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Medicina (Buenos Aires)

versión On-line ISSN 1669-9106

Medicina (B. Aires) v.66 n.1 Buenos Aires ene./feb. 2006

 

Inmunofluorescencia con Crithidia luciliae para la detección de anticuerpos anti-ADN. Imágenes atípicas y su relación con enfermedad de Chagas y leishmaniasis

Gloria Griemberg1, Nidia F. Ferrarotti1, Graciela Svibel2, Maria R. Ravelli1, Néstor J. Taranto3, Emilio L. Malchiodi4, María C. Pizzimenti1

1 Laboratorio de Inmunología, Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Hospital de Clínicas José de San Martín, Universidad de Buenos Aires; 2 Laboratorio Central, Hospital Escuela José Francisco de San Martín, Corrientes; 3 Instituto de Investigaciones en Enfermedades Tropicales, Universidad Nacional de Salta; 4 Cátedra de Inmunología, (IDEHU, CONICET-UBA). Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires

Dirección postal: Dra. Gloria Griemberg, Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Junín 956, 1113 Buenos Aires, Argentina. Fax: (54-11) 5950-8694. E-mail: ggriemberg@sinectis.com.ar

Resumen
Los anticuerpos  anti-ADN nativo pueden detectarse por inmunofluorescencia indirecta con Crithidia luciliae, observándose tinción fluorescente anular del kinetoplasto que contiene ADN de doble cadena. En algunos casos pueden observarse imágenes fluorescentes en flagelo, membrana y corpúsculo basal, consideradas atípicas. Como C. luciliae pertenece a la familia Trypanosomatidae, que incluye patógenos para el hombre como Trypanosoma cruzi y Leishmaniaspp., se consideró que las imágenes atípicas pudieran deberse a reacciones cruzadas. Se realizaron estudios serológicos para Chagas a 105 muestras provenientes de zona endémica (Corrientes) y no endémica (Buenos Aires) para T. cruzi que presentaban imágenes atípicas con C. luciliae. La serología para Chagas resultó positiva en el 64.7% de las muestras de Buenos Aires y en el 78.3% de las de Corrientes que presentaban frente a C. luciliae imagen conjunta de membrana y flagelo. No presentaron la imagen conjunta ninguna de las muestras de dadores de sangre normales, ni de pacientes con enfermedades del tejido conectivo, excepto dos con lupus que también eran chagásicos. Todas las  muestras de pacientes chagásicos analizadas frente a C. luciliae presentaron la imagen conjunta. Se estudiaron también 46 muestras de pacientes con leishmaniasis, 28 de ellos coinfectados con T. cruzi. La imagen conjunta se observó en el 88.0% de las muestras de leishmaniásicos y en el 78.5% de las de coinfectados. Los resultados sugieren que C. luciliae podría ser un sustrato alternativo, económico y de bajo riesgo para el diagnóstico serológico de enfermedad de Chagas, aunque no discrimina la infección por Leishmania. El hallazgo de la imagen conjunta en la detección de anti-ADN nativo señala la conveniencia de realizar en esos pacientes, estudios clínicos y de laboratorio para enfermedad de Chagas y leishmaniasis.

Palabras clave: enfermedad de Chagas, leishmaniasis, Crithidia luciliae, anticuerpos anti-ADN

Abstract
Immunofluorescence assay with Crithidia luciliae for the detection of anti-DNA antibodies. Atypical images and their relationship with Chagas’ disease and leishmaniasis. Anti-native DNA antibodies can be detected by indirect immunofluorescence assay with Crithidia luciliae, displaying an annular image due to a kinetoplast containing double stranded DNA. Other structures such as membrane, flagellum and basal corpuscle can be stained as well, showing what is called atypical fluorescent images. As C. luciliae belongs to the Trypanosomatidae family, which include the human pathogens Trypanosoma cruzi and Leishmania spp., it was considered that these atypical images could be caused by cross-reactions. Serological studies for Chagas’ disease were performed in 105 serum samples displaying atypical images. Sixty four percent of the samples from non endemic and 78.3% from endemic areas for Chagas’ disease showed fluorescence in both, membrane and flagellum (joint image). Fifty samples from normal blood donors and 57 samples from patients with conective tissue diseases were tested with C. luciliae. None of them presented the joint image except for two patients with lupus who were also chagasic. In addition, 54 samples from chagasic patients were studied and all of them presented the joint image. We also studied 46 samples from patients with leishmaniasis from whom 28 were co-infected with T. cruzi. The joint image was observed in 88.0% of the samples with leishmaniasis and in 89.3% of the co-infected samples. The results suggest that C. luciliae could be used as an economical, and of low risk, alternative substrate for the serological diagnosis of Chagas’ disease, even though it does not discriminate for Leishmania spp. infection. This study also suggests that whenever atypical images are observed in C. luciliae during the search for anti-DNA antibodies, it would be convenient to submit the patient to clinical and serological tests for the diagnosis of leishmaniosis and Chagas’ disease.

Key words: Chagas’ disease, leishmaniasis, Crithidia luciliae, anti-DNA antibodies

     Los anticuerpos (Ac) anti-ADN fueron reconocidos por primera vez en el año 1957 en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES)1. Básicamente existen dos tipos de Ac, los anti-ADN nativo o de doble cadena (ADNn) y los anti-ADN desnaturalizado, dirigidos contra el ADN de cadena simple. Estos últimos poseen poca especificidad diagnóstica, ya que pueden estar presentes en una amplia variedad de enfermedades del tejido conectivo y en otras enfermedades, inclusive no autoinmunes2. En cambio, los Ac anti-ADNn se expresan casi exclusivamente en el LES, por lo cual su presencia constituye uno de los criterios clasificatorios3, 4, siendo además útiles para pronóstico y monitoreo terapéutico de estos pacientes5, 6. La gran ventaja práctica de dosar anti-ADNn condujo al desarrollo de numerosas técnicas para su cuantificación, tales como hemaglutinación, radioinmuno-ensayo, enzimoinmunoensayo e inmunofluorescencia7, 8.
     Uno de los métodos más comunmente utilizados en la práctica clínica es la inmunofluorescencia indirecta (IFI) que utiliza como sustrato antigénico Crithidia luciliae, un hemoflagelado que posee una mitocondria gigante modificada, el kinetoplasto, que contiene ADN de doble cadena en una configuración circular, no asociado con ARN ni con proteínas nucleares9. Crithidia luciliae no es patógena para el hombre y puede mantenerse fácilmente en cultivos, por lo que resulta un sustrato conveniente para la detección de anti-ADNn por IFI, obviando la necesidad de purificar químicamente el ADN. Un resultado serológico positivo se manifiesta por una tinción fluorescente anular del kinetoplasto. Si no se observa fluorescencia del mismo, el resultado se considera negativo.
     Sin embargo, en algunas ocasiones puede observarse fluorescencia en otras estructuras del parásito tales como corpúsculo basal, membrana citoplasmática, flagelo y ocasionalmente en citoplasma, ya sea en forma aislada o en distintas combinaciones. Este tipo de imágenes, designadas en este trabajo como atípicas, no se relacionan con la presencia de Ac anti-ADNn.
     Crithidia luciliae es un parásito de insectos perteneciente a la familia Trypanosomatidae, la cual incluye algunas especies patógenas para el hombre tales como Trypanosoma cruzi, parásito protozoario que se localiza exclusivamente en el Continente Americano y que es el agente causal de la enfermedad de Chagas y Leishmania spp, que genera diferentes formas clínicas de leishmaniasis en el hombre y es endémica en algunas regiones de Latinoamérica incluyendo el noroeste argentino. Teniendo en cuenta estas consideraciones y la existencia de reactividad cruzada entre miembros de esta familia10, 11, el objetivo de este trabajo fue analizar si las imágenes atípicas que se observan en algunos casos cuando se realiza la detección de Ac anti-ADNn por la técnica de IFI con C. luciliae, pueden relacionarse con la presencia de Ac anti-T. cruzi o Leishmania spp.

Materiales y métodos

Muestras séricas

a) Se seleccionaron 105 sueros de pacientes con sospecha de enfermedad autoinmune sistémica y solicitud de anticuerpos anti-ADNn que presentaban imágenes atípicas por IFI con C. luciliae. De ellas, 50 correspondieron a pacientes del Hospital de Clínicas José de San Martín de la Ciudad de Buenos Aires y 55 a pacientes del Hospital Escuela José Francisco de San Martín de la Ciudad de Corrientes, Provincia de Corrientes.
     b) Se analizaron 57 sueros de pacientes con enfermedades autoinmunes sistémicas, distribuidas de la siguiente forma: LES (30), artritis reumatoidea (15) y esclerodermia (12).
     c) Se seleccionaron 54 muestras de seroteca de pacientes provenientes de ambos hospitales, con diagnóstico clínico y serológico de enfermedad de Chagas. La serología fue definida como positiva en base a los resultados concordantes de dos métodos distintos, hemaglutinación indirecta (HAI) e IFI con epimastigotes de T. cruzi.
     d) Como controles negativos para Chagas se utilizaron 50 muestras de dadores de sangre del Servicio de Hemoterapia del Hospital de Clínicas José de San Martín.
     e) Se tomaron 46 muestras séricas de pacientes con diagnóstico de leishmaniasis cutánea o mucocutánea basado en la observación clínica, la proveniencia de área endémica (Orán, H. Irigoyen, Embarcación, Bermejo, Mosconi y Pichanal, Provincia de Salta) y por ser positivos en la intradermorreacción de Montenegro y/o por la presencia de amastigotes de Leishmania spp en el raspado de lesiones. El diagnóstico fue complementado con estudios de IFI con promastigotes de Leishmania braziliensis. De estas muestras, 28 eran de pacientes que además estaban coinfectados con T. cruzi, lo que fue diagnosticado en base a los resultados de las determinaciones de Acs anti-Ag163B6 (específico para T. cruzi), por la presencia de un patrón de bandas específico por immunoblotting frente a epimastigotes y por presentar PCR positiva con primers específicos de T. cruzi 12-14.

Determinación de Acs anti-ADNn

Se utilizó la técnica de IFI según el método descripto9 utilizando improntas de C. luciliae (Bio-Rad, Redmond WA, USA) y conjugado de antiinmunoglobulinas totales humanas obtenidas en burro marcadas con isotiocianato de fluoresceína (Beckman Coulter, Fullerton CA, USA).

Hemaglutinación indirecta para Chagas

Se utilizó el equipo de Polychaco S.A.I.C, Buenos Aires, Argentina, según las indicaciones del fabricante.

Inmunofluorescencia indirecta para Chagas

Se utilizó una suspensión de epimastigotes provista por el Instituto Nacional de Parasitología Dr. Mario Fatala Chaben. Las improntas se prepararon ajustando la concentración de párasitos a 40 por campo microscópico de 400X y se fijaron por calor. La dilución inicial del suero fue de 1/30 en PBS y para la tinción fluorescente se utilizó un conjugado de anti-Ig totales humanas obtenidas en burro, marcadas con isotiocianato de fluoresceína. (Beckman Coulter, Fullerton CA, USA).

Resultados

La imagen característica de la presencia de Acs anti ADNn se caracteriza por una tinción fluorescente anular del kinetoplasto de C. luciliae. La aparición de fluorescencia en otras estructuras del parásito, tales como membrana, flagelo, citoplasma o corpúsculo basal no es indicativa de la presencia de Acs anti-ADNn y debe ser considerada como una imagen atípica. La imagen atípica caracterizada por fluorescencia de membrana y de flagelo se define en este trabajo como imagen conjunta (Fig. 1).


Fig. 1
.- Inmunofluorescencia con Crithidia luciliae realizada con una muestra sérica de paciente chagásico. Se observa una imagen atípica caracterizada por fluorescencia conjunta de membrana y flagelo. El tono grisáceo del citoplasma corresponde a la tinción con el contracolor (Azul de Evans, 1000X).

     A las 105 muestras séricas con solicitud de Ac anti-ADNn que presentaron imágenes atípicas con C. luciliae se les efectuaron estudios serológicos para Chagas (HAI e IFI con epimastigotes de T. cruzi). Se consideró que la serología para Chagas era positiva cuando una muestra presentaba resultados positivos concordantes por ambas técnicas. En la Tabla 1 se presentan los resultados de las 50 muestras del Hospital de Clínicas de Buenos Aires donde se puede ver que de las 17 muestras que presentaban fluorescencia conjunta en membrana y flagelo de C. luciliae, 11 (64.7%) eran también positivas para T. cruzi. Por el contrario, ninguna de las muestras que presentaban fluorescencia únicamente en membrana o en corpúsculo basal fue positiva en los ensayos serológicos para enfermedad de Chagas.

TABLA 1.- Serología para el diagnóstico de enfermedad de Chagas en 50 muestras de zona no endémica con imágenes atípicas en la IFI con Crithidia luciliae

     En la Tabla 2 se pueden observar los resultados obtenidos con las 55 muestras con imágenes atípicas provenientes de una zona endémica de Argentina, la Ciudad de Corrientes. De las 23 muestras que presentaban fluorescencia conjunta en membrana y flagelo de C. luciliae, 18 (78.3%) eran también positivas para T. cruzi. Nuevamente, de las muestras que presentaban fluorescencia en membrana o en corpúsculo basal únicamente, ninguna fue positiva en los ensayos serológicos para enfermedad de Chagas.

TABLA 2.- Serología para el diagnóstico de enfermedad de Chagas en 55 muestras de zona endémica que presentaban imágenes atípicas por IFI con C. luciliae

     El estudio con C. luciliae por IFI de los 57 sueros de pacientes con enfermedades autoinmunes sistémicas mostró que 42 sólo presentaban tinción del corpúsculo basal, 13 no mostraron fluorescencia alguna y 2 pacientes con lupus presentaron una imagen anular característica de Ac anti-ADNn y una imagen atípica caracterizada por la tinción conjunta de membrana y flagelo. Al estudiar las muestras por los métodos HAI e IFI para Chagas, todas presentaron resultados negativos excepto las dos que poseían la imagen conjunta.
     Los 50 sueros de pacientes con diagnóstico clínico y serológico de enfermedad de Chagas de los dos hospitales presentaron fluorescencia conjunta en flagelo y membrana al ser analizados con C. luciliae.
     Ninguna de las 50 muestras de dadores de sangre con serología negativa para Chagas presentó la imagen conjunta al ser analizadas por IFI con C. luciliae. Sólo 3 mostraron una imagen atípica caracterizada exclusivamente por fluorescencia del corpúsculo basal, mientras que en las 47 muestras restantes no se observó ninguna imagen fluorescente.
     Se estudiaron también 46 muestras de pacientes provenientes de zona endémica para leishmaniasis y tripanosomiasis (Salta, Argentina). Los pacientes habían consultado por lesiones cutáneas o mucocutáneas compatibles con leishmaniasis, y el diagnóstico de esta enfermedad se llevó a cabo ya fuera por observación directa de amastigotes en raspados de la lesión o por reacción positiva a la intradermorreacción de Montenegro. Los sueros fueron también estudiados empleando reacciones serólogicas convencionales para el diagnóstico de enfermedad de Chagas, obteniéndose resultados positivos en la mayoría de los casos. Empleando las técnicas de immunoblotting, ELISA con el Ag163B6/cruzipaina y PCR, todos ellos específicos para T. cruzi, se diagnosticó una infección concomitante con T. cruzi en 28 de los pacientes leishmaniásicos. En la Tabla 3 puede observarse que el 88.8% de los 18 pacientes infectados únicamente con Leishmania presentó la imagen atípica de fluorescencia conjunta. El 11.2% restante no mostró imágenes fluorescentes con C. luciliae. De los 28 pacientes coinfectados con T. cruzi, 78.5% presentó la imagen conjunta, 7.1% imagen de membrana únicamente, 3.6% imagen de corpúsculo basal, mientras que 10.7% no presentó imagen fluorescente.

TABLA 3.- Imágenes atípicas obtenidas por IFI con C. luciliae en muestras de pacientes con leishmaniasis y en pacientes con leishmaniasis y enfermedad de Chagas

Discusión

Las ideas iniciales para este trabajo surgieron a propósito de un paciente con cardiopatía proveniente de la provincia de Santiago del Estero, una zona endémica para Chagas, que se encontraba internado en el Hospital de Clínicas sin un diagnóstico preciso pero con sospecha de enfermedad autoinmune, presumiblemente LES. Aunque los estudios inmunológicos destinados al diagnóstico de colagenopatías fueron negativos, llamó la atención que al realizar la búsqueda de Ac anti-ADNn por IFI con C. luciliae, si bien el kinetoplasto no presentaba fluorescencia, se observaba una coloración atípica caracterizada por una intensa fluorescencia conjunta de membrana, flagelo y corpúsculo basal. Estas imágenes fluorescentes son similares a la que se observa en IFI para Chagas con epimastigotes de T. cruzi. Por otra parte, teniendo en cuenta que C. luciliae pertenece a la familia Trypanosomatideae (dentro de la cual se encuentran otros parásitos patógenos para el hombre, como T. cruzi y Leishmania spp), que existen reacciones cruzadas entre miembros de la misma familia10 y que el paciente provenía de zona endémica para Chagas, se consideró que estas imágenes podrían ser debidas a la presencia de Ac anti-T. cruzi, lo cual fue confirmado serológicamente.
     Con el objeto de comprobar si esto era un fenómeno aislado o una reactividad cruzada que se presentaba regularmente, se realizaron los ensayos destinados a la detección de enfermedad de Chagas en muestras de pacientes que mostraban imágenes atípicas utilizando las técnicas de HAI e IFI. Estos estudios se realizaron en paralelo en el Hospital de Clínicas de Buenos Aires y en el Hospital Escuela de Corrientes, porque existen diferencias en la prevalencia de la enfermedad en las dos zonas, con el objeto de estudiar si esto se reflejaba en los ensayos con C. luciliae. En las Tablas 1 y 2 se observa que la única imagen asociada con infección por T. cruzi es la que reúne la tinción conjunta de membrana y flagelo, mientras que las imágenes aisladas no se correlacionaron con serología positiva para Chagas. Los dos sueros que presentaron además fluorescencia citoplasmática se relacionaban con un mayor título de Acs anti-T. cruzi (resultados no mostrados).
     Comparando las Tablas 1 y 2 puede observarse que se registró un porcentaje mayor de casos asociados con enfermedad de Chagas en Corrientes, lo cual no es sorprendente dada la mayor prevalencia en zona endémica. Esta diferencia de prevalencia hallada por métodos serológicos utilizando antígenos de epimastigotes de T. cruzi también se observó al utilizar como antígeno C. luciliae.
     Debe considerarse que en las enfermedades autoin-munes sistémicas se producen autoanticuerpos dirigidos contra antígenos celulares que poseen la propiedad de cruzar la barrera de especie. Podría suponerse que estos autoanticuerpos presentarán reacción cruzada tanto frente a antígenos de C. luciliae como a los de T. cruzi. Sin embargo, los resultados obtenidos con las 57 muestras de pacientes con enfermedades del tejido conectivo muestran que los autoanticuerpos no fueron causa de falsos resultados positivos por cruzamiento. Es de señalar que las dos pacientes con LES que presentaron la imagen conjunta y positividad en las pruebas serológicas para enfermedad de Chagas provenían de zona endémica y sus antecedentes mostraron un diagnóstico positivo para la misma.
     Dado que existen antígenos comunes entre el T. cruzi y tripanosomatídeos propios de insectos11, se consideró la posible utilización de la C. luciliae como fuente alternativa, económica y de bajo riesgo, para la detección de Ac anti-T. cruzi. Para ello, se realizó un estudio por IFI con C. luciliae con las 54 muestras de pacientes chagásicos y con los controles negativos provenientes de banco de sangre, hallándose una completa concordancia con respecto a los resultados obtenidos utilizando epimastigotes de T. cruzi. Otros autores11 ya incursionaron en este terreno utilizando como fuente alternativa de antígenos para el diagnóstico de Chagas por IFI los siguientes tripanosomídeos de insectos: Herpetomonas muscarum muscarum, Crithidia fasciculata y Leptomonas seymouri. Analizaron 151 muestras de pacientes chagásicos y 349 sueros normales. Con H. m. muscarum obtuvieron un 98.7% de resultados coincidentes positivos y 100% de resultados coincidentes negativos, mientras que C. fasciculata y L. seymouri no fueron tan eficientes como fuente alternativa de antígeno para IFI Chagas. Sin embargo, estos autores no analizaron dichas muestras con C. luciliae.
     Posteriormente, Monteón y col.15 desarrollaron un método de ELISA y un Western blot con un extracto crudo de C. luciliae, pero no utilizaron IFI. Aplicaron estas técnicas a 91 muestras de pacientes chagásicos y a 127 muestras de un grupo comparativo constituido por pacientes con toxoplasmosis, leishmaniasis, enfermedad reumática sistémica y enfermedad cardíaca. El ELISA fue siempre positivo con los sueros chagásicos mientras que el 17% del grupo comparativo presentaba resultados falsos positivos. Estos correspondieron a pacientes con leishmaniasis cutánea o visceral. Por Western blot los sueros chagásicos reconocían una banda inmuno-dominante de 30 kDa, mientras que en el grupo comparativo unas pocas muestras de pacientes con leishmaniasis visceral mostraron una débil reacción. Estos autores incluyeron dentro del grupo control muestras de pacientes con leishmaniasis cutánea y visceral, responsables de los resultados falsos positivos, lo cual se explica por las reacciones cruzadas al ser parásitos de la misma familia.
     La leishmaniasis, al igual que la enfermedad de Chagas, es endémica en diversas zonas de Latinoamérica y la distribución geográfica de ambas se superpone en muchas áreas de América Central y del Sur, incluyendo el norte de Argentina14, 16. Los antígenos utilizados en los estudios serológicos para Chagas y Leishmania muestran reactividad cruzada, por lo tanto no es posible diferenciar estas infecciones mediante las técnicas serológicas de uso habitual en el laboratorio clínico. Esta condición puede conducir a errores diagnósticos, distorsión de los datos epidemiológicos y a tratamientos equivocados, especialmente en áreas donde ambas parasitosis coexisten12. Con el objeto de analizar la posible utilización de C. luciliae para diferenciar serológicamente estas parasitosis, se estudiaron por IFI con C. luciliae muestras de 46 pacientes con leishmaniasis, de los cuales 28 estaban coinfectados con T. cruzi. En la Tabla 3 se observa que tanto la leishmaniasis, como única infección, como la coinfección con T. cruzi, se asocian con la imagen conjunta con la excepción de 2 casos de leishmaniasis y 6 de coinfección. Debe notarse que todas estas muestras presentaban reactividad por IFI con L. braziliensis y 3 de las muestras de pacientes coinfectados además eran reactivas por IFI con epimastigotes de T. cruzi. Considerando la existencia de reactividad cruzada entre los tripanosomatídeos, llama la atención esta discordancia no observada para los casos de Chagas analizados en este trabajo ni en los obtenidos por otros investigadores11, 14. Aunque es necesario realizar un estudio con un mayor número de muestras sobre esto en particular, los resultados obtenidos sugieren que existe una diferencia en las reactividades antigénicas entre Leishmania spp o Leishmaniaspp.-T. cruzi y C. luciliae.
     Los resultados presentados en este trabajo indicarían que C. luciliae podría ser un sustrato apto para su uso en el diagnóstico serológico por IFI de la enfermedad de Chagas. De esta manera se evitaría el riesgo que implica la alta infectividad de T. cruzi y la complejidad de su cultivo. Del estudio realizado se desprende que no es posible discriminar por este método entre infección por T. cruzi y Leishmania spp debido a  la reactividad cruzada entre los parásitos.
     Un aporte interesante de este trabajo al laboratorio bioquímico clínico es que cuando se realiza la búsqueda de Ac anti-ADNn mediante el método de IFI con C. luciliae y se encuentra la imagen conjunta característica de membrana y flagelo, es conveniente la realización de estudios clínicos y serológicos para enfermedad de Chagas y leishmaniasis, tanto en pacientes de área endémica como en áreas no endémicas, donde estas enfermedades son sospechadas en menor medida.

Agradecimientos: Este trabajo fue financiado por el subsidio B016 de la Universidad de Buenos Aires.
E.L.M. recibe aportes financieros de la UBA, CONICET y Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica.

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Recibido: 27-12-2004
Aceptado: 9-08-2005