La proteína asociada a SLAM (SAP) regula la expresión de IFN-g en lepra*

María F. Quiroga, Gustavo J. Martínez, Virginia Pasquinelli,  Verónica E. García

Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología y Laboratorio de Inmunogenética, Hospital de Clínicas José de San Martín, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

Dirección postal: Dra. Verónica García, Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, Paraguay 2155, 1121, Buenos Aires, Argentina. Fax: (54-11) 5950-8758. E e-mail: vgarcia@fmed.uba.ar

*Este trabajo mereció el Premio Leonardo Satz durante la Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología, Mar del Plata, noviembre 2003.

Resumen
La inmunidad protectora contra Mycobacterium leprae requiere IFN-g. Los pacientes con lepra tuberculoide producen localmente citoquinas Th1, mientras que los pacientes lepromatosos producen citoquinas Th2. La molécula linfocitaria activadora de señales (SLAM) y la proteína asociada a SLAM (SAP) participan en la diferenciación celular que conduce a producción de patrones específicos de citoquinas. A fin de investigar la vía SLAM/SAP en la infección por M. leprae, determinamos expresión de ARN mensajero (ARNm) de SAP, IFN-g y SLAM en pacientes con lepra. Observamos que la expresión de SLAM correlacionó en forma directa con la expresión de IFN-g, mientras que la expresión de SAP correlacionó inversamente con la expresión de ambas proteínas. Así, nuestros resultados indican que SAP interferiría con las respuestas de citoquinas Th1 mientras que SLAM contribuiría con la respuesta Th1 en lepra, señalando a la vía SLAM/SAP como potencial blanco modulador de citoquinas en enfermedades con respuestas Th2 disfuncionales.

Palabras clave: Th1; SLAM; SAP; IFN-g; Coestimulación; Infección intracelular.

Abstract

The SLAM-associated protein (SAP) regulates IFN-g expression in leprosy. Tuberculoid leprosy patients locally produce Th1 cytokines, while lepromatous patients produce Th2 cytokines. Signaling lymphocytic activation molecule (SLAM) and the SLAM-associated protein (SAP) participate in the differentiation process that leads to the production of specific patterns of cytokines by activated T cells. To investigate the SLAM/SAP pathway in M. leprae infection, we determined the expression of SAP, IFN-g and SLAM RNA messenger in leprosy patients. We found a direct correlation of SLAM expression with IFN-g expression, whereas the expression of SAP was inversely correlated with the expression of both SLAM and IFN-g. Therefore, our data indicate that SAP might interfere with Th1 cytokine responses while SLAM expression may contribute to Th1 responses in leprosy. This study further suggests that the SLAM/SAP pathway might be a focal point for therapeutic modulation of T cell cytokine responses in diseases characterized by dysfunctional Th2 responses.

Key words: Th1; SAP; SLAM, IFN-g; Co-stimulation; intracellular infection.

     La inmunidad contra patógenos intracelulares como las micobacterias requiere IFN-g, una citoquina activadora de macrófagos producida por células T¹. La lepra es una enfermedad dinámica donde diferentes subpoblaciones de células T reactivas a Mycobacterium leprae controlan el espectro clínico/inmunológico. Los pacientes con lepra tuberculoide restringen el crecimiento del patógeno, montan fuertes respuestas celulares T contra M. leprae, y producen localmente citoquinas Th1². En contraste, los pacientes con lepra lepromatosa presentan infección diseminada, sus células T responden débilmente a M. leprae, y sus lesiones expresan citoquinas Th2, típicas de respuestas humorales y supresión de la respuesta inmune celular². Varios factores influencian el nivel y patrón de citoquinas producidos por células T activadas³. Uno de dichos factores es la molécula linfocitaria activadora de señales (SLAM), glicoproteína de membrana expresada en linfocitos y timocitos inmaduros, que aumenta la producción de IFN-g y la proliferación celular⁴. Otro de los factores que modulan los patrones de citoquinas producidos por las células T activadas es la proteína asociada a SLAM (SAP), una molécula expresada en células T y NK (natural killers) que contiene un único dominio SH2 e interacciona con la cola citoplas-mática de SLAM⁵. Dicha proteína participa en el proceso de diferenciación que conduce a las células T hacia un patrón específico de citoquinas, operando como inhibidor natural de las vías de transducción de señales desde SLAM hacia el interior de la célula⁶. Ha sido descripto que el dominio SH2 de SAP se une al dominio SH3 de la quinasa FynT y directamente acopla FynT a SLAM⁷. Estudios en ratones deficientes en SAP revelaron secreción incrementada de IFN-g  ⁶, sugiriendo que la falta de expresión de SAP da como resultado un viraje hacia el fenotipo Th1. Más aún, en humanos deficientes en SAP (síndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X-(XLP)), las concentraciones de IFN-g se encuentran elevadas durante la infección primaria por EBV, sugiriendo que un viraje hacia la producción de citoquinas Th1 podría contribuir a la progresiva inmunopatología de los individuos afectados⁸. De esta manera, las anormalidades en la secreción de citoquinas que ocurren tanto en humanos como en ratones deficientes en SAP, podrían resultar de defectos en la propagación de señales inducidas a través de SLAM⁹.
     Estudios previos de nuestro laboratorio demostraron que la expresión de SLAM en lepra correlaciona con respuestas Th1, que la señalización a través de SLAM incrementa la producción de IFN-g y que la expresión de SLAM aumenta por efecto de IFN-g¹⁰. Más recientemente, observamos que la expresión de SAP inhibe la producción de IFN-g en la tuberculosis humana¹¹. Considerando que tanto SLAM como IFN-g promueven respuestas de inmunidad celular en la infección por micobacterias^{10, 12}, y dado que SAP parecería actuar como un cofactor esencial para la transducción de señales mediadas por SLAM, en este trabajo se iniciaron estudios para investigar la vía de señalización SLAM/SAP en pacientes con lepra y en dadores sanos.
     Los pacientes con lepra fueron evaluados en el Hospital de Infecciosas F.J. Muñiz, Buenos Aires y clasificados de acuerdo al criterio establecido por Ridley y Jopling¹³. Se obtuvo sangre periférica heparinizada de pacientes con lepra tuberculoide (T-Lep) y lepromatosa (L-Lep), luego de consentimiento informado de los mismos. Los controles participantes en este estudio fueron individuos sanos sin enfermedades asociadas. A fin de investigar la expresión de ARN mensajero (ARNm) de SLAM, SAP e IFN-g, se obtuvieron células mononu-cleares de sangre periférica (CMSP) de pacientes con lepra y de individuos sanos luego de estimulación con sonicado de M. leprae. Posteriormente, se purificó el ARN total y se realizó RT-PCR, mediante utilización de cebadores específicos para SLAM, IFN-g y SAP. Nuestros resultados mostraron que, en pacientes con lepra lepromatosa, la estimulación celular con antígeno específico no indujo expresión del ARNm de IFN-g o SLAM, mientras que se observó un notable incremento en la expresión del ARNm de SAP luego de dicha estimulación (Figura 1A y 1B). Por el contrario, en pacientes con lepra tuberculoide, la estimulación con M. leprae indujo expresión de ARNm de IFN-g y de SLAM. Resultó interesante que, en estos pacientes respondedores, la estimulación antigénica produjo una marcada disminución de los niveles de ARNm de SAP en comparación con células no estimuladas, las cuales mostraron altos niveles de SAP (Figura 1A). Mas aún, y concordando con nuestros resultados en pacientes con lepra tuberculoide, en dadores sanos la presencia del ARNm de SLAM correlacionó con la expresión del ARNm de IFN-g, mientras que, la presencia de ambas proteínas correlacionó inversamente con la expresión de SAP (Figura 1A y 1B). Resulta interesante que nuestros resultados coincidan con un modelo recientemente propuesto en ratón, el cual postula que SAP es requerido para inhibir la producción de IFN-g ⁹. En dichos estudios, en la línea celular murina T BI-14, la interacción SLAM/SAP desencadena una señal que inhibe de manera selectiva la producción de IFN-g durante la activación T⁹. De esta manera, los resultados publicados en ratón, conjuntamente con nuestros resultados actuales apoyarían la hipótesis que la expresión diferencial de SLAM y de SAP participaría en la modulación del patrón de citoquinas producido durante la infección por M. leprae. Ha sido informado que las cantidades relativas de expresión de SLAM y de SAP podrían variar durante la activación linfocitaria y en algunos desórdenes autoinmunes, y que la abundancia relativa entre estas dos moléculas podría tener un rol en las funciones que dependen de SLAM⁹. De hecho, ha sido propuesto que la expresión diferencial de SLAM y SAP estaría relacionada con el estado de activación de la célula¹⁴. En ratón, la expresión de SAP es regulada negativamente en forma inmediata en células T activadas, mientras que la expresión de SLAM aumenta tempranamente. Asimismo, el gen de SAP contiene múltiples sitios que podrían estar involucrados en la regulación de su expresión, y esta regulación ocurriría a través de múltiples mecanismos, a nivel transcripcional y a nivel post-transcripcional por moléculas de degradación de ARNm¹⁴. Por lo tanto, proponemos que la regulación de la producción de IFN-g por moléculas de señalización en lepra sería en primer lugar dependiente del reconocimiento del antígeno por los linfocitos. Las células T de pacientes con lepra tuberculoide responden al antígeno rápidamente, aumentando los niveles de expresión de SLAM en su superficie, mientras que la expresión de SAP disminuye de manera transitoria en respuesta a la activación celular. Asimismo, estas dos señales se combinan para aumentar la expresión de IFN-g. Esta cascada de señalización se ve impedida en los pacientes con lepra lepromatosa, ya que la anergia específica frente a M. leprae impide la regulación positiva de la expresión de SLAM y las moléculas de SAP existentes previenen la producción de IFN-g.
     Los resultados del presente estudio, junto con nuestros resultados anteriores en lepra¹⁰ y tuberculosis¹¹, señalan a SLAM y a SAP como potenciales blancos moduladores de citoquinas en enfermedades con respuestas Th2 disfuncionales.

Fig. 1.- Células mononucleares de sangre periférica (CMSP) provenientes de pacientes con lepra lepromatosa (L-Lep), lepra tuberculoide (T-Lep) y dadores sanos (DS) fueron cultivadas en presencia o ausencia de sonicado de M. leprae por 16 hs. El ARN total fue purificado y se realizó RT-PCR, utilizando cebadores específicos para SLAM, IFN-g y SAP. Con el objetivo de comparar los niveles de ARNm entre diferentes muestras, se normalizaron las concentraciones de ADN complementario a una cantidad equivalente de producto de PCR de b-actina. (A) Ejemplos representativos de pacientes L-Lep, T-Lep y DS. (B) Densitometría de los resultados obtenidos frente a estimulación de CMSP con M. leprae. Los datos se expresan como unidades arbitrarias (UA).

     Agradecimientos: El presente trabajo recibió el apoyo del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET) y de la Fundación Antorchas. Los autores agradecen asimismo, a Adriana Corigliano por el apoyo técnico brindado.

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