la rigidez ventricular y la fase de "hipercontracción".
   En los miocitos cardíacos bajo condiciones de isquemia y reperfusión existen al menos tres mecanismos que pueden participar en la sobrecarga de calcio: la liberación de calcio por el canal liberador de calcio del retículo sarcoplasmático, los canales de calcio tipo L pertenecientes al sarcolema, y el intercambiador Na+/Ca2+ (NCX)21. Una posibilidad es que este último mecanismo esté involucrado en la fase temprana de la reperfusión, con la restauración del flujo en la reperfusión, la inhibición que la acidosis extracelular produciría sobre el intercambiador Na+/H+ desaparece, por lo que el intercambiador se activa debido a la acidosis intracelular,  que todavía persiste. Esto produce un aumento del Na+ intracelular que se intercambiaría a su vez por Ca2+, a través del intercambiador NCX. Como la acidosis intracelular persiste por un tiempo más, el intercambiador sodio hidrógeno hiperactivo aumentaría más el sodio intracelular, lo que podría llevar a un aumento del calcio intracelular a través del intercambiador NCX. Este intercambiador saca calcio de la célula intercambiándolo con sodio extracelular (modo "forward"), pero también puede promover la entrada de calcio a la célula intercambiándolo con sodio (modo "reverso"), fundamentalmente cuando el Na+ intracelular está aumentado. Si bien pareciera existir consenso en el hecho de que el intercambiador Na+/Ca2+ (NCX) es el responsable del au-mento de calcio en la reperfusión temprana, todavía se debate si se debe a que se inhibe el modo "forward" (elimina calcio de la célula) o a que se activa el modo "reverso" (incorpora calcio a la célula)21.
   Sin embargo, la importancia relativa de estos mecanismos varía con la especie. Así, estudios fisiológicos y farmacológicos han mostrado una mayor contribución al proceso excitación-contracción del calcio que entra por los canales del sarcolema en el conejo que en la rata con respecto a la contribución del retículo sarcoplas-mático22-25. Por otro lado, otros estudios han mostrado que el conejo presenta mayor número de canales de calcio en el sarcolema que la rata, que por su disposición espacial podrían participar directamente en el proceso excitación-contracción26. Estas diferencias en el acoplamiento excito-contráctil y en los movimientos de calcio en la isquemia también se dan con otras especies. Así, en la rata el atontamiento de los miocitos se acompaña de disminución del acortamiento y aumento de la velocidad de relajación con movimientos normales del calcio intracelular, mientras que en el cerdo el atontamiento se acompaña de disminución del acortamiento con enlentecimiento de la relajación y disminución del calcio sistólico pico27. Por otra parte, en la rata la PDFVI aumenta durante la isquemia mientras que en el conejo el aumento se produce durante la reperfusión. También fue mostrado en un trabajo reciente28 que la relajación normal que se observa en la rata en la reperfusión precoz es debida a la fosforilación del residuo de Thr17 de la fosfolamban, lo que a su vez es inducido por calcio que entra a la célula a través del intercambiador sodio-calcio trabajando en forma reversa. El hecho de que en el conejo ocurra un enlentecimiento de la relajación en la reperfusión precoz sugiere que la fosforilación del residuo de treonina en esta especie podría no ocurrir. El hecho de una mayor dependencia de los canales de calcio del sarcolema que los del retículo sarcoplasmático en el proceso excitación-contracción en el conejo podría explicar la disociación entre relajación y rigidez que ocurre a los 30 minutos de la reperfusión ya que, mientras la rigidez aumentaría por mayor entrada de calcio al citosol, la relajación se mantendría en valores similares al control al estar el retículo sarcoplasmático funcionando dentro de los límites normales a este tiempo de reperfusión.
   Otros trabajos10,15 que también consideraron la evolución temporal del miocardio atontado desde el inicio de la reperfusión, lo hicieron utilizando animales intactos y evaluaron el componente diastólico a través de presión ventricular y dimensiones diastólicas. Dado que en estos estudios se utilizó isquemia regional, los cambios en la presión ventricular fueron mínimos y por lo tanto las alteraciones sistólicas y diastólicas se evaluaron a través de las dimensiones cardíacas. Esto obviamente limita la evaluación del componente diastólico por dos razones fundamentales: primero, en un organismo intacto las dimensiones dependen de un número elevado de variables, tales como frecuencia cardíaca, condiciones de carga, estado inotrópico, y por otro lado las curvas de dimensiones no permiten evaluar con precisión los dos componentes, relajación y rigidez.
   En resumen, hemos mostrado evidencia experimental que la disfunción postisquémica incluye en su pato-genia una fase muy precoz de hipercontracción sistólica que se acompaña de alteraciones en la relajación y en la rigidez ventricular. En un intento de dilucidar al menos parcialmente los mecanismos involucrados en la fase de hipercontracción reperfundimos los corazones con una solución de Ringer con bajo calcio, y observamos que esta intervención modificó las alteraciones tanto sistólicas como diastólicas sugiriendo fuertemente la participación de este ión en las mismas. Trabajos futuros deberían incluir otras alternativas, como aumentar el calcio extracelular en vez de bajarlo o administrar un inhibidor del intercambiador Na+/Ca2+ (NCX), para dilucidar con más detalle los mecanismos involucrados en las alteraciones diastólicas que ocurren al inicio de la reperfusión. El análisis preciso de esta fase durante la reperfusión temprana permitirá un conocimiento más detallado de la evolución fisiopatológica del miocardio atontado.

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Recibido: 21 de septiembre de 2002
Aceptado: 6 de junio de 2003

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