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Medicina (Buenos Aires)

versión On-line ISSN 1669-9106

Medicina (B. Aires) v.65 n.3 Buenos Aires mayo/jun. 2005

 

Rearreglos de genes de cadenas pesadas de las inmunoglobulinas en las gammapatías monoclonales

Andrea Bosaleh, Valeria Denninghoff, Alejandro García1, Carla Rescia1, Alejandra Avagnina, Boris Elsner

Servicio de Patología; 1Servicio de Citometría de Flujo;  CEMIC, Buenos Aires

Dirección postal: Dr. Boris Elsner, Servicio de Patología, CEMIC, Galván 4102,  1431 Buenos Aires, Argentina. Fax: (54-11) 4546-8264, e-mail: belsner@cemic.edu.ar

Resumen
Las neoplasias de células plasmáticas resultan de la expansión de un clon de células B que secreta inmunoglobulinas, conocido como componente monoclonal o componente M. Las neoplasias malignas incluyen al mieloma múltiple y la macroglobulinemia de Waldenström, y la condición premaligna comprende las gammapatías monoclonales de significado incierto (MGUS). El MGUS presenta un componente monoclonal sin evidencia de mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenström, amiloidosis primaria u otros desórdenes. El diagnóstico se basa en la combinación de características patológicas, radiológicas y clínicas. Aproximadamente el 25% de las gammapatías monoclonales de significado incierto desarrollarán mieloma múltiple, amiloidosis sistémica, macroglobulinemia o enfermedades linfoproliferativas malignas,  indicando que sería una condición premielomatosa. El objetivo del presente trabajo es establecer la utilidad clínica de la inmunofenotipificación por citometría de flujo (CF) y la detección de clonalidad por biología molecular. Se estudiaron 32 pacientes, siete con diagnóstico de mieloma múltiple y veinticinco con gammapatía monoclonal en estudio, los cuales fueron divididos en cuatro grupos basados en los datos clínicos y los resultados de CF. En el grupo de pacientes con CF no diagnóstica, se realizó la detección de los rearreglos de los genes de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), detectándose monoclonalidad en el 59% de los casos. El estudio de los rearreglos de los genes de las cadenas pesadas de las IgH mediante PCR incrementa la sensibilidad de detección de monoclonalidad.

Palabras clave: Gammapatía monoclonal, MGUS, Rea-B

Abstract
Immunoglobulin heavy chain gene rearrangements in the monoclonal  gammopathies. Plasma cell neoplasia occurs as a result of the expansion of an immunoglobulin-secreting B-cells clones, known as monoclonal component or M component. Malignant neoplasias include multiple myeloma and Waldenström macroglobulinemia, while premalignant conditions comprise monoclonal gammopathies of unknown significance (MGUS). MGUS present a monoclonal component with no signs of multiple myeloma, Waldenström macroglobulinemia, primary amyloidosis or other disorders. Pathological, radiological and clinical features are required for the diagnosis. Approximately 25% of patients with MGUS will become multiple myeloma, primary amiloidosis, macroglobulinemia, or other lymphoproliferative disease, which would be a premyelomatous condition. The objective of this study was to determine the clinical implications of immunophenotyping by flow cytometry and of the detection of clonality by molecular biology. A total of 32 patients were studied. Seven of them were diagnosed with multiple myeloma, and 25 with monoclonal gammopathy under study. These 32 patients were divided into four groups, based on their clinical data and flow cytometry outcome. In patients with non-diagnostic flow cytometry detection of immunoglobulin heavy chain gene rearrangements by PCR was performed, and monoclonality was found in 59% of the cases. The study of immunoglobulin heavy chain gene rearrangements by molecular biology allows a more sensitive detection of clonality.

Key words: Monoclonal gammopathy, MGUS, Rea-B  

      Las neoplasias de células plasmáticas resultan de la expansión de un clon de células B que secreta inmuno-globulinas, conocido como componente monoclonal o componente M, que puede expresarse en condiciones malignas, benignas y premalignas. Entre las malignas se pueden encontrar el mieloma múltiple (MM) y la macroglobulinemia de Waldenström, y entre las neo-plasias premalignas se incluyen las gammapatías monoclonales de significado incierto (MGUS)1.
      El MM es el prototipo de gammapatía monoclonal (GM) maligna que representa el 15% de los procesos neoplásicos hematológicos2. La misma se caracteriza por la presencia de una proteína sérica monoclonal, destrucción esquelética con lesiones osteolíticas, fracturas patológicas, dolor óseo, hipercalcemia y anemia. Esta enfermedad posee un espectro que va desde las formas localizadas conocidas como plasmocitomas, hasta las formas agresivas y diseminadas como la infiltración de células plasmáticas en varios órganos, tales como el riñón, conocido como riñón del mieloma, el compromiso neurológico por compresión medular3, leucemias de células plasmáticas y desórdenes secundarios al depósito de cadenas pesadas en tejidos1.  El diagnóstico está basado en las características patológicas, radiológicas y clínicas, requiriendo como mínimo un criterio mayor y uno menor, o tres criterios menores (Tabla 1). El MM habitualmente es una enfermedad incurable con una sobrevida media de 3 años4, 5.

TABLA 1.– Criterios diagnósticos para mieloma múltiple

      La MGUS podría ser el prototipo de gammapatía monoclonal (GM) premaligna que se caracteriza por presentar un componente M sin evidencia de MM, macro-globulinemia de Waldenström, amiloidosis primaria u otros desórdenes. Se asocia a plasmocitosis medular menor al 10%, sin presentar lesiones óseas líticas ni síntomas relacionados con el MM. Los pacientes suelen ser asintomáticos y el componente M se pone en evidencia al realizar un proteinograma electroforético, método que detecta la banda característica de proteína monoclonal. La MGUS presenta una prevalencia del 1% en pacientes mayores de 50 años y del 3% en los mayores de 70 años1. Algunos autores citan que aproximadamente el 25% de los pacientes con MGUS desarrollan MM, amiloidosis primaria, macroglobulinemia de Waldenström y otras enfermedades linfoproliferativas luego de un seguimiento de más de 20 años  post-detección1, 6, 7. El intervalo medio entre reconocer la proteína monoclonal y el diagnóstico de mieloma múltiple, macroglobulinemia y amiloidosis es de aproximadamente 10 años1, 6. El MM puede desarrollarse en cualquier momento posterior a la detección inicial del MGUS, dado que la curva que describe el riesgo de desarrollar MM no posee plateau 7, 8, por lo tanto los pacientes  con una población de células monoclonales deben ser controlados de por vida6, 7.
     
En nuestro trabajo se estudiaron pacientes con gammapatía en estudio (GE) y pacientes con diagnóstico de MM que recibieron tratamiento quimioterápico (melfalan, VAD: vincristina- doxorubicina-dexametasona), sin transplante de médula ósea. El grupo GE se define como pacientes asintomáticos con detección del componente M en suero o en orina, detectado mediante inmunoelec-troforesis. A todos estos pacientes se le realizó  en paralelo un estudio histopatológico de la biopsia de médula ósea (BMO) e inmunofenotipificación por citometría de flujo (CF) de la punción aspiración de médula ósea (PAMO), para evaluar el porcentaje de infiltración por células plasmáticas. Posteriormente, en los pacientes con inmunofenotipificación negativa, se efectuó la detección de los rearreglos de los genes de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas (Rea-B) mediante la  reacción en cadena de la polimerasa (PCR), técnica altamente sensible.
     
El objetivo del presente trabajo fue establecer la utilidad clínica de la inmunofenotipificación por CF y la detección de clonalidad mediante PCR.

Materiales y métodos

Se recibieron 51 pacientes en estudio por GM en el Servicio de Patología del CEMIC entre los años 1999 y 2002, de los cuales se seleccionaron 32 que contaban con BMO y PAMO para realizar estudios comparativos. Contamos con 17 hombres y 15 mujeres con una edad media de 62.9 años (rango a 52 de 82 años). Siete de ellos tenían diagnóstico previo de MM y 25 de GM en estudio.
      Histopatología: las BMO fueron fijadas con una solución bufferada de formol y embebidas en parafina. Se realizaron cortes de 3 micras (µm) los cuales fueron coloreados con hematoxilina y eosina. Se obtuvieron nuevas secciones de 3µm y se incubaron con el anticuerpo monoclonal CD138 o syndecan-19 (DAKO, Carpenter, California, EE.UU., 1:50) utilizando el complejo avidina-biotina aplicando el kit Vectastin Elite (Vector Labs, Burlingame, EE.UU.). Se reveló con el cromógeno 3,3’- diaminobenzidina (Aldrich), se acentuó la marcación con sulfato cúprico y se contrastó con hematoxilina virada en carbonato de litio. Con ambas técnicas se evaluó el porcentaje de compromiso medular de células plasmáticas.
      Citometría de Flujo: en el material de las PAMO remitidas se realizó separación de mononucleares por gradiente de densidad con Ficoll-Hipaque (Sigma, St. Louise, EE.UU.). Las células se centrifugaron durante 20 minutos a 3000 revoluciones por minuto (r.p.m.). El material obtenido fue resuspendido en buffer PBS y centrifugado a 1.500 r.p.m. durante 25 minutos. Las muestras se dividieron en tubos con un recuento final de 5x105 células por tubo y fueron marcadas con 20 microlitros (µl) de los siguientes anticuerpos mono y policlonales: CD7 (FITC), CD8 (FITC), CD38 (FITC y PE) de Immunotech (Marseille, Francia), CD3 (PE), CD19 (PE y Per CP), CD4 (PE), CD45 (Per CP), CD56 (PE), CD10 (FITC) de Becton Dickinson (San  José, CA, EE.UU.), k: kappa (FITC), l: lambda (FITC y PE) de Dako (Glostrup, DK). Los tubos fueron incubados en la oscuridad a 4°C durante 30 minutos. Luego fueron lavados con buffer PBS y centrifu-gados a 1.500 r.p.m. durante 15 minutos, se descartó el sobrenadante. Se resuspendieron en buffer PBS y se analizaron con un citómetro de flujo FACScan de Becton Dickinson Immunocytometry Sistems utilizando el programa CELL Quest. Se realizó análisis multiparamétrico de las distintas poblaciones celulares basado en propiedades morfológicas: Forward Scatter (FSC) y Side Scatter (SSC), y la intensidad de la fluorescencia. Las poblaciones se discriminaron basándose en FSC, SSC y la expresión de CD45. Para evaluar cadenas livianas, IgG e IgA citoplasmáticas se utilizó el kit de permeabilización de Immunotech (Marcella, Francia). Se definieron como monoclonales las poblaciones de células plasmá-ticas con una relación k/l mayor o igual a 5 o menor a 0.5.

     
Amplificación por PCR: en los 16/32 casos con CF negativa, se purificó ADN a partir de muestras en fresco mediante una digestión en buffer-PK (100 milimolar (mM) Tris HCl-ph=8, 25mM EDTA, 0.5% SDS, 0.01% PK) a 12 horas 42 °C. Las fracciones lipo-proteicas fueron extraídas con fenol-cloroformo-isoamílico (Carlo Erba, Italia). El ADN purificado fue precipitado con NaCl/isopropanol y resuspendido en T10E1(Tris-EDTA). La pureza y el rendimiento del ADN obtenido fueron medidos por espectroscopia. Se analizó la presencia de una población clonal B mediante la amplificación de un fragmento de las cadenas pesadas de las inmunoglo-bulinas, con el primer VH (5’-CTGTCGACACGGCCGTGTA-TTACTG-3) homólogo a la secuencia cercana al extremo 3’ de la región FR3 altamente conservada y un segundo primer JH (5’-AACTGCAGAGGAGAC-GGTGACC-3’) de una secuencia consenso, que determinan diferentes fragmentos comprendidos entre 90-160 pares de bases (pb) debido a la variabilidad dada por los reordena-mientos de los genes discontinuos de las inmunoglobulinas11. Existen innumerables primers descriptos en la literatura con diferentes ventajas y desventajas para el estudio de procesos linfoproliferativos. Elegimos este ensayo porque es simple (requiere un solo par de primer consenso para los reordenamientos VH/JH), rápido (no es una técnica nested, no utiliza primers múltiples, no requiere secuenciación posterior, ni geles desnaturalizantes), sensible (detecta 82% de los procesos linfoproliferativos comparados con la técnica de Southern Blot), específico (no tiene resultados falsos positivos), no radiactivo (no utiliza sondas marcadas con radioisótopos), versátil (puede ser utilizado a partir de material en fresco o fijado en formol y para-finado), reproducible y económico (no es necesario utilizar una técnica cuantitativa)12. La amplificación fue realizada en un volumen de reacción de 25 µl usando 500 nanogramos (ng) de ADN total. Cada tubo de reacción contenía 25 picomoles de cada primer, 200 micromolar (µM) de cada dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 2.5 mM Cl2Mg y 1 unidad de Taq polimerasa (Promega, WI, EE.UU.). Después de un paso inicial de desnaturalización a 94 °C durante 5 minutos fueron realizados 30 ciclos de amplificación (desnaturalización a 94 °C durante 40 segundos, annealing a 56 °C durante 40 segundos y elongación a 72 °C durante 1 minuto) con una elongación final a 72 °C durante 5 minutos. En cada pool de reacciones se amplificó ADN correspondiente a una leucemia linfática crónica B como control positivo, ADN purificado a partir de leucocitos extraídos como controles negativos y ausencia de ADN (agua) como blanco de amplificación. Un fragmento de 110 pb del gen de la beta-globina humana fue investigado en todas las muestras como control de amplificación, verificando la ausencia de inhibidores de la PCR en la muestra13. Las PCR fueron evaluadas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 9% en buffer TBE 1X (Tris-bórico-EDTA), visualizadas con bromuro de etidio bajo luz ultravioleta y fotografiadas.

Resultados

A partir del estudio histopatológico de las BMO se estableció el porcentaje de infiltración de células plasmáticas (CP) en forma semicuantitativa utilizando los cortes teñidos con hematoxilina y eosina, y el anticuerpo monoclonal CD138. El análisis de la inmunofenotipificación mediante CF a partir de las PAMO mostró un inmunofenotipo clásico de MM en 16/32 casos: CD45-, CD38+ (intenso), CD56+, CD19-, CD10+/-, CD3-, CD4-, CD7-, CD8- con restricción de cadenas livianas citoplasmáticas, considerando este inmunofenotipo como un resultado positivo. Dentro de este grupo, 12/16 individuos mostraban IgG lambda y 4/16 IgA kappa. La capacidad de detección de la CF dependió básicamente del número de CP en médula ósea, dado que esta técnica identificó clonalidad en el 100% de los casos cuando la infiltración con CP era mayor al 10%, en el 84% de los casos cuando se consideraban las muestras con infiltración mayor al 5% y en el 76% de los casos cuando se evaluaban aquellas mayores al 1%. 
     
La población estudiada fue dividida en cuatro grupos (A, B, C y D) de acuerdo al diagnóstico clínico y el resultado de la CF (Tabla 2). En el grupo A y B se incluyeron los pacientes con inmunofenotipo positivo. En el grupo A se encontraban los pacientes con GE y en el grupo B los que tenían MM post-tratamiento. Por otro lado, en el grupo C y D se incorporaron pacientes sin clonalidad mediante CF. En el grupo C se encontraban los pacientes con GE y en el grupo D los que tenía MM post-tratamiento. El grupo A contaba con 11 individuos, (8 mujeres y 3 hombres), con infiltraciones de CP en BMO entre el 5 y el 80% (mediana 10%). El grupo B incluía 5 pacientes, (1 mujer y 4 hombres) con infiltraciones en BMO de CP entre el 5 y el 80% (mediana 20%). El grupo C tenía 14 pacientes (4 mujeres y 10 hombres), que presentaban infiltraciones de CP en BMO menores al 5% y el grupo D incluía 2 pacientes de sexo masculino con infiltraciones medulares menores a 1% (no detectables con los métodos de rutina).

TABLA 2.– Resultados comparativos de histopatología y citometría de flujo

      Mediante el estudio molecular 12/14 pacientes del grupo C fueron consideraros evaluables. No se obtuvo material amplificable (tasa de fracaso) en 2/14 pacientes. En 7/12 (59%) individuos se observó una banda de amplificación de mayor intensidad entre 90-160pb correspondiente a la población clonal B sobre un smear que representa las demás poblaciones B. Dentro del grupo D se observó monoclonalidad en uno de los dos individuos (Tabla 3).

TABLA 3.– Resultados de PCR. Pacientes con citometría de flujo negativa: grupo C y D. Comparación con infiltración de células plasmáticas en BMO

Discusión

De acuerdo con la literatura, se ha observado que el 25% de los pacientes con MGUS pueden desarrollar MM, amiloidosis primaria, macroglobulinemia u otros desórdenes linfoproliferativos1, 6, 7. El intervalo comprendido desde el reconocimiento del componente M hasta el diagnóstico de las entidades anteriormente descriptas es de aproximadamente 10 años, por lo tanto los pacientes con MGUS deberían tener un seguimiento clínico por el riesgo de una enfermedad progresiva1, 6, 7. El diagnóstico de las GM se realiza mediante datos bioquímicos, ra-diológicos, clínicos, histopatológicos e inmunofenotipifi-cación por CF. Para el estudio histopatológico es importante determinar en cortes de rutina, teñidos con hematoxilina y eosina el porcentaje de CP, que no es fácil de evaluar cuando las infiltraciones de CP son escasas. Por lo tanto se procede a aumentar la sensibilidad, utilizando un inmunomarcador para facilitar el conteo celular. En nuestro trabajo se utilizó el anticuerpo monoclonal CD138 que se corresponde con estadios tardíos de la diferenciación B10 y que se expresa con alta densidad en CP normales, malignas viables16 y linfoplasmocitoides17, 18. El CD138 es un marcador específico de CP y no muestra asociación con otras células hematopoyéticas o endoteliales15. La infiltración por CP mayor o igual al 30% es criterio diagnóstico de MM1. Nuestros resultados arrojan en 14/32 BMO porcentajes de infiltración con CP entre el 10 y el 80%, en  5/32 de los pacientes un porcentaje de infiltración de 5%, en 2/32 pacientes un 3% y en 11/32 pacientes se encontró menos de 1% de infiltración.
     
La inmunofenotipificación mediante la CF es ampliamente utilizada para la detección de MM y procesos linfoproliferativos porque posee ventajas como el análisis simultáneo multiparamétrico de grandes cantidades de células con varios anticuerpos, la cuantificación de las mismas y la rapidez de los resultados. El análisis del inmunofenotipo utilizando CD56 y anti-CD19 diferencia en el 65% de los casos las CP mielomatosas maduras que expresan CD19- y CD56+, de las CP normales que expresan CD19+ y CD56-10, 19, 20. En nuestro trabajo la CF  mostró el inmunofenotipo clásico en 16/32 pacientes con GM en estudio, los cuales presentaban infiltracio-nes de CP en BMO entre el 5 y el 80% con una media de 32%. En los casos considerados como negativos la infiltración hallada fue menor al 5%. Todos los casos que fueron positivos para CF tenían una celularidad mayor o igual al 5% con una mediana del 20%, por lo tanto los datos sugieren que la capacidad de detección  de este método depende estrechamente de la celularidad de la muestra. Según lo que se desprende de este trabajo, la CF podría ser un método de screening complementario para la detección de MM.
     
Swedin y col21 utilizaron la identificación de Rea-B mediante PCR para detectar enfermedad residual mínima en pacientes con MM post transplante de médula ósea. La detección de enfermedad mínima residual por estos métodos ha sido también informada por otros autores como factor pronóstico en niños con leucemia linfoblástica aguda22, 23, leucemia linfocítica crónica24 y linfoma no Hodgkin-B25. Por otro lado, Brinckman26 utilizó la misma técnica para el diagnóstico de linfomas-B de bajo grado, concluyendo que la PCR puede ser un método diagnóstico para verificar la sospecha de infiltración linfomatosa en casos no concluyentes por histopatología e inmunohistoquímica. Se utilizó también la técnica cuantitativa PCR “Real time”27 para la detección de enfermedad mínima residual post transplante medular, demostrando que el análisis cuantitativo de IgH es una nueva vía para evaluar la eficacia terapéutica y predecir pronóstico en pacientes con MM. Lacy y col.28 compararon la expresión de interleuquina-1 beta (IL-1 beta) en MGUS y MM por hibridación in situ, detectando la expresión de IL-1 beta en más del 95% de los pacientes con MM y en menos del 25% de aquellos con MGUS, pudiendo determinar cómo la expresión aberrante en CP de la interleuquina podría ser predictiva del progreso eventual de MGUS a MM. Sibley y col.29 encontraron la translo-cación t(4;14) mediante la técnica de RT-PCR en el 10% (7/67) de los pacientes con MM. Estos pacientes sobreexpresaban la proteína FGFR3 cuyo gen mapea en el brazo corto del cromosoma 4. Posiblemente la desregulación génica de este gen se deba al acercamiento de los promotores fuertes de las inmunoglobulinas de la región 14q32.
     
Todos estos antecedentes nos llevaron a estudiar a los pacientes no diagnosticados mediante las técnicas de rutina (histopatología y CF) mediante PCR (técnica disponible en nuestro laboratorio para el estudio de clonalidad en procesos linfoproliferativos B y T) con el objetivo de aumentar la sensibilidad de detección. El estudio de Rea-B en nuestro trabajo detectó clonalidad en 7/12 (59%) de los casos del grupo C, todos con infiltraciones de CP en BMO menor del 5% (4/7 con menos del 1%). En ningún caso se realizó cambio terapéutico post hallazgo. En un futuro, si la utilidad de esta determinación tiene alguna implicancia clínica, podría agregarse una segunda PCR para el FR2 para aumentar la sensibilidad de detección en un 7% adicional12.
     
Según la literatura, aproximadamente un 25% de los pacientes con MGUS pueden desarrollar MM, amiloidosis primaria, macroglobulinemia o trastornos linfoprolife-rativos durante un seguimiento de más de 20 años; entonces, la detección de una población clonal en pacientes con MGUS debiera estudiarse para saber si podría ser considerado un predictor de enfermedad, colocando a estos pacientes dentro de un estrato de riesgo.
     
En conclusión, el estudio de los rearreglos de los genes de las cadenas pesadas de las IgH mediante técnicas de biología molecular incrementó la sensibilidad de detección de monoclonalidad. La identificación de una población clonal en pacientes con MGUS podría considerarse un factor predictor de enfermedad, pero serían necesarios estudios a largo plazo con un número mayor de casos para probar esta hipótesis.

Agradecimientos: A Valeria P. Melia, de la Unidad de Investigación Dr. Baron, por la traducción al inglés del resumen del trabajo. A Hugo Krupitzki por el asesoramiento estadístico.

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Recibido: 17-06-2004
Aceptado: 17-03-2005