SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.66 número6Tratamiento del cáncer por captura neutrónica de boro: Su aplicación al carcinoma indiferenciado de tiroidesLa vida y la obra de Luis F. Leloir, Premio Nobel 1970 índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Servicios Personalizados

Articulo

Indicadores

  • No hay articulos citadosCitado por SciELO

Links relacionados

  • En proceso de indezaciónCitado por Google
  • No hay articulos similaresSimilares en SciELO
  • En proceso de indezaciónSimilares en Google

Bookmark


Medicina (Buenos Aires)

versión On-line ISSN 1669-9106

Medicina (B. Aires) v.66 n.6 Buenos Aires nov./dic. 2006

 

Células troncales (stem cells) y regeneración cardíaca

María Inés Pérez Millán, Alicia Lorenti

Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental Hospital Italiano de Buenos Aires

Dirección postal: Alicia Lorenti, Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental, Potosí 4240, 1199, Buenos Aires. FAX: (54-11) 4958-2200
E-mail: alicia.lorenti@hospitalitaliano.org.ar

Resumen
Las células troncales carecen de marcadores de diferenciación, tienen gran capacidad proliferativa, pueden automantener la población, producen progenies de células progenitoras y participan en la regeneración de tejidos. Los tejidos de un individuo tienen capacidad de regeneración, que a veces está ligada a la presencia de células troncales. La medicina regenerativa plantea la terapia celular como una alternativa para el tratamiento de diversas enfermedades, incluyendo las cardíacas (cardiomioplastia celular). Las células a usar pueden provenir de distintas fuentes, entre ellas las células troncales de origen cardíaco o extracardíaco. La médula ósea es una de las fuentes más importantes de células troncales extracardíacas, que podrían contribuir a obtener células cardíacas por diversos mecanismos (transdiferenciación, fusión o transferencia a través de estructuras nanotubulares). En los últimos años, diversas publicaciones refieren la existencia de células troncales nativas cardíacas, caracterizadas por la presencia de distintos marcadores. Se plantea también la alternativa del uso de factores de crecimiento para producir la movilización de células troncales. El individuo adulto posee células con alta potencialidad, surgidas en estadios embrionarios antes o después de la determinación en las capas germinales, y mantenidas hasta la adultez que, bajo condiciones apropiadas de manipulación, permita su utlización en la medicina regenerativa.

Palabras clave:Células troncales; Regeneración cardíaca

Abstract
Stem cells and cardiac regeneration. Stem cells are defined by virtue of their functional attributes: absence of  tissue specific differentitated markers, capable of proliferation, able to self-maintain  the population, able to produce a large number of differentiated, functional progeny, able to regenerate the tissue after injury. Cell therapy is an alternative for the treatment of several diseases, like cardiac diseases (cell cardiomyoplasty). A variety of stem cells could be used for cardiac repair: from cardiac and extracardiac sources. Each cell type has its own profile of advantages, limitations, and practicability issues in specific clinical settings. Differentiation of bone marrow stem cells to cardiomyocyte-like cells have been observed under different culture conditions. The presence of resident cardiac stem cell population capable of differentiation into cardiomyocyte or vascular lineage suggests that these cells could be used for cardiac tissue repair, and represent a great promise for clinical application. Stem cells mobilization by cytokines may also offer a strategy for cardiac regeneration.  The use of stem cells (embryonic and adult) may hold the key to replacing cells lost in many devastating diseases. This potential benefit is a major focus for stem cell research.

Key words: Stem cells; Cardiac regeneration

Qué son las células troncales (stem cells)

La biología de las características y el comportamiento de las células troncales ha acaparado buena parte de la atención del ambiente científico en los últimos años. La información relacionada con las células troncales es todavía controvertida, y la primera controversia surge cuando se define qué es una célula troncal1. Una de las mayores dificultades es que su definición está basada en sus características funcionales y no en las morfológicas. A su vez, para probar un atributo funcional es necesario demostrar su existencia, para lo que se requiere la manipulación experimental de las células para el proceso del ensayo, que en sí mismo puede alterar dicha característica. Esto, que parecería un juego de palabras, muestra la necesidad de tener en cuenta que una descripción apropiada de las células exige que el protocolo de manipulación para establecer una determinada característica también deba ser tenido en cuenta a la hora de concluir tal o cual resultado2.
Se pueden definir las células troncales como aquellas que tienen las siguientes características:
1.  Son células que carecen de marcadores de diferenciación específicos.
2.  Tienen la potencialidad de proliferación por tiempos prolongados.
3.  Tienen la capacidad de automantener la población en número relativamente estable, a través del mecanismo de división asimétrica, por el cual cada célula troncal produce al dividirse dos células hijas: una de ellas conserva las características de célula troncal, y la otra célula adquirirá la determinación hacia un linaje.
4.  Producen progenies de células progenitoras, también llamadas transitorias, comprometidas a determinados linajes celulares que, a su vez, son las que darán origen a las células diferenciadas y funcionales de los distintos órganos.
5.  Tienen la capacidad de participar en la regeneración de tejidos en condiciones fisiológicas (homeostasis) y/o después de una injuria.

Clasificación de las células troncales

Las células troncales pueden clasificarse según dos criterios: por su origen y por su potencialidad. Según su origen se las clasifica en células troncales embrionarias, embrionarias germinales y adultas. Las células troncales embrionarias son las que se encuentran en la masa celular interna del blastocisto, que en el ser humano es el estadio de 4-6 días de la embriogénesis. Son las más versátiles y tienen la capacidad de dar origen a todos los tipos celulares de las tres láminas germinales del individuo3.
Las células troncales embrionarias germinales, que se encuentran en la cresta gonadal fetal entre las 5 y 10 semanas de gestación, son las que darán origen a las gametas maduras.
Las células troncales adultas son las que se encuentran en los órganos y tejidos del individuo adulto, y son las que darán origen a los diversos tipos celulares especializados del tejido del cual provienen4.
Según su potencialidad, las células troncales pueden clasificarse como totipotenciales, pluripotenciales, multipotenciales, oligopotenciales, bipotenciales, monopotenciales. En este orden jerárquico cada estadio celular produce progenies que, por un lado se renuevan a sí mismas, y por el otro producen células que adquieren cada vez más marcadores de diferenciación, al mismo tiempo que gradualmente pierden su potencial proliferativo. Así, las células troncales totipotenciales tienen potencial ilimitado, dando origen a todos los tejidos embrionarios y extraembrionarios, y se las encuentra en el estadio de cigoto. Las células troncales embrionarias son pluripotenciales y capaces de dar origen a los tejidos de las tres láminas germinales: endodermo, mesodermo y ectodermo. Las células troncales adultas varían en su potencialidad, desde multipotenciales hasta monopotenciales5.
Sin embargo, algunos autores consideran que la dirección de este flujo de potencialidad (desde totipotencial hacia monopotencial), que hasta hace poco tiempo se consideraba irreversible, es reversible, puesto que aseguran que algunas células troncales adultas tienen la capacidad de volver a adquirir características de células pluripotenciales, aunque sin llegar a la totipotencialidad6. Esto involucra saltos, no sólo de linajes celulares sino también de lámina germinal, y se mencionará más adelante.
Históricamente, los estudios sobre células troncales comenzaron sobre tejidos cuyo recambio fisiológico es permanente, como la piel, la sangre, la médula ósea o el epitelio del intestino7. En cambio, en otros tejidos la presencia de células nuevas es muy escasa en condiciones fisiológicas, pero ocurre como respuesta a la demanda de crecimiento o reparación, como es el caso del hígado o del músculo esquelético. En los últimos años se hallaron células troncales en casi todos los órganos del individuo adulto: piel8, 9, hígado10, 11, páncreas12, sangre y médula ósea13, riñón14, 15, intestino7, vasos16, sistema nervioso central17, 18, músculo esquelético19, corazón20, entre otros.

Regeneración de tejidos

Los tejidos de un individuo adulto tienen cierta capacidad de regeneración después de una injuria, y esta propiedad es característica de cada tejido. Algunos de los mecanismos de regeneración están ligados a las células troncales o directamente producidos por ellas. Es así como, por ejemplo, el hígado tiene dos niveles de regeneración como respuesta a una injuria. Luego de un daño leve o moderado, los hepatocitos maduros son capaces de salir de la quiescencia, reingresar en el ciclo celular y proliferar. Los otros tipos celulares que conforman el tejido hepático adulto, como las células epiteliales ductales biliares y las endoteliales, comienzan también a proliferar, produciendo la regeneración completa del tejido dañado21. Este mecanismo no está asociado a las células troncales hepáticas. Distinta es la regeneración que ocurre como respuesta a un daño masivo del hígado. En este caso las células maduras no son suficientes para reparar el daño, por lo cual se produce una activación del compartimiento de células troncales hepáticas, ubicado en el canal de Hering, que proliferan produciendo una población de células conocidas como células ovales que se dividen hasta reparar el daño10, 11, 22.
Otro ejemplo de regeneración distinto al mencionado del hígado, es el del músculo esquelético, donde las células satélite23, consideradas las células troncales del músculo esquelético, ubicadas entre la lámina basal y la membrana plasmática de las fibras musculares, que son también células quiescentes, reciben un estímulo de proliferación como respuesta a un daño, y desarrollan en miocitos maduros reparando la zona injuriada24.
Estos mecanismos de regeneración del músculo esquelético no son los del tejido cardíaco adulto, los miocitos cardíacos adultos no tendrían la capacidad de reingresar en el ciclo celular como respuesta a una injuria. Hasta ahora se consideró que el corazón sería un órgano posmitótico: los cardiomiocitos sólo conservarían la capacidad de multiplicarse hasta los tres o cuatro meses de edad posnatal, con lo cual a poco del nacimiento ya existiría un número de cardiomiocitos que no podrían ser reemplazados, con lo cual su cantidad decrecería gradualmente. Sin embargo, existen publicaciones que señalan que existe un equilibrio entre los estímulos para el crecimiento del tamaño de los miocitos y los que llevan a la necrosis y apoptosis25. Los datos experimentales en ratones implican la posibilidad de que exista un recambio fisiológico activo; si no existiese este reemplazo, la pérdida de la masa celular se haría incompatible con la vida de un individuo adulto. Este concepto es una nueva visión sobre la regeneración fisiológica y el envejecimiento cardíaco26, 27.
Distinto enfoque merecen los procesos patológicos del corazón. En el caso de las enfermedades isquémicas se produce en el tejido cardíaco un marcado desequilibrio entre el aporte y la demanda de sangre oxigenada, con insuficiencia de oxígeno (hipoxia, anoxia), disminución de la disponibilidad de nutrientes e inadecuada eliminación de metabolitos, cuyo resultado es la necrosis coagulativa de todos los tipos celulares presentes en el músculo cardíaco de la zona afectada. En la segunda fase comienza el proceso exudativo, con liberación de mediadores de la inflamación. Comienza entonces la etapa del remodelamiento, con la activación de enzimas proteolíticas, las metaloproteinasas, y también la activación de mRNAs de factores de crecimiento y citoquinas, que en su conjunto producen alteraciones en los tipos y características de las proteínas de la matriz extracelular, la división de determinados tipos celulares, básicamente fibroblastos, y como consecuencia de ello la producción de una fibrosis cicatrizal28, 29.
En contraste con el dogma de la ausencia de división celular en los cardiomiocitos adultos, en el año 2001 Beltrami y colaboradores informan haber hallado indicios de mitosis en zonas cercanas a un área infartada30. Sin embargo, el índice mitótico que se menciona en esa publicación (0.08% en zonas adyacentes al infarto y 0.03% en zonas remotas) no parecería ser lo suficientemente alto como para que participe en la regeneración tisular después de un daño cardíaco importante31. A pesar de ello, no puede descartarse que el concepto de la incapacidad regenerativa del miocardio pueda ser revisado en el futuro.

Ingeniería de tejidos y medicina regenerativa

La ingeniería de tejidos es una nueva disciplina que se nutre de los conocimientos de la biología, la química, la medicina, la ciencia de los materiales y otras, y cuyo objetivo es el manejo de células y materiales biocompatibles, para lograr sustitutos que sean capaces de restaurar una función tisular alterada o perdida como consecuencia de una injuria.
En el comienzo, la ingeniería de tejidos debe elegir cuál es el tipo de células que se deben usar. El conocimiento de las señales que median la proliferación celular, la diferenciación, o la adhesión a un sustrato, proporcionan las bases de la regeneración tisular. Existen componentes críticos de dichos procesos, como son las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular. Estas interacciones son llevadas a cabo a través de receptores específicos que responden a eventos de señalización, que guían la regeneración tisular32, 33.
La medicina regenerativa, surgida a partir de la ingeniería de tejidos, plantea la terapia celular como una valiosa alternativa para el tratamiento de diversas enfermedades34-38.
El trasplante celular en tejido cardíaco, conocido como cardiomioplastia celular, se ha ensayado para el tratamiento de afecciones cardíacas, y ha sido planteada para enfermedades isquémicas y no isquémicas39. En el primer caso tiene como objetivo repoblar la cicatriz de la necrosis y las zonas circundantes con células potencialmente contráctiles, injertadas en número suficiente como para sustituir a los cardiomiocitos muertos y restaurar la función de estas áreas acinéticas40, para mejorar la función ventricular sistólica y diastólica y restaurar la contractilidad.
Una de las cuestiones más importantes está relacionada con el tipo celular más apropiado para la regeneración miocárdica. Las células pueden provenir de distintas fuentes y ser manipuladas de distintas formas41. El perfeccionamiento de las técnicas de aislamiento y cultivo de células, permite contar con distintos tipos de células: a) células primarias diferenciadas; b) células inmortalizadas; c) células troncales (stem).
Las células primarias diferenciadas (a) provienen de fragmentos de tejidos de origen autólogo, homólogo e incluso heterólogo. Las células son disgregadas y usadas frescas o previamente cultivadas y expandidas42-45.
El uso de líneas celulares inmortalizadas (b), tiene como ventaja la ilimitada disponibilidad de células altamente proliferativas y como gran desventaja que su potencial tumorigénico no puede ser descartado completamente. Las líneas celulares se obtienen a partir de células normales, que han sufrido cambios genéticos por diversos mecanismos, adquiriendo potencial de crecimiento ilimitado46.
Por último, las células troncales (c) son células no especializadas, capaces de automantener su población y al mismo tiempo proveer células progenitoras que podrían madurar en células cardíacas adultas funcionales. De los tipos posibles de células troncales, las provenientes de tejidos adultos ofrecen la ventaja de no estar asociadas a problemas éticos difíciles de resolver, como ocurre con las embrionarias.

Plasticidad y transdiferenciación de las células troncales adultas

Un concepto basal de la biología del desarrollo es que, durante la embriogénesis, todas las células son comprometidas hacia linajes específicos, en primer lugar a través de la especificación de la lámina germinal, y posteriormente hacia niveles adicionales de diferenciación y especialización. No hay acuerdo acerca de cuál es el origen de las células troncales adultas. Algunos consideran que las células troncales adultas derivarían de las células troncales embrionarias cuando ya están comprometidas a generar linajes específicos, o antes. En los últimos años, diversas publicaciones han sugerido que las células somáticas adultas no estarían restringidas sólo a producir células específicas del tejido de origen, sino que serían capaces de originar un espectro mucho más amplio de diferenciación, exhibiendo un fenómeno llamado plasticidad47.
No hay un acuerdo acerca de la definición de plasticidad. Podría definirse como la capacidad de las células troncales de producir linajes celulares distintos al de ellas mismas, pero de la misma lámina germinal. En cambio, cuando una célula troncal es capaz de producir linajes de células de láminas germinales a las que no pertenece se habla de transdiferenciación48. La transdiferenciación sería así un subtipo de plasticidad. Por ejemplo, células sanguíneas y de músculo liso a partir de células troncales neurales adultas49, 50, células mesenquimales de médula ósea adulta capaces de diferenciar en células epiteliales hepáticas, pulmonares e intestinales51, células hemopoyéticas que diferencian en hepatocitos52, células de tejido adiposo como fuente de células mesodérmicas y neuronales53.
Las células troncales adultas de médula ósea, cuya potencialidad pareciera indefinida, se han considerado en los últimos tiempos como las candidatas ideales para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades no hematológicas54-56. Son células multipotenciales y tendrían una insospechada capacidad de regenerar distintos tipos de tejidos. Insertas en un microambiente diferente al propio, su plasticidad les permitiría adoptar fenotipos diferentes, transdiferenciando en células características de su nuevo tejido de residencia51.

Células troncales cardíacas nativas

Hasta hace poco tiempo el dogma aceptado en la biología cardíaca era que el corazón adulto era un órgano terminalmente diferenciado, sin potencial de regeneración ni en condiciones fisiológicas ni patológicas, dado que sus células son terminalmente diferenciadas. Este concepto podría cambiar si existieran evidencias de células troncales residentes en el corazón o de origen extracardíaco capaces de participar en la reparación cardíaca en el individuo adulto. Se mencionan a continuación evidencias de la existencia de estos tipos celulares.

Células troncales cardíacas de origen extracardíaco

Diversos tejidos pueden ser fuentes de células capaces de diferenciarse en células troncales cardíacas. Varias poblaciones de médula ósea y tejido adiposo contendrían subpoblaciones celulares que migrarían al miocardio infartado, se establecerían allí y darían lugar a los distintos tipos celulares cardíacos53, 57-64.
Se considera que las células troncales de médula ósea tienen la capacidad de comportarse como células itinerantes, que responden a señales de inflamación provenientes del corazón infartado, dirigiéndose hacia la zona dañada y diferenciando en los tipos celulares necesarios para la reparación miocárdica. Se estima que algún tipo de injuria o inflamación es el requisito indispensable para que se produzca la migración de las células itinerantes, se establezcan en el sitio de la injuria (homing) y finalmente participen en la estructura y función como tejido diferenciado65. El microambiente es el estímulo para el anclaje y la diferenciación de las células troncales de los linajes apropiados, dado que provee los quimioatractantes y el espacio para el contacto célula-célula66.
En 2001, Orlic y colaboradores60 publicaron un trabajo que revolucionó el concepto de tratamiento de las enfermedades cardíacas. Utilizaron una subpoblación de células troncales de médula ósea totalmente indiferenciadas para la regeneración del músculo cardíaco tras un infarto de miocardio, en un modelo animal en ratones transgénicos. Estas células tenían la capacidad de producir tipos celulares de diversos linajes, y fueron caracterizadas como Lin (células no comprometidas a ningún linaje) y c-kit+ (c-kit es el receptor del ligando "stem cell factor"). Al ser implantadas en la zona ventricular peri-infarto transdiferenciaron en los tres tipos celulares del corazón: cardiomiocitos, células endoteliales y músculo liso, generando miocardio de novo, incluyendo arterias coronarias, arteriolas y capilares. A pocos días del implante, observaron que el 68% de la parte dañada del ventrículo estaba poblada por las células trasplantadas y mejoría de la función contráctil. Concluyeron que la reparación parcial del músculo dañado del corazón se produjo a partir de las células trasplantadas en el miocardio de los animales infartados, gracias a señales presentes en el medio ambiente de la lesión, que promoverían la migración, proliferación y diferenciación celular dentro del área necrótica de la pared ventricular. Esta subpoblación fue usada también en otros trabajos, y fueron consideradas células troncales cardíacas67.
En otro estudio se demostró también la regeneración del músculo cardíaco infartado mediante el implante de células troncales adultas de médula ósea en un modelo en ratón transgénico68. En este caso se purificó una subpoblación de células troncales hematopoyéticas caracterizada por los marcadores CD34-/bajo, c-kit+, Sca-1+, siendo estos dos últimos antígenos de superficie relacionados a células troncales, que fueron inyectadas en animales letalmente irradiados antes del trasplante. A las 10 semanas del trasplante se indujo en los animales una injuria cardíaca por oclusión de la arteria coronaria y posterior reperfusión. Los autores demostraron que las células trasplantadas migraron al miocardio sólo en los animales sometidos a isquemia, y allí se diferenciaron en cardiomiocitos y células endoteliales, contribuyendo así a la formación de tejido funcional. Otros autores han mencionado también la regeneración cardíaca mediante una población de células no hemopoyéticas derivadas de la médula ósea69.
No existen aún datos sobre la supervivencia a largo plazo de las células trasplantadas, ni está demostrado que las mismas se acoplen mecánica y eléctricamente con las células receptoras y que propaguen adecuadamente el impulso44, aun cuando algunos ensayos clínicos realizados en humanos, con implante de estas células, mostrarían un grado de reparación del tejido infartado, a través de una mejoría de la función ventricular y de la vascularización45, 70, 71. Wollert y colaboradores informan una mejoría de la función sistólica posterior a la transferencia intracoronaria de células de médula ósea autóloga en pacientes con infarto aguda de miocardio72. Sin embargo, otros ensayos clínicos demuestran la ausencia de efectos beneficiosos del trasplante de células de médula ósea en pacientes similares73.
Otras células que resultan particularmente atractivas por su potencial de diferenciación a células cardíacas son las células troncales embrionarias, que tendrían la capacidad de interactuar electromecánicamente con las células cardíacas del huésped para formar un sincicio funcional. Estas células podrían ser comprometidas parcialmente hacia linajes cardíacos antes del implante, para luego alcanzar la maduración completa in vivo bajo la influencia de caminos de señalización parácrinos asociados al huésped74. En otros trabajos se menciona también el uso de células troncales embrionarias para el tratamiento de enfermedades cardíacas. Estas células, comprometidas a diferenciación a linajes cardíacos, fueron implantadas en miocardios infartados de ovejas inmunosuprimidas e inmunocompetentes, y diferenciaron en cardiomiocitos maduros, que expresaban conexinas y produjeron un beneficio funcional en el miocardio dañado75.

¿Transdiferenciación o fusión?

Poco tiempo después de la publicación del trabajo de Orlic comenzaron a aparecer discrepancias con sus resultados. Dos grupos de trabajo intentaron reproducir esos experimentos con resultados muy diferentes76, 77. Según los autores, la misma subpoblación de células provenientes de médula ósea permaneció sólo pocos días en la zona implantada, y nunca expresaron marcadores específicos de tejido cardíaco. No sólo no fueron encontradas evidencias de regeneración miocárdica, sino que se observó que las células troncales hematopoyéticas adoptaban su primitivo destino hematopoyético aun cuando se implantaban en el corazón. 
Los cuestionamientos a la transdiferenciación de células troncales se hicieron aun más profundos cuando algunos autores establecieron que estas células adoptaban características funcionales de otros linajes, no por transdiferenciación sino a través de la adquisición de determinantes específicos de linaje por medio de la fusión celular, que consiste en la formación de genomas poliploides entre células donantes y receptoras77-82.
Sobre la base de resultados de experimentos de recombinación para detectar fusión celular in vitro, se demostró que células derivadas de médula ósea se fusionaban espontáneamente con las células nativas del tejido huésped, formándose en todos los casos células multinucleadas81. Estas células surgidas por fusión son altamente inestables y tendrían un tiempo de vida reducido.
Las controversias no terminaron allí. Luego de que la transdiferenciación fuera refutada aduciendo que lo que verdaderamente ocurría era fusión celular, volvieron a aparecer trabajos demostrando que la transdiferenciación era una verdadera característica de las células troncales, independiente de la fusión celular82.
Un problema asociado con el uso de células de médula ósea es el que ellas pueden diferenciarse en tipos celulares no deseados, como fibroblastos, que al ser implantadas en una cicatriz fibrótica, se corre el riesgo de generar una cicatriz dentro de otra cicatriz45. Esto, además, contribuiría a una incompleta integración de las células troncales dentro del miocardio, lo cual aumentaría el riesgo de arritmias ventriculares83. Hasta el momento no existen publicaciones que muestren la formación de tumores en humanos, ni diferenciación ectópica, tal como formación de hueso.
La utilización de células de médula ósea no termina sólo con la búsqueda de células musculares cardíacas. Otro tipo de células troncales obtenida de médula ósea e incluso de sangre periférica es la formada por las células CD133+84-86, que pueden diferenciar en células endoteliales maduras y contribuirían a la neovascularización. Están caracterizadas por los marcadores de superficie CD133, CD34 y el receptor de VEGF. Estas células pierden gradualmente sus propiedades de células progenitoras y migran a la circulación sistémica, expresando marcadores de células endoteliales maduras, como ser VE-cadherina, óxido nítrico sintasa endotelial y el factor de Von Willebrand87, y serían útiles como estrategia para obtener angiogénesis, por su capacidad natural de ser incorporadas en los focos de neovascularización y segregar potentes ligandos angiogénicos y citoquinas88, 89.
Trabajos recientes han sugerido también que existen células endoteliales progenitoras originadas a partir de médula ósea y del endotelio vascular90, que circulan por la sangre periférica, incrementando su movilización después de un infarto y produciendo aumento de la neovascularización y mejoría de la función ventricular91.

Transferencia a través de nanotubos

Se discutieron ya los mecanismos de transdiferenciación y fusión, que hacen que células de un determinado linaje se reprogramen adoptando características de otro tipo celular y se comporten como tales en un nuevo ambiente físico. A esos mecanismos se agrega un nuevo mecanismo basado en la transferencia de material de una célula a otra por nanotubos a través de los cuales se transferiría dicho material92. Los nanotubos son estructuras intercelulares que se observan entre pares de células vecinas y también entre redes celulares. Una publicación reciente refiere que cuando se cocultivaron células progenitoras endoteliales humanas con miocitos cardíacos de rata, se observaron nanotubos con un diámetro de 50 a 800 nm y un largo de 5 a 120 µm. A través de esos nanotubos se producía el trasporte e intercambio de proteínas y organelas celulares, como mitocondrias, entre los dos tipos celulares. Estas estructuras fueron transitorias y contribuirían a la adquisición, por parte de una determinada célula, de características fenotípicas de otra93.

Células troncales (stem) cardíacas nativas

En los últimos años surgieron evidencias de que el corazón puede contener una población nativa de células progenitoras con potencial cardiomiogénico. Beltrami y colaboradores aislaron una subpoblación de células Lin ckit+ a partir de corazones de rata adulta, que tanto in vitro como in vivo exhibían propiedades de células troncales cardíacas o bien su progenie inmediata67. Son células altamente proliferativas y multipotenciales, capaces de autorrenovación, que pueden diferenciarse a cardiomiocitos, células de músculo liso y endoteliales. Si bien estas células no presentaban contracción espontánea en el cultivo, al ser implantadas en el miocardio infartado lograron la regeneración funcional del músculo cardíaco. Dawn y colaboradores informaron que estas mismas células, administradas intracoronariamente, atravesaban la barrera vascular y mejoraban la función ventricular después de un infarto en ratas94.
Otros autores95 aislaron una subpoblación de células Sca-1+ con alta actividad de telomerasa, a partir de corazón de ratón adulto. Inmediatamente después del aislamiento, estas células no expresaban ningún marcador de genes estructurales cardíacos, ni de progenitores endoteliales o hemopoyéticos, pero sufrían diferenciación in vitro como respuesta al tratamiento con 5´-azacitidina, un agente demetilante análogo de citosina. Estas células, inyectadas en un miocardio infartado, se alojaban y establecían en él, mostrando marcadores de diferenciación cardíaca y también fusión con células huésped.
Messina y colaboradores obtuvieron células indiferenciadas a partir de aurícula y ventrículo de corazón humano, con características de células troncales cardíacas, que desarrollaron in vitro formando agregados celulares en suspensión. Las cardioesferas contenían una mezcla de células troncales, células progenitoras con distintos grados de diferenciación, cardiomiocitos y células vasculares ya diferenciadas, y fueron capaces de producir los principales tipos celulares especializados del corazón, tanto in vitro como in vivo después de ser implantadas en el miocardio lesionado96.
A principios del año 2005 se publicó un trabajo que demostró la existencia de células troncales cardíacas residentes en el corazón, con capacidad de dividirse, automantenerse y diferenciar a células musculares cardíacas adultas, agrupadas en ambas aurículas de corazón pos-natal de rata, ratón y humano. Se identificaron por la expresión del factor de transcripción isl-1. Los autores las consideraron células remanentes de una población de células troncales cardíacas del corazón embrionario y fetal en desarrollo, y su número disminuye con la edad. Representan auténticas células troncales cardíacas endógenas, mostrando una conversión altamente eficiente a fenotipo cardíaco maduro, con expresión estable de marcadores miocíticos97.
En el mismo año se hallaron células troncales cardíacas nativas con capacidad de regular la homeostasis fisiológica del órgano y de regeneración después de un infarto. Es un trabajo experimental en perros, y las células fueron caracterizadas como Lin y Sca-1+ o c-kit+ o estos dos últimos en conjunto, y carecían de marcadores de células hemopoyéticas, musculares esqueléticas o cardíacas. Los autores plantean que existe en el corazón un compartimiento de células troncales que pueden ser activadas y reclutadas por la acción de factores de crecimiento como HGF o IGF. Después de un infarto, la inyección intramiocárdica de esos factores de crecimiento estimuló a las células troncales residentes cardíacas, produciendo nuevos vasos coronarios y miocitos que expresaban proteínas nucleares y citoplasmáticas específicas de cardiomiocitos. A su vez, esto se tradujo en una mejoría de la capacidad contráctil de la pared. Según los autores, el uso de factores de crecimiento sería factible como terapéutica de reparación cardíaca por su acción como estimuladores de la movilización de las células troncales cardíacas98.
En este sentido, el uso del factor estimulante de colonias granulocíticas (G-CSF) para la movilización de células troncales ha sido ya probado en investigación clínica, en pacientes con infarto. Si bien los autores destacan una recuperación en la fracción de eyección del ventrículo izquierdo en los pacientes tratados, no es posible aún sacar conclusiones definitivas acerca de las ventajas de esta terapéutica99.  
Es de destacar que todas las células troncales aisladas de corazón mencionadas comparten los marcadores con distintas subpoblaciones de la médula ósea (Lin, ckit+, Sca+). No así el trabajo de Laugwitz ya mencionado, en el cual las células aisladas fueron identificadas por un marcador que no existe en ningún tipo celular proveniente de médula ósea (Isl-1+). Si las células troncales cardíacas son generadas en el miocardio o migran desde la médula ósea después de un daño cardíaco, repoblando el tejido, es un problema no resuelto20.

Desafíos y promesas de las células troncales

Desde que Prometeo fue castigado por los dioses y su hígado devorado y renovado rápidamente, la humanidad busca la capacidad regenerativa que permita la reconstrucción de órganos dañados por distintas circunstancias. El hígado tiene una capacidad regenerativa incomparable respecto de los otros órganos del ser humano. Qué es lo que determina ese potencial en ese órgano y es tan diferente en otros, como por ejemplo el corazón. La muerte de las células musculares cardíacas, sin la consiguiente generación de nuevas células, es la base de las enfermedades cardíacas, tanto agudas como crónicas.
Las células troncales pueden ser obtenidas a partir de diversos tejidos, aun de aquellos que históricamente fueron considerados absolutamente incapaces de regeneración, como el sistema nervioso o el corazón. El individuo adulto posee células multi y aun pluripotentes probablemente surgidas en estadios embrionarios antes o después de la determinación en las capas germinales, y mantenidas hasta la adultez. Quizás este recurso, que tantos interrogantes plantea todavía, le permitirá al hombre contar con una reserva de células con alta potencialidad que, bajo apropiadas condiciones de manipulación, permita su utilización en la medicina regenerativa, que quizás sea la medicina del futuro.

Bibliografía

1. McCulloch EA, Till JE. Perspectives on the properties of stem cells. Nature Medicine 2005; 11: 1026-8.
2. Loeffler M, Potten CS. Stem cells and cellular pedigree - a conceptual introduction. In: Stem Cells. CS Potten (eds). London: Academic press 1997, p1-27.
3. Maltsev VA, Rohwedel J, Hescheler J, Wobus AM. Embryonic stem cells differentiate in vitro into cardio-myocytes representing sinusnodal, atrial and ventricular cell types. Mech Dev 1993; 44: 41-50.
4. Stem cells: Scientific Progress and future research directions. Department of health and human services. 2001; pp ES1-ES10. En: http://www.nih.gov/news/stemcell/ scirepor.htm.
5. Prosper F, Verfaillie C. Células madre adultas. An Sist Sanit Navar 2003; 26: 345-56.
6. Zipori D. The stem state: plasticity is essential, whereas self-renewal and hierarchy are optional. Stem Cells 2005; 23: 719-26.
7. Bach SP, Renehan AG, Potten CS. Stem cells: the intestinal stem cells as a paradigm. Carcinogenesis 2000; 21: 469-76.
8. Blanpain C, Lowry W, Geoghegan A, Polak L, Fuchs E. Self-renewal, multupotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell 2004; 118: 635-48.
9. Webb A, Li A, Kaur P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation 2004; 72: 387-95.
10. Faris RA, Konkin T, Halpert G. Liver stem cells: a potential source of hepatocytes for the treatment of human liver disease. Artificial Organs 2001: 25: 513-21.
11. Lorenti A. Células progenitoras hepáticas. Medicina (Buenos Aires) 2001; 61: 614-20.
12. Bouwens L, Rooman I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 2005; 85: 1255-70.
13. Weissman IL. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell 2000; 100: 157-68.
14. Haller H, de Groot K, Bahlmann F, Elger M, Fliser D. Stem cells and progenitor cells in renal disease. Kidney International 2005; 68: 1932-6.
15. Kitamura S, Yamasaki Y, Makino H. Establishment of renal stem/progenitor-like cell line from S3 segment of proximal tubules in adult rat kidney. Kidney International 2005; 68: 1966.
16. Rosenzweig A. Circulating endothelial progenitors-cells as biomarkers. NEJM 2005; 353: 1055-7.
17. Gage FH, Ray J, Fisher LJ. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu Rev Neurosci 1995; 18: 159-92.
18. Clarke DL, Johansson CB, Wilbertz J, et al. Generalized potential of adult neural stem cells. Science 2000; 288: 1660-3.
19. Zammit P, Beauchamp J. The skeletal muscle satellite cell: stem cell or son of stem cell. Differentiation 2001; 68: 193-204.
20. Urbanek K, Torella D, Sheikh F, et al. Myocardial regeneration by activation of multipotent cardiac stem cells in ischemic heart failure. PNAS 2005; 102: 8692-7.
21. Michalopoulos GK, De Frances MC. Liver regeneration. Science 1997; 276: 60-6.
22. Fausto. Liver regeneration. Journal of Hepatology 2000; 32 (Suppl 1): 19-31.
23. Mauro A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol 1961;9: 493-7.
24. Alameddine HS, Louboutin JP, Dehaupas M, Sebille A, Fardeau M. Functional recovery induced by satellite cell grafts in irreversibly injured muscles. Cell Transplantation 1994; 3: 3-14.
25. Anversa P, Kajstura J. Ventricular myocytes are not terminally differentiated in the adult mammalian heart. Circ Res. 1998; 83: 1-14.
26. Anversa P, Rota M, Urbanek K, et al. Myocardial aging. A stem cell problem. Basic Res Cardiol. 2005; 100:  482-93.
27. Leri A, Kajstura J, Anversa P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 2005; 85: 1373-416.
28. Morgan JP. Cellular physiology of myocyte contraction. In: Heart Failure. Poole-Wilson P, Colucci W, Massie B, Chaterjee K, Coats A (eds). Churchill Livingston Inc. 1997, p 1-11. 
29. Schoen F. El corazón. En: Patología Estructural y Funcional. SL Robbins, RS Cotran (eds). Nueva Editorial Interamericana. 5° Edición, 1995, pp: 573-89.
30. Beltrami A, Urbanek K, Kajstura J, et al. Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction. NEJM 2001; 344: 1750-7.
31. Mathur A, Martin JF. Stem cells and repair of the heart. The Lancet 2004; 364: 183-92.
32. Ross J. Cell-extracellular matrix interactions. En: Frontiers in Tissue Engineering. CW Patrick, A Mikos, L McIntire (eds). Elsevier Science Ltd. UK 1998, p 15-27.
33. Bock-Marquette I, Saxena A, White M, DiMalo J, Srivastava D. Thymosin b4 activates integrin-linked kinase and promotes cardiac cell migration, survival and cardiac repair. Nature 2004; 432: 466-72.
34. Kadiyala S, Young RG, Thiede MA, Bruder SP. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. Cell Transplantation 1997; 6: 125-34.
35. Strom S, Chowdhury JR, Fox IY. Hepatocyte transplantation for the treatment of human disease. Seminars in Liver Disease 1999; 19: 39-48.
36. Nadal-Ginard B. Inducción de nuevos cardiomiocitos en el corazón adulto: futuro de la regeneración miocárdica como alternativa al trasplante. Rev Esp Cardiol 2001; 54: 543-50.
37. Kubo K, Kuroyanagi Y. Development of a cultured dermal substitute composed of a spongy matrix of hyaluronic acid and atelo-collagen combined with fibroblasts: crypreservation. Artificial Organs 2004; 28: 182-8.
38. Kim WS, Vacanti JP, Cima L, et al. Cartilage engineered in predetermined shapes employing cell transplantation on synthetic biodegradable polymers. Plast Reconstr Surg 1994; 94: 233-40.
39. Pouly J, Hagege AA, Vilquin JT, et al. Does the functional efficacy of skeletal myoblast transplantation extend to nonischemic cardiomyopathy?. Circulation 2004; 110: 1626-31.
40. Menasché P, Desnos M. Cardiac reparation: fixing the heart with cells, new vessels and genes. Eur Heart J 2002; 4: 73-4.
41. Dimmeler S, Zeiher AM. Wanted! The best cell for cardiac regeneration. J Am Coll Cardiol. 2004; 44: 464-6.
42. Atkins B, Hueman M, Meuchel J, Cottman M, Hutcheson K, Taylor D. Myogenic cell transplantation improves in vivo regional performance in infarctes rabbit myocardium. J Heart Lung Transplant. 1999; 18: 1173-80.
43. Menasché P, Hagège A, Scorsin M, et al. Myoblast transplantation for heart failure. The Lancet 2001; 357: 279-80.
44. Hassink RJ, Brutel de la Rivière A, Mummery CL, Doevendans P. Transplantation of cells for cardiac repair. J Am Coll Cardiol 2003; 41: 711-8.
45. Chachques J, Acar C, Herreros J, et al. Cellular Cardiomyoplasty: Clinical Application. Ann Thorac Surg 2004; 77: 1121-30.
46. Caviedes R, Liberona J, Hidalgo J, Tascon S, Salas K, Jaimovich E. A human skeletal cell line obtained from an adult donor. Biochimica et Biophysica Acta 1992; 1134: 247-55.
47. Camargo FD, Chambers SM, Goodell MA. Stem cell plasticity: from transdifferentiation to macrophage fusion. Cell Prolif 2004; 37: 55-65.
48. Sell S. Stem cell origin of cancer and differentiation therapy. Critical Reviews in Oncology/hematology 2004; 51: 1-28.
49. Bjornson C, Rietze R, Reynolds B, Magli C, Vescovi A. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. Science 1999; 283: 534-7.
50. Donovan PJ, Gearhart J. The end of the beginning for pluripotent stem cells. Nature 2001; 414: 92-7.
51. Jiang Y, Jahagirdar B, Reinhardts L, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 2002; 418: 41-9.
52. Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M, et al. Purified Hematopoietic Stem Cells Can Differentiate Into Hepatocytes In Vivo. Nature Medicine 2000; 6: 1229-34.
53. Zuk P, Zhu M, Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell 2002; 13: 4279-95.
54. Orlic D, Hill J, Arai A. Stem cells for myocardial regeneration. Circ Res 2002; 91: 1092-102.
55. Orlic D. The strength of plasticity: stem cells for cardiac repair. Int J Cardiol 2004; 95 Suppl 1: S16-9.
56. Zhang Y, Bai XF, Huang CX. Hepatic stem cells: existence and origin. World J Gastroenterol 2003; 9: 201-4.
57. Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, Gehron Robey P. Bone marrow stromal cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells 2001; 19: 180-92.
58. Fukuda K. Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchymal stem cells for cardiovascular tissue engineering. Artificial Organs 2001; 25: 187-93.
59. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. PNAS 2001; 98: 10344-49.
60. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 2001; 410: 701-5.
61. Zuk P, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based the-rapies. Tissue Engineering 2001; 7: 211-28.
62. Tomita S. Cell-based therapy to regenerate myocardium: from bench to bedside. Artificial Organs 2004; 28: 40-4.
63. Lu L, Zhang J, Ramires F, Sun Y. Molecular and cellular events at the site of myocardial infarction: from the perspective of rebuilding myocardial tissue. Biochemical and Biophysical Research Communication 2004; 320: 907-13.
64. Rezai N, Podor T, McManus B. Bone marrow cells in the repair and modulation of heart and blood vessels: emerging opportunities in native and engineered tissue and biomechanical materials. Artificial Organs 2004; 28: 142-51.
65. Rosenthal N. Prometheus´s vulture and the stem-cell promise. NEJM 2003; 349: 267-74.
66. Perin E, Geng Y, Willerson J. Adult stem cell therapy in perspective. Circulation 2003; 107: 935-8.
67. Beltrami A, Barlucchi L, Torella D, et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial re-generation. Cell 2003; 114: 763-76.
68. Jackson K, Majka S, Wang H, et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest 2001; 107: 1395-402.
69. Yoon YS, Wecker A, Heyd L, et al. Clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow regenerate myocardium after myocardial infarction. J Clin Invest 2005; 115: 326-38.
70. Hamano K, Nishida M, Hirata K, et al. Local implantation of autologous bone marrow cells for therapeutic angiogenesis in patients with ischemic heart disease: clinical trial and preliminary results. Jpn Circ J 2001; 65: 845-7.
71. Assmus B, Schächinger V, Teupe C, et al. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI). Circulation 2002; 106: 3009-17.
72. Wollert KC, Meyer GP, Lotz J, et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. The Lancet 2004; 364: 141-8.
73. Cleland JG, Freemantle N, Coletta AP, Clark AL. Clinical trials update from the American Heart Association: REPAIRAMI, ASTAMI, JELIS, MEGA, REVIVE-II, SUR-VIVE, and PROACTIVE. Eur J Heart Fail 2006; 8: 105-10.
74. Menasche P. The potential of embryonic stem cells to treat heart disease. Curr Opin Mol Ther 2005; 7: 293-9.
75. Menard C, Hagege AA, Agbulut O, et al. Transplantation of cardiac-committed mouse embryonic stem cells to infarcted sheep myocardium: a preclinical study. The Lancet 2005; 366: 1005-12.
76. Balsam L, Wagers A, Christensen J, Kofidis T, Weissman I, Robbins R. Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemic myocardium. Nature 2004; 428: 668-73.
77. Murry CE, Soonpaa M, Reinecke H, et al. Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature 2004; 428: 664-8.
78. Terada N, Hamazaki T, Oka M, et al. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. Nature 2002; 416: 542-5.
79. Ying QL, Nichols J, Evans EP, Smith AG. Changing potency by spontaneous fusion. Nature 2002; 416: 545-8.
80. Wang X, Willenbring H, Akkari Y, et al. Cell fusion is the principal source of bone-marrow-derived hepatocytes. Nature 2003; 422: 897-901.
81. Alvarez-Dolado M, Pardal R, Garcia-Verdugo J, et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature 2003; 425: 968-73.
82. Wurmser AE, Nakashima K, Summers RG, et al. Cell fusion-independent differentiation of neural stem cells to the endothelial lineage. Nature 2004; 430: 350-6.
83. Lee M, Lill M, Makkar R. Stem Cell Transplantation in Myocardial Infarction. Rev Cardiovasc Med 2004; 5: 82-98.
84. Amrani DL, Port S. Cardiovascular disease: potential impact of stem cell therapy. Expert Rev Cardiovasc Ther 2003; 1: 453-61.
85. Stamm C, Westphal B, Kleine HD, et al. Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration. The Lancet 2003; 361: 45-6.
86. Agbulut O, Vandervelde S, Al Attar N, et al. Comparison of human skeletal myoblasts and bone marrowderived CD133+ progenitors for the repair of infarcted myocardium. J Am Coll Cardiol 2004; 44:458-63.
87. Hristov M, Weber C. Endothelial progenitor cells: characterization, pathophysiology, and possible clinical relevance. J Cell Mol Med 2004; 8: 498-508.
88. Kamihata H, Matsubara H, Nishiue T, Fujiyama S, Tsutsumi Y, Ozono R. Implantation of bone marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional function via side supply of angioblasts, angiogenic ligands and cytokines. Circulation 2001; 104: 1046-52.
89. Tomita S, Li R, Weisel R, et al. Autologous trans-plantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation 1999; 100 (Suppl II): II 247-56.
90. Swynghedauw B. Is adult cardiac myocyte still able to proliferate?. Med Sci (Paris) 2004; 20: 710-4.
91. Kim E, Li R, Weisel R, et al. Angiogenesis by endothelial cell transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg 2001; 122: 963-71.
92. Rustom A, Saffrich R, Markovic I, Walther P, Gerdes H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science 2004; 303: 1007-10.
93. Koyanagi M, Brandes R, Haendeler J, Zeiher A, Dimmeler S. Cell-to-cell connection of endothelial progenitor cells with cardiac myocytes by nanotubes. Circ Res 2005; 96; 1039-41.
94. Dawn B, Stein AB, Urbanek K, et al. Cardiac stem cells delivered intravascularly traverse the vessel barrier, regenerate infarcted myocardium, and improve cardiac function. PNAS 2005; 8; 102: 3766-71.
95. Oh H, Bradfute S, Gallardo T, et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. PNAS 2003; 100: 12313-18.
96. Messina E, De Angelis L, Frati G, et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res 2004; 95: 911-21.
97. Laugwitz K, Moretti A, Lam J, et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature 2005; 433: 647-53.
98. Linke A, Müller P, Nurzynska D, et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. PNAS 2005; 102: 8966-71.
99. Wollert K, Drexler H. Clinical applications of stem cells for the heart. Circ Res 2005; 96: 151-63.
        [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]

Recibido: 21-11-2005
Aceptado: 24-05-2006