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Medicina (Buenos Aires)

versión On-line ISSN 1669-9106

Medicina (B. Aires) v.64 n.2 Ciudad Autónoma de Buenos Aires mar./abr. 2004

 

Bloqueo del receptor del factor de crecimiento semejante a la Insulina Tipo I utilizando oligodeoxinucleótidos antisentido en cáncer de mama experimental *

Mariana Salatino, Roxana Schillaci, Cecilia J. Proietti, Romina Carnevale, Eduardo H. Charreau, Patricia V. Elizalde

Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME-CONICET), Buenos Aires, Argentina.

* Este trabajo mereció el Premio Esteban Montuori para oncología durante la reunión anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC) en Mar del Plata, noviembre 2003.

Autor responsable: Dra. Patricia V. Elizalde, Instituto de Biología y Medicina Experimental, Vuelta de Obligado 2490, 1428 Buenos Aires, Argentina Fax (54-11) 4786-2564 e-mail: elizalde@dna.uba.ar

Resumen
Evaluamos el efecto del bloqueo de la expresión del receptor del factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I (IGF-IR) sobre el crecimiento in vivo de cáncer de mama empleando una estrategia "antisentido". Utilizamos el adenocarcinoma mamario murino progestágeno-dependiente C4HD. La administración intratumoral o sistémica de oligodeoxinucleótidos antisentido fosfotiolados al ARNm del IGF-IR (AS[S]ODN)  inhibió el crecimiento  tumoral. El efecto antitumoral fue específico debido a su dosis-dependencia y a la falta de efecto en ratones tratados con el S[S]ODN "sentido". Los tumores obtenidos de ratones tratados con AS[S]ODN mostraron: disminución en la expresión de IGF-IR y en la fosforilación del sustrato del receptor de insulina-1, inhibición de la activación de PI-3K/Akt, p42/p44MAPK y ErbB-2, mientras que la expresión y activación del receptor de progesterona no se afectó. Es la primera demostración que el crecimiento de cáncer de mama puede ser inhibido por la administración in vivo de AS[S]ODN  al IGF-IR.

Palabras clave: Estrategias antisentido; IGF-IR;  Cáncer de mama

Abstract
Type I insulin-like growth factor  receptor antisense strategies  in experimental breast cancer. We addressed the effect of targeting type I insulin-like growth factor receptor (IGF-IR), with antisense strategies in in vivo growth of breast cancer cells. We used C4HD tumors from an experimental model of hormonal carcinogenesis in which medroxyprogesterone acetate induced mammary adenocarcinomas in Balb/c mice. Intratumor or systemic administration of phosphorothiolated antisense oligodeoxynucleotides (AS[S]ODN) to IGF-IR mRNA resulted in a significant inhibition of C4HD tumor growth. The antitumor effect was specific since inhibition of tumor growth was dose-dependent and no effect was observed in mice treated with sense S[S]ODN. Tumors from AS[S]ODN-treated mice showed a decrease in IGF-IR expression and in insulin receptor substrate-1 tyrosine phosphorylation. Activation of PI-3K/Akt, p42/p44 MAPK and ErbB-2 was abolished in tumors treated with AS[S]ODN. Progesterone receptor expression or activity remained invariable. This is the first demonstration that breast cancer growth can be inhibited by direct in vivo administration of IGF-IR AS[S]ODN.

Key  words: Antisense strategies; IGF-IR; Breast cancer

El receptor del factor de crecimiento semejante a insulina (IGF-IR) juega un rol central en la regulación del crecimiento celular. Al activarse por unión al IGF-I, tiene función mitogénica en varios tipos celulares y protege  a las células de una variedad de señales apoptóticas. También induce diferenciación en ciertos tipos de células y tiene un rol crucial en el establecimiento y mantenimiento del fenotipo transformado1. Un gran número de evidencias indican que el IGF-IR es fundamental en el desarrollo del cáncer de mama y que está involucrado en un complejo cross-talk con las hormonas esteroideas, las cuales regulan el crecimiento del tumor mamario2.
En nuestro laboratorio hemos demostrado que el IGF-IR juega un rol central en la proliferación del tumor C4HD perteneciente al modelo experimental de carcinogénesis hormonal en el cual el progestágeno sintético acetato de medroxiprogesterona (MPA) induce adenocarcinomas de mama en ratones hembras BALB/c3, 4. El tumor C4HD es de origen ductal, requiere administración de MPA para proliferar tanto in vivo como in vitro y expresa altos niveles de receptores de estrógenos y progesterona (RP)5, niveles normales de IGF-IR y sintetiza IGF-I4. Demostramos que el bloqueo de la expresión de IGF-IR utilizando oligodeoxinucleótidos antisentido (ASODN) al ARNm del IGF-IR inhibió la proliferación inducida por MPA de cultivos primarios del tumor C4HD3, 6, indicando que el loop autocrino IGF-I/IGF-IR participa en la proliferación inducida por MPA. Por otro lado, nuestros estudios de expresión y función de los receptores tirosina quinasa tipo I: RTKs (EGF-R/ErbB-1, ErbB-2, ErbB-3 y ErbB-4) y su ligando, heregulina (HRG), demostraron la existencia de un cross-talk bi-direccional entre las vías de señalización de progestágenos y HRG/ErbBs que controlan la proliferación de células C4HD3, 6. Demostramos también la existencia de una  interacción entre las vías de IGF-IR y HRG/ErbBs, particularmente una interacción jerárquica entre IGF-IR y ErbB-2 mediante la cual el IGF-IR dirige la fosforilación del ErbB-23. En este contexto, nuestros hallazgos identifican consistentemente al IGF-IR como una pieza central en la proliferación de células C4HD dirigida por tres vías diferentes: el RP, HRG/ErbBs y el propio loop autócrino IGF-I/IGF-IR. Según estos antecedentes el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del bloqueo de la expresión del IGF-IR sobre el crecimiento in vivo del tumor mamario murino C4HD utilizando ASODN fosfotiolados al ARNm del IGF-IR (AS[S]ODN). Para ello, se inocularon subcutáneamente ratones hembras BALB/c con un fragmento de tumor C4HD, y con un pellet de MPA en el flanco opuesto. Cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de 15 mm3 se inició el tratamiento con los [S]ODNs empleando dos estrategias distintas. Primero, evaluamos el efecto de la inyección directa intratumoral de 100 µg/día/ratón del AS[S]ODN o del [S]ODN sentido (S[S]ODN)  durante 14 días. Como control adicional un grupo de ratones fue inyectado con 100 µl del vehículo (PBS). Al día 15 el tratamiento intratumoral  con el AS[S]ODN inhibió un 62.3% y un 66.3% el crecimiento tumoral con respecto a los controles (S[S]ODN y PBS respectivamente, (Figura 1A). Segundo, evaluamos el efecto de la administración sistémica del AS[S]ODN, ya que  esta vía de administración está siendo actualmente utilizada en ensayos clínicos7. Los ratones fueron inyectados en el seno venoso retrorbital con 1 mg/día/ratón del AS[S]ODN, del S[S]ODN o 100 µl  del vehículo (PBS) durante 14 días. Al día 15 el tratamiento sistémico con el AS[S]ODN inhibió un 62.0% y un 66.0% el crecimiento tumoral con respecto a los controles (S[S]ODN y PBS respectivamente, (Figura 1B). El tratamiento endovenoso con dosis más bajas del AS[S]ODN (0.25-0.5 mg/día/ratón) resultó en una inhibición, si bien significativa, menor a la obtenida con la dosis de 1 mg diario con lo cual se comprobó la dosis-dependencia del efecto inhibitorio (datos no mostrados). Las diferencias en el crecimiento tumoral entre los ratones tratados con AS[S]ODN y los grupos controles fueron aún significativas a lo largo de la semana postratamiento en todos los protocolos realizados (Figura 1A y B, día 15-21). La inhibición incompleta, aunque muy significativa, del crecimiento tumoral obtenida en los tratamientos in vivo, intratumoral o sistémico, con el AS[S]ODN al IGF-IR nos permitió contar con muestras de tumor. Por lo tanto, nuestro modelo proporcionó una herramienta única para estudiar las vías de señalización afectadas por el bloqueo de la expresión de IGF-IR. Para establecer que  el efecto antitumoral in vivo se debió a un efecto antisentido específico, se evaluó la expresión del IGF-IR en extractos proteicos de tumores extraídos de ratones tratados con el AS[S]ODN y de ratones controles (S[S]ODN o PBS) en el día 15. Los resultados presentados a continuación corresponden al tratamiento sistémico con 1 mg/día/ratón de [S]ODN y fueron similares a los obtenidos con el tratamiento sistémico a menor dosis o con el intratumoral. Los análisis de Western blotting (WB) demostraron una significativa disminución (65-90%) en la expresión de las cadenas
a y b del IGF-IR en tumores de ratones tratados con el AS[S]ODN con respecto a los controles (Figura 2A). Un paso crucial en la vía activada por IGF-IR es la fosforilación del substrato del receptor de insulina (IRS-1) y la activación de la vía de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI-3K)/Akt8, 9. Por lo tanto se inmunoprecipitó el IRS-1 y se evaluó su estado de fosforilación. Los tumores de ratones tratados con el AS[S]ODN mostraron una disminución significativa en el grado de  fosforilación en tirosina de IRS-1 con respecto a los tumores de los grupos controles (Figura 2B). Para evaluar el estado de activación de PI-3K/Akt realizamos ensayos de WB utilizando anticuerpos anti-fosfo-Akt treonina 308 y anti-fosfo-Akt serina 473 como marcadores de activación. Se detectó una significativa disminución en la fosforilación de ambos residuos en tumores de ratones tratados con AS[S]ODN con respecto a los tumores de los grupos controles (Figura 2C). Para verificar si se mantiene in vivo la interacción jerárquica entre el IGF-IR y el ErbB-2 descripta in vitro por nuestro laboratorio3, estudiamos en los tumores obtenidos el estado de activación ErbB-2 y de ErbB-3, receptor con el cual heterodimeriza preferencialmente el ErbB-2 en nuestro modelo10. Para ello se  inmunoprecipitó al ErbB-2 y al ErbB-3 y se evaluó su grado de fosforilación como marcador de activación. Como habíamos informado anteriormente en tumores C4HD que crecieron en ratones tratados con MPA3, 6, detectamos una fuerte fosforilación tanto de ErbB-2 como de ErbB-3 en los grupos controles, mientras que en tumores de ratones tratados con el AS[S]ODN el grado de fosforilación de dichos receptores disminuyó significativamente (Figura 2D). Los niveles de expresión de ErbB-2 y ErbB-3 no se vieron afectados por el tratamiento in vivo con el AS[S]ODN (Figura 2D, panel inferior). Más aun, el tratamiento de los tumores con el AS[S]ODN disminuyó la formación del heterodímero funcional ErbB-2/ErbB-3 medida por ensayos de coinmuno-precipitación (Figura 2E). Luego ensayamos el efecto del AS[S]ODN al IGF-IR sobre el estado de activación de la vía de las MAPK/Erks por varias razones. Primero, porque es sabido que el IGF-IR activa dicha vía9. Segundo, porque en nuestro modelo el estímulo proliferativo es el MPA actuando a través del RP y porque múltiples evidencias, incluyendo las propias10, sugieren que las MAPK inducen fosforilación del RP modulando su función11. Finalmente porque  en  cáncer de mama suelen detectarse niveles elevados de actividad de MAPK los cuales han sido asociados con la pérdida de respuesta hormonal y el desarrollo de metástasis12. Como se puede observar todos los tumores expresaron niveles similares de p42/p44 MAPKs (Figura 2F, panel inferior), mientras que el nivel de activación de las mismas, medido con anticuerpos específicos para la forma fosforilada, disminuyó significativamente en los tumores tratados con el AS[S]ODN respecto a los controles (Figura 2F). Recientes hallazgos han demostrado la presencia de una interacción bidireccional entre las vías de  factores de crecimiento y hormonas esteroideas3, 6, 10. Sin embargo, pocas evidencias han sido publicadas  con respecto a la interacción del RP y el IGF-IR13. Por lo tanto, investigamos si el bloqueo de expresión del IGF-IR podía afectar la expresión y/o la activación del RP. Se  detectaron niveles similares de expresión de RP en tumores de ratones tratados con el AS[S]ODN con respecto a los grupos controles (Figura 2G, panel superior). En cuanto a su activación, recientes evidencias indican que la fosforilación del RP en el residuo serina 294 (Ser294) se correlaciona con su actividad transcripcional11. Por lo tanto, el siguiente paso fue evaluar el estado de fosforilación del RP en Ser294 para determinar si el bloqueo de la expresión del IGF-IR estaba afectando la activación del RP. La fosforilación del RP determinada con un anticuerpo específico para la forma fosforilada del Ser294 no fue afectada por el tratamiento de los tumores con el AS[S]ODN, siendo ésta igual de intensa que en los controles (Figura 2G, panel inferior). Estos resultados indican que el bloqueo de la expresión del IGF-IR no interfiere con la vía del RP en los tumores C4HD. Esto resulta particularmente interesante ya que indica que el tumor tratado con AS[S]ODN exhibe altos niveles de fosforilación de RP en Ser294 a pesar de que  las MAPK están menos activas que en los controles. Dado que el bloqueo de la expresión del IGF-IR procede en  presencia de MPA, estos resultados sugieren que la fosforilación del RP en Ser294 inducida por MPA ocurriría, en este caso, por una vía independiente de las MAPKs.

En el presente trabajo demostramos por primera vez que el crecimiento in vivo de un tumor mamario murino puede ser inhibido bloqueando la expresión de IGF-IR utilizando un AS[S]ODN administrado en forma intra-tumoral o sistémica. Un hallazgo particularmente interesante consistió en demostrar in vivo lo demostrado previamente in vitro: la existencia de una interacción jerárquica entre IGF-IR y el ErbB-2 mediante la cual el IGF-IR dirige la activación  del ErbB-23. Estos resultados, en los que se demuestra que el bloqueo in vivo del IGF-IR en el cáncer de mama resulta en la inactivación del ErbB-2, tienen implicancias terapéuticas, ya que utilizando al IGF-IR como blanco en el cáncer de mama se podría también inhibir la actividad de ErbB-2, aun en células que sobreexpresan ErbB-2 como las C4HD. Más aún, pudimos disecar una red de interacciones entre las vías de señalización de IGF-IR, los RTKs tipo I y el RP que fueron afectadas diferencialmente por el bloqueo de la función del IGF-IR. Por lo tanto, nuestro modelo nos proporcionó una herramienta única para explorar las bases moleculares de la contribución del IGF-IR al desarrollo del cáncer de mama.
El hecho de haber logrado una significativa aunque incompleta inhibición del crecimiento tumoral bloqueando la expresión del IGF-IR suma apoyo a las numerosas evidencias indicando que se debe apuntar a más de un blanco terapéutico para lograr el bloqueo completo de las múltiples vías de señalización utilizadas por el cáncer de mama para proliferar.  Nuestro hallazgo de que la función del RP no fue afectada por el bloqueo del IGF-IR, remarca la importancia de que un mejor entendimiento de la red de vías involucradas en el desarrollo del cáncer de mama  sea necesariamente desarrollado para  el diseño de nuevas estrategias terapéuticas.

Agradecimientos: Este trabajo ha sido realizado con el subsidio otorgado por Lilly Centre for Women’s Health, Eli Lilly and Company y por el  Centro Argentino Brasilero de Biotecnología (CABBIO), ambos otorgados a  P.V. Elizalde,  y con  el subsidio BID 802/OC-AR PICT 0503402 de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Técnica Argentina. Quisiéramos agradecer también a N. Lope por su asistencia en el trabajo con animales y a  C. Lanari por proveer el modelo experimental de carcinogénesis hormonal inducida por MPA. También quisiéramos agradecer a Laboratorios Gador por proveer el acetato de medroxiprogesterona.

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