El splicing alternativo del exón 5 de la citocromo p450 aromatasa podría ser un mecanismo de regulación de la producción de estrógenos en humanos*

Carolina M. Pepe, Nora I. Saraco, María Sonia Baquedano, Gabriela Guercio, Elisa Vaiani, Esperanza Berensztein, Marco A. Rivarola, Alicia Belgorosky

Laboratorio de Investigación, Hospital Garrahan, Buenos Aires, Argentina

*Este trabajo mereció el Premio Cossio otorgado por la Sociedad Argentina de Investigación Clínica en Mar del Plata, noviembre 2006.

Dirección postal: Dra. Alicia Belgorosky, Hospital Garrahan, Combate de los Pozos 1881, 1245 Buenos Aires, Argentina Fax: (54-11) 4308-5325 e-mail: abelgo@elsitio.net

Resumen
La enzima P450 aromatasa (P450Aro) participa en la síntesis de estrógenos a partir de andrógenos. La mutación c655G>A, descripta en forma heterocigota en una niña y en forma homocigota en un hombre adulto, ambos con déficit de aromatasa, genera la disrupción del sitio dador de splicing exón5-intrón5. Se ha postulado que la retención del intrón5 y la generación de una proteína truncada inactiva serían las consecuencias de esta mutación. Sorpresivamente, la paciente presentó desarrollo espontáneo de mamas y niveles puberales de estradiol, sugiriendo una actividad aromatasa (AA) residual. En principio postulamos que la mutación c655G>A generaría la pérdida del exón5 con conservación del marco de lectura, generándose una proteína con menor actividad que podría explicar el déficit parcial. La expresión del ARNm sin exón5 (ARNm- E5) en linfocitos de la paciente sugiere una asociación entre la pérdida del exón y la presencia de la mutación; posteriormente confirmada realizando ensayos de splicing en células Y1. Sin embargo, la expresión del cDNAE5 en células Y1 presentó una AA nula que no explicaría un déficit parcial. La expresión del ARNm-E5 fue detectada en placenta, testículo y adrenal humanos como una variante de splicing normal. Estos resultados indicarían la ocurrencia de splicing alternativo (SA) en la zona codificante de P450Aro como un posible mecanismo regulador de la producción de estrógenos en tejidos esteroidogénicos humanos. La mutación c655G>A podría alterar los mecanismos fisiológicos reguladores del SA del exón5 favoreciendo su exclusión. De esta forma, bajos niveles de ARNm+E5 podrían expresarse aun en presencia de la mutación explicando el fenotipo de déficit parcial observado en la paciente.

Palabras clave: Deficiencia parcial de aromatasa; Splicing alternativo; Mutaciones del gen CYP19

Abstract:
Exon 5 alternative splicing of the cytochrome P450 aromatase could be a regulatory mechanism for estrogen production in humans. P450 aromatase (P450Aro), involved in androgen to estrogen conversion, is encoded by the CYP19 gene. P450Aro c655G>A mutation described in heterozygous form in a girl and in homozygous form in an adult male with P450Aro deficiency results in an aberrant splicing due to disruption of a donor splice site. A truncated inactive protein would be expected if intron5 is retained. Surprisingly, the girl described with this mutation showed spontaneous breast development and pubertal estradiol (E2) levels suggesting residual P450Aro activity (AA). Formerly, we postulate the in frame E5 skipping as a consequence of this mutation generating a protein with some degree of activity. When P450Aro mRNA expression was analysed from patient's lymphocytes, an aberrant spliced mRNA lacking E5 (-E5mRNA) was detected, suggesting an association between E5 skipping and the presence of the mutation. Splicing assays in Y1 cells confirmed this association. -Ex5 cDNA expression in Y1 cells resulted in an inactive protein that could not explain patient's phenotype. Exon 5 might be predicted as a poorly defined exon suggesting a susceptibility to splicing mutations and physiological alternative splicing (AS) events. Therefore, -Ex5mRNA was assessed as a natural occurring alternative transcript in normal human steroidogenic tissues. As P450Aro -E5mRNA expression was detected in human term placenta, prepubertal testis and prepubertal adrenal, we might speculate that AS of P450Aro coding region would occur in humans and would be involved in the complex AA regulation. Furthermore, tissue specific regulation of AS might suggest low expression of +E5mRNA from the c655G>A allele explaining residual AA evidenced in the affected girl.

Key words: Partial aromatase deficiency; CYP19 mutations; CYP19 alternative splicing

La enzima P450 aromatasa (P450Aro) está codificada por el gen CYP19 y junto con la NADPH citocromo P450 reductasa forman el complejo enzimático responsable de la biosíntesis de estrógenos a partir de andrógenos¹. En la mayoría de los vertebrados la expresión de esta enzima ocurre en gónadas y en cerebro. Sin embargo, en humanos y en algunos primates superiores la expresión de la P450Aro es aún más amplia, incluyendo el sinciciotrofoblasto placentario, gónadas, tejido adiposo, hueso, músculo liso vascular, cerebro, hipocampo, hipotálamo, amígdala y varios tejidos fetales incluyendo hígado, piel, intestino, testículo y ovario².
Se han descripto 12 familias con deficiencia completa de la enzima P450Aro^{3, 4} y dos familias con déficit parcial como consecuencia de mutaciones en el gen CYP19⁵.
Las alteraciones moleculares del gen CYP19 descriptas en asociación con una deficiencia completa de actividad de la enzima P450Aro, han contribuido al conocimiento de la relevancia de esta enzima durante la embriogénesis y vida postnatal en humanos³.
Recientemente hemos descrito el caso de una niña con características clínicas de deficiencia de la enzima P450Aro, heterocigota compuesto para las mutaciones DAGLU412X (alelo materno) y c655G>A (alelo paterno)⁶. La mutación DAGLU412X genera la deleción de un residuo de adenina en el exón 9, un corrimiento del marco de lectura y la aparición de un codón stop prematuro 33 codones corriente abajo del sitio de la mutación. Podría esperarse una actividad aromatasa (AA) nula si consideramos que la proteína que se expresaría a partir del alelo portador de la mutación DAGLU412X carecería del sitio de unión al grupo hemo, esencial para la actividad de la P450Aro.
La mutación c655G>A ocurre en el último nucleótido del exón 5, postulándose dos consecuencias posibles: el cambio de aminoácido Glu210Lys o la ocurrencia de un splicing aberrante debido a la disrupción del sitio dador de splicing exón5-intrón⁵. Esta misma mutación ha sido descripta en forma homocigota en un hombre adulto con características clínicas de deficiencia de aromatasa⁴. En dicho estudio se ha demostrado que el cambio de aminoácido Glu210Lys no altera la actividad aromatasa (AA). Utilizando la metodología exon-trapping system se ha evidenciado que la mutación c655G>A genera la disrupción del sitio dador de splicing. Finalmente, se ha propuesto que la retención del intrón 5 ocurriría como consecuencia de la mutación, generándose una proteína truncada, completamente inactiva, debido a la generación de un codón stop prematuro⁴. Sin embargo y sorpresivamente, la paciente heterocigota compuesto para esta mutación6 presentó a los 8 años de edad cronológica desarrollo espontáneo de mamas junto con niveles séricos de estradiol (E2) compatibles con inicio puberal, lo cual sugeriría una actividad aromatasa residual.
De acuerdo al "modelo de definición exónica"⁷, la pérdida del exón constituiría el fenotipo prevalente asociado a mutaciones en los sitios 5' dadores de splicing, fundamentalmente cuando los intrones involucrados son largos. Debido a que los intrones del gen CYP19 son largos, la pérdida del exón 5, con conservación del marco de lectura, no debería descartarse como un posible fenotipo asociado a la mutación c655G>A.
Eventos de splicing alternativo en la zona codificante de la P450Aro han sido descriptos en varias especies, incluyendo primates superiores^8-14. Se ha propuesto que estos eventos de splicing alternativo podrían constituir un mecanismo regulador de la actividad aromatasa (AA).
En humanos, sin embargo, eventos de splicing alternativo de la P450Aro han sido descriptos sólo asociados a la expresión tejido específica de los diferentes exones 1 no codificantes¹⁵.
Los sitios de splicing dador y aceptor que flanquean al E5 fueron analizados utilizando varios programas de predicción de sitios de splicing. Este análisis reveló una baja homología de ambos sitios con las secuencias consenso dadoras y aceptoras respectivamente, siendo reconocidos por dichos programas como sitios débiles o de bajo score. De esta forma el E5 se convertiría, en términos del "modelo de definición exónica", en un exón pobremente definido que podría estar involucrado en eventos de splicing alternativo.
En este estudio se evaluaron las posibles consecuencias moleculares de la mutación c655G>A a fin de explicar las características clínicas observadas en la paciente heterocigota compuesto para dicha mutación. La expresión del ARNm-E5 como una variante de splicing normal en tejidos esteroidogénicos humanos fue también analizada como parte del presente trabajo.
Material clínico: se aislaron linfocitos por el método de Ficoll a partir de sangre entera de la paciente, sus padres y 10 controles normales. Las muestras de tejido testicular (n=10) fueron obtenidas de necropsias de pacientes entre 1 día y 3 meses de edad, sin enfermedades endocrinometabólicas y con menos de 6 horas postmortem. Las muestras de tejido adrenal (n=10) se obtuvieron de donantes de órganos entre 10 días y 20 años de edad, con menos de 24 horas de diagnóstico de muerte cerebral y sin enfermedades endocrinometabólicas. Las muestras de tejido placentario (n=3) se obtuvieron de partos a término. El estudio ha sido aprobado por el Comité de Ética del Hospital Garrahan.
Construcción de los minigenes WT, Mut y de los vectores p-Aro y p-AroDE5: el minigen salvaje (WT) fue construido clonando en forma secuencial cuatro fragmentos de PCR correspondientes a parte de los exones 4 y 7, los exones 5 y 6 completos y las regiones intrónicas flanqueantes, en el vector de expresión pTarget^TM mammalian expression vector system ( Promega, Buenos Aires). características que pudieran influenciar las decisiones de splicing, como por ejemplo la longitud de los intrones, fueron tenidas en cuenta en la construcción del minigen. El minigen mutado (Mut) fue construido reemplazando el fragmento 2 en el minigen WT por el fragmento conteniendo la mutación amplificado a partir de ADN aislado de linfocitos de la paciente. La secuencia de los minigenes fue verificada por secuenciación directa.
Se construyó p-Aro clonando en el vector de expresión pcDNA3 el cDNA de la P450Aro humana. Por mutagénesis dirigida del vector p-Aro y usando una estrategia previamente descripta¹⁶, se eliminó el E5 obteniéndose p-AroDEx5. Fueron transfectadas células Y1 (línea adrenal tumoral murina) utilizando lipofecta-mina 2000 ( Invitrogen, Buenos Aires) con los minigenes WT y Mut a fin de evaluar el procesamiento del ARNm expresado y con los vectores de expresión p-Aro y p-AroDE5 a fin evaluar la AA asociada a su expresión.
Análisis de ARN: Se aisló ARN total a partir de linfocitos, de células Y1 transfectadas con los minigenes WT y Mut y de los 3 tejidos esteroidogénicos en estudio usando TRIZOL ( Invitrogen, Buenos Aires).
Se amplificó el fragmento E4-E7 del cDNA de la P450Aro humana. En el caso de los tejidos la amplificación se realizó utilizando uno de los primers específicos marcado con ³²P. El ARN total aislado de células transfectadas con p-Aro y p-AroDE5 fue analizado por Northern Blot.
Determinación de la actividad aromatasa: La AA en células transfectadas con p-Aro y p-AroDE5 se expresó como la cantidad de estradiol (E2) producida en 24 horas por µg de ARN a partir del sustrato testosterona (T) agregado al medio de cultivo. La concentración de E2 en el medio de cultivo se determinó por radioinmunoanálisis ( coat-A-count kit, Diagnostic Products Corporation).
A fin de evaluar la consecuencia in vivo de la mutación c655G>A, analizamos por RT-PCR la expresión del ARNm de la P450Aro en linfocitos de la paciente, sus padres y un pool de 10 controles normales. Se utilizó el par de primers diseñado para amplificar el fragmento E4- E7 del cDNA de la P450Aro humana. El fragmento de tamaño esperado (491 pb) fue detectado en todas las muestras analizadas. Además de este fragmento, uno adicional de 312 pb cuyo análisis por secuenciación reveló la falta del E5, fue detectado en las muestras de la paciente y de su padre (portador de la mutación c655G>A) (Fig 1A). La ausencia del fragmento de 312 pb en la muestra de la madre y en el pool de controles normales sugiere una asociación entre la ocurrencia de este splicing aberrante y la presencia de la mutación. Esta asociación fue posteriormente confirmada realizando ensayos de splicing en células Y1 (línea celular de tumor adrenal murino) transfectadas con el minigen WT o con el minigen Mut, portador de la mutación c655G>A. Por RT-PCR se analizó la expresión de ambos minigenes en células Y1 amplificando el fragmento E4-E7 del cDNA de la P450Aro humana. El fragmento esperado de 491 pb fue amplificado a partir de células transfectadas con el minigen WT, mientras que en las células transfectadas con el minigen Mut, se amplificaron dos fragmentos de menor tamaño: un fragmento de 312 pb y un fragmento de 194 pb cuyo análisis de secuencia reveló la ausencia del E5 y de los E5 y E6 respectivamente (Fig 1B).

Fig. 1.- Amplificación por RT-PCR del fragmento E4-E7 del cDNA de la P450Aro humana a partir de ARN total aislado de linfocitos de sangre periférica (A) y de células Y1 transfectadas con los minigenes salvaje (WT, y mutado (Mut) (B).

A fin de evaluar si la expresión del ARNm-E5 se asocia con una AA disminuida o nula, se transfectaron células Y1 con los vectores p-Aro y p-AroDE5 y se evaluó la AA a través de la producción de E2 a partir de T. Se detectó producción de E2 en células transfectadas con p-Aro (175.5±10.5 pg/µg de ARN, 24 horas), mientras que no se evidenció producción de E2 en células transfectadas con p-AroDEx5 ni en las células control sin transfectar. Similares niveles de expresión del ARNm de la enzima P450Aro fueron evidenciados por Northern Blot en células transfectadas con ambos vectores de expresión (p-Aro y p-AroDEx5) indicando que las diferencias observadas en la actividad aromatasa no se deberían a diferencias en la eficiencia de transfección y/o transcripción entre ambos vectores de expresión. De esta forma, la expresión del ARNm-E5 se asoció a una actividad aroma-tasa nula y no permitiría explicar la actividad aromatasa residual observada en la paciente heterocigota compuesto para la mutación c655G>A.
Por RT-PCR se analiz ó la expresión de la P450Aro en tejido testicular prepuberal, tejido adrenal prepuberal y puberal y placenta a término, evidenciandose que el ARNm-E5 se expresa en estos tejidos esteroidogénicos humanos como una variante de splicing normal (Fig. 2).

Fig. 2.- Amplificación por RT-PCR del fragmento E4-E7 del cDNA de la P450Aro humana a partir de un pool de cDNA de tejido testicular prepuberal (Te), tejido adrenal prepuberal y puberal (Ad) y placenta a término (Pl).

Estos resultados nos permiten describir por primera vez la ocurrencia de splicing alternativo en la zona codificante de la P450Aro humana y nos permiten postular al splicing alternativo del E5 como un nuevo mecanismo involucrado en la compleja regulación de la AA en tejidos esteroidogénicos humanos.
La importancia fisiol ógica y los mecanismos involucrados en la regulación de la expresión del trascrito -E5 requieren de estudios posteriores a fin de ser dilucidados. Se ha descrito que mutaciones que afectan secuencias reguladoras de splicing pueden asociarse a la expresión de ambos transcriptos, normal y aberrante. A fin de explicar el fenotipo de déficit parcial de P450Aro observado en la paciente, podría postularse la expresión de ciertos niveles de ARNm+E5 a partir del alelo portador de la mutación c655G>A, originando una proteína, que a pesar de portar el cambio de aminoácido Glu210Lys, tendría una actividad aromatasa normal, según ha sido descrito previamente por Maffei y col ⁴.
Concluyendo, nuestros resultados permiten postular que el splicing alternativo del exón 5 ocurriría como un evento normal regulador de la producción de estrógenos en tejidos esteroidogénicos humanos. La presencia de la mutación c655G>A podría alterar la regulación del splicing alternativo del exón 5 favoreciendo una prevalencia en la expresión de la proteína -E5 sobre la proteína completa. Esto último podría constituir un mecanismo capaz de explicar la AA residual observada en la paciente portadora de la mutación c655G>A.

Agradecimientos: Este trabajo fue financiado con subsidios otorgados por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), por el Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCYT), por la Fundación F. Fiorini, y por Pfizer Endocrine Care. Los autores agradecen la colaboración de Mercedes Maceiras, Eduardo Chaler, Roxana Marino y Diego Chirico.

Bibliografía

1. Simpson ER. Sources of estrogen and their importance. J Steroid Biochem Mol Biol 2003; 86: 225-30.
2. Simpson ER, Mahendroo MS, Means GD, et al. Aromatase cytochrome P450, the enzyme responsible for estrogen biosynthesis. Endocr Rev 1994; 15: 342-55.
3. Belgorosky A, Rivarola MA. Physiology and pathophysiology of estrogens: lessons from pediatric patients with complete aromatase deficiency. The Endocrinologist 2004; 14: 93-100.
4. Maffei L, Murata, Y, Rochira V, et al. Dysmetabolic syndrome in a man with a novel mutation of the aromatase gene: effects of testosterone, alendronate, and estradiol treatment. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 61-70.
5. Lin L, Ercan O, Raza J, et al. Variable phenotypes associated with aromatase (CYP19) insufficiency in humans. J Clin Endocrinol Metab 2006; Epub ahead of print.
6. Belgorosky A, Pepe C, Marino R, et al. Hypothalamicpituitary- ovarian axis during infancy, early and late prepuberty in an aromatase-deficient girl who is a compound heterocygote for two new point mutations of the CYP19 gene. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88: 5127-31.
7. Robberson BL, Cote GJ, Berget SM. Exon definition may facilitate splice site selection in RNAs with multiple exons. Mol Cell Biol 1990; 10: 84-94.
8. Yamada-Mouri N, Hirata S, Kato J, Hoshi K. Expression and distribution of cortical type aromatase mRNA variant in the adult rat brain. J Steroid Biochem Mol Biol 1997; 60: 325-9.
9. Levallet J, Mittre H, Delarue B, Carreau S. Alternative splicing events in the coding region of the cytochrome P450 aromatase gene in male rat germ cells. J Mol Endocrinol 1998; 20: 305-12.
10. Pezzi V, Panno ML, Sirianni R, et al. Effects of triiodothyronine on alternative splicing events in the coding region of cytochrome P450 aromatase in immature rat Sertoli cells . J Endocrinol 2001; 170: 381-93.
11. Delarue B, Breard E, Mittre H, Leymarie P. Expression of two aromatase cDNAs in various rabbit tissues. J Steroid Biochem Mol Biol 1998; 64: 113-9.
12. Hanoux V, Bouraima H, Mittre H, Feral C, Benhaim A. Differential regulation of two 3' end variants of P450 aromatase transcripts and of a new truncated aromatase protein in rabbit preovulatory granulosa cells. Endocrinology 2003; 144: 4790-8.
13. Abdelgadir SE, Roselli CE, Choate JV, Resko JA. Distribution of aromatase cytochrome P450 messenger ribonucleic acid in adult rhesus monkey brains. Biol Reprod 1997; 57: 772-7.
14. Pereyra-Martinez AC, Roselli CE, Stadelman HL, Resko JA. Cytochrome P450 aromatase in testis and epididymis of male rhesus monkeys. Endocrine 2001; 6: 15-9.
15. Bulun SE, Sebastian S, Takayama K, Suzuki T, Sasano H, Shozu M. The human CYP19 (aromatase P450) gene: update on physiologic roles and genomic organization of promoters. J Steroid Biochem Mol Biol 2003; 86: 219-24.
16. Imai Y, Matsushima Y, Sugimura T, Terada M. A simple and rapid method for generating a deletion by PCR. Nucleic Acids Res 1991; 19: 2785.         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]