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Medicina (Buenos Aires)

versión On-line ISSN 1669-9106

Medicina (B. Aires) v.65 n.4 Buenos Aires jul./ago. 2005

 

Ensayo preclínico de la vacuna candid #1 producida en Argentina contra la Fiebre Hemorrágica Argentina

Ana M. Ambrosio, Laura M. Riera, María del Carmen Saavedra, María J. Sottosanti†

Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr. J.I. Maiztegui Pergamino, Provincia de Buenos Aires

Fallecida el 13-VII-2004

Dirección postal: Dra. Ana M. Ambrosio, Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr. J.I. Maiztegui, Monteagudo 2510, 2700  Pergamino, Argentina. Fax: (02477) 433045/ 422020. E-mail: anaambrosio@yahoo.com.ar

Resumen
Se comparó en cobayos la seguridad, inmunogenicidad y eficacia protectora de un lote de vacuna Candid #1(C#1) fabricada en Estados Unidos de América (EE.UU.) y distintos lotes de la misma vacuna fabricados en Argentina (Arg). El lote TSI 5-1-92 (EE.UU.) y los lotes Exp Nº 3, 7A y 8A (Arg) fueron inoculados (0.5 ml, IM) en cobayos de 250-400 g. Para cada ensayo diez animales recibieron solución fisiológica y sirvieron como control. Todos fueron desafiados con la cepa patógena P23790 de virus Junin. Se registró: a) temperatura rectal, b) peso corporal, c) presencia de anticuerpos neutralizantes (AcNT) pre y post-vacunación, d) respuesta al desafío. Todos los animales vacunados desarrollaron AcNT anti virus Junin (rango = 40- 81920 y sobrevivieron al desafío. En cada grupo control 8/10 animales murieron (día 23.3 ± 5.4 post-desafío). Los cobayos resultaron idénticamente protegidos de una descarga letal de virus Junin por la vacuna importada y los diferentes lotes de C#1 producidos en Argentina.

Palabras clave: fiebre hemorrágica argentina, vacuna argentina, ensayos preclínicos

Abstract
Preclinical assay of Candid #1 vaccine against Argentine Hemorrhagic Fever made in Argentina.  Candid #1 vaccine against Argentine Hemorrhagic Fever produced in USA versus lots of the same vaccine made in Argentina were compared in guinea pigs regarding safety, immunogenicity and protective efficacy against a challenge with pathogenic Junin virus. Lots Nº Exp 3, 7A and 8A of Argentine origin as well as lot TSI 5-1-92 from USA were inoculated in guinea pigs of 250-400 g in two consecutive assays. Ten animals inoculated with saline performed as normal controls in each experiment. Parameters studied were: a) temperature; b) body weight; c) neutralizing antibodies to Junin virus; d) response to viral challenge. Animals gained weight and remained normothermic up to the challenge. Guinea pigs that received Candid #1 from any manufacturer elicited neutralizing antibodies to Junin virus (titles from 40 to 81920) and survived to challenge whilst 8/10 animals died in each control group. Data presented demonstrated that Candid #1 vaccines from USA or Argentine manufacturers were equally safe, immunogenic and protective in guinea pigs.

Key words: Argentine Hemorrhagic Fever, Argentine vaccine, preclinical assays

     La Fiebre Hemorrágica Argentina (FHA) es una enfermedad viral aguda y grave1 que tiene como agente etiológico al virus Junin, perteneciente a la familia Arenaviridae constituida, hasta hoy, por 23 agentes que tienen a pequeños roedores como reservorios naturales2.
     Desde el descubrimiento del virus Junin se han producido brotes anuales de FHA sin interrupción, siendo un aspecto relevante la extensión progresiva del área endémica. La zona afectada, circunscripta en 1958 a cuatro partidos de la provincia de Buenos Aires, con una superficie de 16 000 km2 y con una población a riesgo estimada en 270 000 habitantes, abarca actualmente unos 150 000 km2, con una población a riesgo estimada en 5 000 000 de habitantes (M.R. Feuillade, comunicación personal). Estas características epidemiológicas hacen que la FHA sea una enfermedad prevenible y no erradicable, consenso al que se arribó a mediados de los años 70 cuando se consolidaron diversas líneas de investigación tendientes a obtener una vacuna para prevenir la FHA 3- 11.
     La vacuna a virus Junin vivo atenuado Candid #1 (C #1) fue el resultado de un proyecto de colaboración internacional, que incluyó al gobierno de Argentina, al Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas (INEVH), la Organización Panamericana de la Salud, el Programa de Desarrollo de las Naciones Unidas y el United States Army Medical Research Institute for Infectious Diseases de EE.UU. El desarrollo se inició en 1979 y entre 1985 y 1990 se demostró la seguridad, inmunogenicidad y eficacia protectora (95.5%, intervalo de confianza 82%- 99%, p< 0.001) de la vacuna C #112. Esta vacuna, destinada a una población limitada, es considerada un producto huérfano, por lo que en el proyecto de desarrollo ya se había previsto su producción en el INEVH de Argentina. Los laboratorios de la Unidad de Producción del INEVH fueron adaptados para reunir los requisitos actuales de las buenas prácticas de manufactura, y habilitados, en el 2001, como planta elaboradora de vacunas virales para uso humano por la autoridad regulatoria nacional (ANMAT). En ellos se han producido tres lotes experimentales de vacuna C #1 y varios lotes ampliados destinados al uso en humanos, cuyos procedimientos de producción, control y aseguramiento de la calidad han sido inspeccionados y aprobados por la ANMAT en el 2003. De estos lotes, el primero (7A) será probado en ensayos clínicos según protocolos ya aprobados por la ANMAT, requeridos para el registro de C #1 como nueva especialidad medicinal, a fin de continuar las campañas de vacunación con C # 1 producida en Argentina. En este trabajo se presentan los estudios pre-clínicos realizados en cobayos para determinar la seguridad, inmunogenicidad y la eficacia protectora contra el desafío con una cepa virulenta de virus Junin, de lotes de la vacuna C #1 de origen Argentina, en comparación con un lote de C #1de origen EE.UU., que ya ha sido utilizada en voluntarios durante campañas de vacunación selectiva en Argentina.
     Se utilizaron cobayos cepa Hartley, de 250 a 400 g de peso, microbiológicamente monitoreados. Los animales fueron manipulados cumpliendo con las buenas prácticas en el tratamiento de animales de experimentación13.
     Los lotes de vacuna C # 1 estudiados fueron:
-   Lote 5-1-92 (TSI), origen EE.UU., título 1.67 x 104 ufp/ml
-   Lote experimental Nº3 (INEVH), origen Argentina, título 4.8 x 104 ufp/ml
-   Lote 7A (INEVH), origen Argentina, título 2.29 x 104 ufp/ml
-   Lote 8A (INEVH), origen Argentina, título 3.13 x 104 ufp/ml

     En todos los experimentos la administración de vacuna, en la dilución correspondiente, se realizó mediante una dosis de 0.5 ml por la vía IM en cada animal. La cepa patógena P23790 de virus Junin, aislada de un caso fatal de fiebre hemorrágica argentina, stock ST 274447-52, con título 3.83 x 108 ufp/ml, se utilizó para la descarga viral en todos los experimentos, inoculándose 1.5 ml IP conteniendo 760 y 1400 ufp del virus, previamente probada como una dosis letal 100%.
     La titulación de anticuerpos neutralizantes en las muestras de suero obtenidas de los animales se realizó mediante una prueba de neutralización por reducción del 80% de ufp bajo agar en células Vero C76 (ATCC CRL 1587)14. Los experimentos fueron realizados por operadores inmunes para fiebre hemorrágica argentina, en un entorno de nivel III de bioseguridad y se desarrollaron en dos etapas.
     En la primera etapa, los lotes Experimental Nº 3 (origen Argentina) y TSI 5-1-92 (origen EE.UU.) fueron inoculados sin diluir y en diluciones desde 10-1 hasta 10-3 en grupos de diez animales por dilución de cada vacuna. Otros diez cobayos fueron inoculados con el mismo volumen y por la misma vía con solución fisiológica para su utilización como control normal. Se determinó que todos los cobayos fueran libres de anticuerpos NT para virus Junin antes de su admisión en el estudio. Se tomó una muestra de suero de cada uno de los 90 cobayos (80 vacunados y 10 controles) en el día 70 p.i. para determinación de título de anticuerpos NT y en el día 95 p.i. todos los animales fueron desafiados con 766 ufp de la cepa letal P P23790 de virus Junin.
     En la segunda etapa, los lotes de vacuna C #1 identificados como 7A y 8 A (origen Argentina) fueron inoculados sin diluir en sendos grupos de 10 cobayos por lote de vacuna, con la dosis y vía ya descriptas. Un grupo adicional de 10 animales fue inoculado con solución fisiológica para su utilización como control normal. Todos los animales, libres de anticuerpos NT para virus Junin antes de la vacunación, fueron sangrados en el día 30 p.i. para determinación de títulos de anticuerpos NT y desafiados con 1400 ufp de la cepa letal P23790 de virus Junin, en el día 39 p.i.
     En ambos experimentos se realizaron determinaciones de peso y temperatura rectal dos veces por semana durante las dos primeras semanas p.i., continuándose con una determinación semanal hasta el día de la descarga viral. Luego de la descarga viral sólo se registraron signos/ síntomas de enfermedad y muerte.
     Todos los animales presentaron normotermia y la ganancia de peso desde la inoculación de C #1 hasta el momento del desafío fue comparable a la de los cobayos control.
     Todos los cobayos respondieron con la formación de anticuerpos NT a la inoculación con C# 1. En la Tabla 1 se presentan los títulos medios de anticuerpos correspondientes a cada grupo inoculado con los diferentes lotes de vacuna. No se encontraron diferencias significativas entre los títulos medios de anticuerpos generados por C #1 de origen EE.UU. y el lote experimental Nº3 INEVH de origen argentino, inoculadas sin diluir (p< 0.01), ocurriendo lo mismo cuando se compararon los títulos medios de Ac generados por la inoculación sin diluir del lote importado TSI 5-1-92 vs el lote 8A , de origen nacional destinado a la población. La excepción fue el lote 7A (Arg), que generó un nivel de Ac significativamente superior al correspondiente a la vacuna importada (p= 0.004; Tabla 1).Todos los cobayos vacunados en ambas etapas sobrevivieron al desafío con una cepa letal de virus Junin. Los animales control de ambos experimentos (dos grupos de 10 cobayos), sin Ac NT previos al desafío, mostraron signos y síntomas de enfermedad a partir del día 19 post-descarga y 8/10 murieron en cada experimento como consecuencia del desafío (día medio de muerte = 23.3 ± 5.4). Los animales control que sobrevivieron al desafío desarrollaron Ac NT anti-virus Junin en títulos > 1:20 000.

Tabla 1.– Título medio de anticuerpos neutralizantes obtenidos para cada grupo de cobayos a los  30 y a los 70 días post inoculación con Candid #1

     Los datos presentados demuestran un desempeño notablemente comparable entre la vacuna C #1 de origen EE.UU. y los lotes de C #1 producidos en Argentina. Los títulos medios de anticuerpos neutralizantes anti- C # 1 de ambos orígenes no mostraron diferencias significativas, con excepción del lote 7A (Argentina) vs. lote TSI 5-1-92 (EE.UU.), donde el título de anticuerpos generados por la vacuna importada, significativamente menor, puede deberse al tiempo de almacenamiento a  -30 °C (aproximadamente diez años) que esta última lleva en nuestro país. No obstante, la protección contra la descarga viral conferida por ambos lotes fue idéntica y todos los animales vacunados sobrevivieron. Esto puede interpretarse en base a los resultados obtenidos en la primera etapa de este trabajo (Tabla 1), donde los cobayos respondieron con variables títulos medios de Ac NT, pero fueron igualmente protegidos de la descarga viral por el lote experimental Nº3 (Argentina) y el TSI 5-1-92 (EE.UU.) inoculados desde sin diluir hasta la dilución 1:1000. Esto significa que 17 a 48 ufp de la vacuna Candid #1 resultaron suficientes para proteger cobayos adultos de una descarga 80% letal de virus Junin silvestre. Los títulos medios de anticuerpos generados post- vacunación, que no mostraron diferencias significativas entre los diferentes lotes de vacuna de producción nacional (Tabla 1), así como la normal evolución del peso de los animales vacunados y la sobrevida al desafío demostraron la consistencia de los lotes de C #1 manufacturados en Argentina en cuanto a seguridad, inmuno-genicidad y capacidad protectora en estos modelos experimentales. El lote 7A será utilizado próximamente en un ensayo clínico en voluntarios humanos sobre un protocolo ya aprobado por la autoridad regulatoria nacional (ANMAT). Cumplida esta etapa, los lotes de vacuna Candid #1 presentados en este trabajo serán, en nuestro conocimiento, los primeros lotes de una vacuna a virus vivo atenuado, obtenida en cultivos celulares certificados y destinada a seres humanos, que se han producido íntegramente en Argentina.

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Recibido: 5-07-2005
Aceptado: 22-07-2005