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Medicina (Buenos Aires)

versión On-line ISSN 1669-9106

Medicina (B. Aires) v.64 n.1 Buenos Aires ene./feb. 2004

 

La dicotomía de los virus polioma. ¿Infección lítica o inducción de neoplasias?

Norberto A. Sanjuan

Laboratorio de Patología Experimental, Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

Dirección postal: Dr. Norberto Sanjuan. Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, UBA, Paraguay 2155, 1121 Buenos Aires, Argentina. Fax: (54-11) 5950-9500 Ext 2170. e-mail: patoexpe@fmed.uba.ar

Resumen
Los virus Polioma murinos provocan infecciones líticas en cultivos de células de ratón y transforman in vitro células de rata a través de la interacción de su oncogén mT con diversos reguladores celulares. Luego de su inoculación en ratones neonatos inducen neoplasias epiteliales y mesenquimáticas. Se ha propuesto que las cepas de polioma más oncogénicas son aquellas que previamente replican más en el ratón. Sin embargo, a nivel de una sola célula la infección lítica y la transformación deberían ser mutuamente excluyentes. En cada neoplasia han sido descriptos 3 tipos celulares según expresen el DNA viral solo o concomitantemente con la proteína mayor de la cápside VP1, o que no contengan DNA viral ni VP-1. En nuestro laboratorio detectamos la existencia de un cuarto tipo celular en las neoplasias, en el que se expresa la totalidad del genoma viral pero no ocurre el ensamblaje, probablemente por alteraciones en la fosforilación de VP-1. Se discuten los mecanismos de migración intracelular de Polioma, la diseminación en el ratón y los factores que podrían estar involucrados en la inducción de neoplasias o en la infección lítica inducidas por el virus.

Palabras clave: Polioma; Neoplasias; VP-1; Microtúbulos; Receptor; Ensamblaje

Abstract
The paradox of polyomaviruses Lytic infection or tumor induction? Murine polyomaviruses can produce lytic infections in mouse cell cultures or transform in vitro rat fibroblasts through a complex interaction with key cellular regulators. After infection of newborn mice, some strains of polyomavirus induce epithelial and mesenchymal tumors. It has been described that there is a direct relationship between viral dissemination in the mouse and tumor induction. However, at a single cell level lytic infection and transformation would not be able to coexist. The existence of 3 distinct cell populations in polyoma-induced tumors, classified according to the presence or absence of viral DNA and viral capsid protein VP-1 have been described. We have reported a fourth type of cell in the neoplasms, that can express the early and the late viral genes but do not allow virus assembly, probably due to underphosphorylation of VP-1. The mechanisms of polyoma intracellular migration and dissemination in the mouse are discussed, related to the virus’ ability of tumor induction.

Key words: Polyomavirus; Tumors; VP-1; Microtubules; Receptor; Assembly

A mediados del siglo XIX Rudolph Virchow señaló que, cuando el paciente y el cadáver no resuelven los interrogantes que el médico se plantea acerca de la naturaleza de la enfermedad, no queda otra alternativa que recurrir a la experimentación. Con ello, no solamente expresaba con claridad las ideas positivistas predomi-nantes en esa época sino que, además, establecía las bases de la Patología Experimental. La inducción de neoplasias por virus no endógenos, como es el caso del polioma murino, es un modelo experimental altamente reproducible que, potencialmente, permite el estudio detallado de los distintos estadios del desarrollo de ese tipo de enfermedades, que serían muy difíciles de establecer sólo con los datos provenientes de pacientes. Los virus polioma del ratón pertenecen a la familia Papo-vaviridae, de la cual también forman parte los polioma humanos y los virus papiloma, entre ellos el Virus Papiloma Humano (HPV). Miden 40 nm, carecen de envoltura, presentan una cápside icosaédrica y contienen un genoma con ADN circular y bicatenario que codifica 6 genes: 3 tempranos (mT, LT y sT) regulatorios y 3 tardíos (VP-1, VP-2 y VP3) con funciones estructurales1. A partir de la década de 1970 los estudios in vitro realizados con el virus polioma murino permitieron esclarecer varios mecanismos involucrados en la transformación celular. Se describió que la infección de cultivos de células del ratón (el huésped natural del polioma) resulta en la expresión completa del genoma viral, en la inducción de efecto citopático (ECP) y en la producción de virus infectivos. En cambio, luego de infectar cultivos de fibroblastos de rata el virus es capaz de expresar sólo sus genes tempranos pero no los estructurales tardíos. De ese modo, las células infectadas se"transforman", es decir, se inmortalizan, pierden la dependencia de anclaje, superan la inhibición del crecimiento por contacto intercelular, y dependen menos que las células normales de los factores de crecimiento presentes en el suero. Estos modelos in vitro permitieron esclarecer que el oncogén viral es mT2 y que el producto de su expresión es una proteína que interactúa con reguladores celulares críticos como son la pp60c-src 3, 4, la fosfatasa 2 A5, la fosfatidil inositol-3 kinasa6, 7, las proteínas 14-3-38,  y otros que aparecen tardíamente en el desarrollo de tumores, como la enzima telomerasa9. A partir de la década de 1980, los modelos desarrollados por Benjamin y Dawe demostraron que luego de su inoculación en algunas cepas de ratones neonatos, el virus polioma podía inducir neoplasias en varios tejidos. Lo interesante de esto era que algunas cepas de polioma podían inducir neoplasias originadas en tejidos epiteliales o conectivos y en pocos meses post-inoculación, mientras que otras no lo hacían en absoluto, o sólo se asociaban al desarrollo de tumores mesenquimáticos luego de un largo período de tiempo10. No obstante, tanto las cepas altamente oncogénicas como las que no lo eran, podían por igual transformar in vitro células de rata11. Las diferencias entre estas cepas radican en unos pocos aminoácidos localizados en VP-1, LT y mT y en otros sectores del genoma que no codifican proteínas12. Más tarde se intentó establecer una relación entre la capacidad replicativa de las diferentes cepas de polioma y su capacidad oncogénica en ratones. Como resultado de esos estudios se observó que las cepas más oncogénicas eran aquellas que, luego de ser inoculadas en ratones, replicaban en los diferentes órganos en los que más tarde se originarían neoplasias13. Más aún, dado que en los tumores inducidos por polioma se detectaba la presencia de VP-1 por inmunomarcación y también se recuperaban virus infectivos, algunos autores propusieron que el virus podía replicar en células tumorales inducidas por él mismo.
     Sin embargo, la interpretación independiente de estos resultados y el estudio histológico detallado de las neoplasias inducidas por polioma nos llevaron a observar dos hechos y a plantear una contradicción. Es cierto que se detecta VP-1 en los tumores inducidos por polioma, pero no se observan imágenes apoptóticas ni de necrosis en las células infectadas. También es cierto que se recuperan virus de los extractos preparados a partir de las neoplasias, pero los títulos virales obtenidos son muy bajos. La contradicción, al menos en el plano teórico, radica en que, a nivel de una sola célula la replicación viral y la transformación celular son fenómenos mutuamente excluyentes. Si un virus puede completar su ciclo lítico destruirá a la célula que lo alberga y en consecuencia no podrá transformarla. Por el contrario, la transformación celular no es compatible con una infección viral productiva. Podría argumentarse que algunos retrovirus pueden replicar en una célula y luego transformarla, pero ello está limitado a algunas cepas del virus del sarcoma de Rous, que codifica un oncogén viral originado en la mutación del proto-oncogén celular c-sarc. El virus polioma, en cambio, codifica un oncogén"real", es decir una secuencia no relacionada con ningún proto-oncogén celular.
     La relación entre la replicación viral y la inducción de neoplasias mediadas por el mismo virus probablemente no sea un problema menor. Para citar sólo un ejemplo, la segunda causa de muerte por cáncer en mujeres del tercer mundo (incluyendo a nuestro país) es el carcinoma del cuello uterino, en cuya etiopatogenia interviene otro papovavirus, el HPV, que tanto puede replicar en las células del epitelio de transición entre el exocervix y el endocervix como luego transformarlas.
     Se acepta que en los tumores inducidos por polioma en el ratón, el genoma viral no está integrado al genoma celular, permaneciendo en cambio en el núcleo de la célula probablemente en forma episomal14. Benjamin y Dawe realizaron un exhaustivo trabajo en el que estudiaron cortes histológicos seriados de distintos tumores murinos inducidos por polioma. En algunos de esos cortes se detectaba la presencia del genoma viral por hibridación in situ de ADN y en los adyacentes se intentaba detectar la presencia de virus infectivos a través de la inmunomarcación de la proteína de la cápside VP-1. De esta forma plantearon la existencia de 3 tipos diferentes de células en una misma neoplasia: aquellas que contienen el genoma del polioma y además expresan antígenos estructurales del virus; las que sólo albergan al genoma viral pero no evidencian la presencia de proteínas estructurales y un tercer tipo en el que no se detecta el ADN viral ni sus proteínas tardías14. Los autores asumieron además que, dado que podía recuperarse virus a títulos bajos de esos tumores, había replicación intratumoral del polioma.
     En nuestro laboratorio nos concentramos en el estudio del primer tipo celular descripto, a través de la inducción de timomas en ratones AKR inoculados con polioma. Observamos que en extensos sectores de un mismo timoma había inmunomarcación positiva para VP-1. No obstante, cuando estudiamos esas neoplasias por microscopía electrónica de transmisión, no encontramos partículas virales. Recurrimos entonces a la inmuno-marcación ultraestructural contra VP-1 utilizando un suero secundario conjugado con oro coloidal. Así pudimos observar que existían numerosas células tumorales que tenían marcación positiva para VP-1, pero en esas mismas células no se detectaban partículas virales15. Era evidente entonces la existencia de un cuarto tipo celular en esas neoplasias inducidas por polioma: un tipo de célula en la que el virus puede expresar sus antígenos tempranos incluyendo al producto del oncogén viral, y también sus antígenos estructurales tardíos pero en las que no puede ensamblarse para producir viriones infectivos. ¿Qué causas pueden impedir la encapsidación viral? Es sabido que para que VP-1 ensamble la cápside del polioma, dicha proteína debe ser fosforilada en serina y en treonina en un proceso en el que interviene mT16, 17. Entonces realizamos extractos de tumores inducidos por polioma, extractos de cultivos celulares donde teníamos la certeza de que polioma había replicado y extractos de cultivos organotípicos productivamente infectados por polioma. Algunos de esos extractos fueron obtenidos con un buffer que contenía inhibidores de fosfatasas y otros extractos procedentes de los mismos tejidos fueron realizados sin el agregado de inhibidores de fosfatasas. La resolución de las proteínas VP-1 contenidas en todos los extractos se realizó por electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 17% y posterior Western blot. Observamos que la VP-1 contenida en células infectadas productivamente por polioma y extraída en presencia de inhibidores de fosfatasas migraba electroforéticamente un poco más alto que las VP-1 presentes en los tumores y extraídas con el mismo buffer. En cambio, en ausencia de inhibidores de fosfatasas, todas las VP-1, tanto las presentes en células infectadas como las que se encontraban en tumores tenían la misma movilidad electroforética15 . Si bien estos resultados no son concluyentes, sugieren la posibilidad de que en las neoplasias inducidas por polioma la proteína mayor de la cápside viral VP-1 está hipofosforilada, impidiendo de esa forma la encapsidación del virus y la finalización de su ciclo lítico. Pero, ¿qué factor celular puede ser responsable de esto? ¿Cuál componente de la célula es capaz de producir el switch que determine que polioma pueda encapsidar y entonces lisar a una célula o que, por el contrario, no pueda hacerlo y en consecuencia la célula sea transformada? La respuesta a esa pregunta es crítica dado que, potencialmente, la identificación de ese factor o conjunto de factores permitiría saber si el mecanismo es inducible o de alguna manera regulable. Si esto fuera así, el mismo virus que provoca una neoplasia podría ser inducido a completar su ciclo de replicación y, en consecuencia, lisar a la célula tumoral que lo alberga. En este momento el estudio pormenorizado de ese punto ocupa una línea central de trabajo en nuestro laboratorio.
     ¿Cómo interpretar el aislamiento de virus infectivos a partir de los tumores? Sin descartar por completo que eventualmente algunas células tumorales pueden producir virus infectantes, en el transcurso de nuestros experimentos observamos que dentro de las neoplasias originadas por polioma existían macrófagos repletos de partículas virales en sus núcleos. También pudimos reproducir la infectabilidad de los macrófagos por polioma in vitro18. Es posible, entonces, que los bajos títulos virales obtenidos a partir de extractos de neoplasias no provengan de células tumorales sino de macrófagos intra-tumorales en los que el virus puede replicar. Otros estudios recientes en nuestro laboratorio indican, además, que el virus polioma no se comporta de igual manera en todas las neoplasias que él induce en un mismo animal. A modo de ejemplo, los adenocarcinomas de mama tienen las mismas características que los timomas, es decir, en ellos no se detectan virus infectivos en títulos significativos; en cambio, las neoplasias originadas en anexos cutaneos presentan numerosas células donde el polioma se encuentra en forma intranuclear, y la titulación de virus infectivo in vitro a partir de estos tumores es por lo menos 1 logaritmo mayor que lo observado en los timomas o en los adenocarcinomas de mama19. Dado que las diferencias entre los distintos tejidos de un animal radican, entre otras, en la expresión diferencial de factores de transcripción, no sería extraño que en diferentes tejidos de un mismo ratón el mismo virus interactúe con distintos factores de transcripción celulares, llevando a la producción de partículas infectivas intratumorales en algunos casos y a la ausencia de encapsidación en otros.
     En base a lo expuesto, ¿cómo podría explicarse hipotéticamente lo que ocurre en el ratón luego de la infección por una cepa de polioma altamente oncogénica? Lo primero que el virus debería hacer es amplificarse, produciendo una infección lítica en algunas células permisivas. Para ello debería reconocer al receptor celular, llegar al núcleo, replicar, abandonar la célula e infectar a otras cercanas. Se sabe que el receptor para polioma, a diferencia del de otros miembros de la misma familia, no es un componente del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de Clase I20 sino, probablemente, algunos gangliósidos de la membrana plasmática21. También hemos descripto que la migración intracelular del virus durante la infección productiva ocurre, tanto desde la periferia hacia el núcleo como desde el núcleo hacia el exterior, a través de microtúbulos de intercambio dinámico22. Es posible que luego de esto el virus infecte a células adyacentes y se disemine infectando a otras células permisivas, completando por lo menos 1 ciclo de infección lítica. A partir de este punto todo pasa al terreno de lo hipotético. Es posible que polioma infecte diferentes tipos celulares, o células de la misma estirpe pero que se encuentran en distintos momentos de su diferen-ciación. Si la infección ocurriera en células permisivas, estas irían a la lisis y serían eliminadas. Si, en cambio, las infectadas fueran células semipermisivas, sería posible que el virus no pudiera concluir su ciclo replicativo pero sí pudiera expresar en forma permanente su oncogén. En este último caso se induciría una neoplasia con las características enumeradas más arriba. Es posible que el modelo polioma-ratón pueda aclarar algunos puntos oscuros de la infección en el humano por HPV, aún a riesgo de extrapolar datos experimentales a realidades clínicas. Pero cualquiera sea la utilidad de este modelo, evidencia el concepto más básico de la biología: todas las especies tienden a su perpetuación. El virus polioma, como los otros virus oncogénicos no tiene el"deseo" teleológico de producir un cáncer. Antes bien, intenta replicar y formar viriones infectantes. Sólo cuando la célula le impide cerrar el ciclo de replicación productiva utiliza una estrategia alternativa: expresa sólo el oncogén viral e inmortaliza a la célula, manteniendo de esa manera su genoma intacto en los tumores que origina. En esas circunstancias no puede replicar, pero garantiza la perpetuación de su información genética a través de la inducción de una neoplasia.

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Recibido: 25-09-2003
Aceptado: 8-10-2003