Las células T reguladoras y su influencia en la sobrevida del trasplante renal

Sonia Y. Velásquez, Luis F. García, Cristiam M. Alvarez

Grupo de Inmunología Celular e Inmunogenética, Facultad de Medicina, Sede de Investigación Universitaria, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia

Dirección postal: Dr Cristiam M. Alvarez, Grupo de Inmunología Celular e Inmunogenética, Sede de Investigación Universitaria (SIU), Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia. Fax: +57 4 210 6455 e-mail: cristianma@medicina.udea.edu.co

Resumen
La respuesta inmune desencadenada frente a un trasplante alogénico conduce usualmente a una respuesta efectora que resulta en el rechazo del aloinjerto; sin embargo, algunos individuos mantienen un trasplante funcionante a largo plazo sin signos de rechazo (tolerancia operacional), aun en ausencia de inmunosupresión. Se ha sugerido que los mismos mecanismos son responsables para la tolerancia hacia antígenos propios y aloantígenos. Uno de estos mecanismos es la regulación inmune y se han identificado varias subpoblaciones de células con propiedades reguladoras. Entre ellas, la población celular mejor caracterizada corresponde a las células T reguladoras (T_regs). Aunque las T_regs en ratones son CD4⁺CD25⁺, en humanos el fenotipo de las Treg está restringida a las células T CD4 con alta expresión de CD25 (CD25^high) y del factor de transcripción Foxp3. El análisis fenotípico y funcional de las células T reguladoras o supresoras circulantes en pacientes trasplantados tal vez sea útil para la detección de pacientes tolerantes operacionales. Además, una futura manipulación in vitro de estas células con fines terapéuticos podría conducir a lograr la inducción de tolerancia in vivo en el trasplante clínico. Aquí, revisamos la evidencia experimental y clínica del papel de las células reguladoras en la biología del trasplante.

Palabras clave: Trasplante renal; Rechazo de injerto; Inmunosupresión; Tolerancia al trasplante; Tolerancia inmune; Linfocitos T

Abstract
Regulatory T cells and their influence in kidney allograft survival. The immune response elicited by an allogenic transplant usually leads to an effector response resulting in allograft rejection; however, some individuals maintain a long-term functioning transplant without signs of rejection (operational tolerance) even in the absence of immunosuppression. It has been suggested that the same mechanisms are responsible for tolerance to self-antigens and alloantigens. One of such mechanisms is immune regulation and several cell subsets with regulatory properties have been identified. Among them, the best characterized cell populations are the regulatory T cells (T_reg). Although T_reg in mice are CD4⁺CD25⁺, in humans the Treg phenotype is restricted to CD4 T cells with high expression of CD25 (CD25^high) and Foxp3. Phenotypic and functional analysis of circulating regulatory or suppressor T cells in transplant patients may be useful for detection of operationally tolerant patients. Moreover, future in vitro manipulation of these cells with therapeutic purposes could lead to accomplish induction of in vivo tolerance in clinical transplantation. Herein, we review the experimental and clinical evidence for the role of regulatory cells in transplant biology.

Key words: Kidney transplantation; Graft rejection; Immunosuppression; Transplantation tolerance; Immune tolerance; T-lymphocytes

Estado actual del trasplante renal

El trasplante renal es la solución terapéutica de uso más frecuente en pacientes que presentan enfermedad renal terminal, una serie de enfermedades de amplia distribución a nivel mundial que conducen a la pérdida lenta, progresiva e irreversible de la función renal. Los tratamientos para la enfermedad renal terminal son la terapia de reemplazo (diálisis peritoneal y hemodiálisis) y el trasplante renal. Sin embargo, los pacientes que reciben un trasplante tienen una mejor calidad de vida respecto a aquellos que permanecen en diálisis¹.
El progreso en las técnicas quirúrgicas, los avances en los criterios inmunológicos de selección de la pareja donante-receptor, el diseño de fármacos inmunosupresores más eficaces para el manejo clínico de los pacientes trasplantados, la introducción de nuevas técnicas para el seguimiento clínico, así como un conocimiento más detallado de los eventos inmunológicos que tienen lugar cuando un individuo recibe un aloinjerto (trasplante realizado entre individuos de la misma especie, pero genéticamente diferentes), han hecho posible avanzar de manera significativa en el manejo del trasplante². Sin embargo, aún hay problemas importantes por resolver: 1) las altas tasas de sobrevida de aloinjertos en los primeros años post-trasplante no siempre se correlacionan con las tasas de sobrevida a largo plazo, 2) a pesar del uso de inmunosupresión, el rechazo agudo continúa siendo una causa de pérdida temprana del injerto, 3) las complicaciones de la terapia inmunosupresora son numerosas, principalmente las infecciones, las neoplasias y las complicaciones cardiovasculares, y 4) el rechazo crónico continúa siendo la principal causa de pérdida irreversible a largo plazo del órgano trasplantado³.
Por estas razones se ha planteado como meta del trasplante clínico en humanos la inducción de tolerancia inmunológica al aloinjerto, con el objetivo de disminuir el uso crónico de los inmunosupresores o incluso en la medida de lo posible, prescindir de ellos. Estudios en las últimas décadas de individuos trasplantados con función estable a largo plazo sin evidencia o signos de rechazo, y en ausencia o con dosis mínimas de inmunosupresión, han permitido establecer que la sobrevida a largo plazo en estos pacientes puede ser debida a tolerancia inmunológica⁴. Estos pacientes se han definido como tolerantes operacionales y se ha propuesto que en ellos la interacción de diversos mecanismos inmunológicos podría explicar la ausencia de rechazo⁵.
El objetivo de esta revisión es brindar una aproximación teórica a los eventos inmunológicos que tienen lugar cuando un individuo recibe un trasplante, así como realizar una descripción de los mecanismos de regulación inmune, particularmente de las células T reguladoras CD4⁺CD25^high y su influencia en el mantenimiento de la sobrevida de aloinjertos.

Respuesta inmune hacia el aloinjerto

El reconocimiento de aloantígenos, como los productos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), designados HLA en humanos, es el principal responsable de inducir una respuesta inmune celular y humoral frente al aloinjerto. Sin embargo, otros mecanismos no inmunes que pueden tener influencia sobre el rechazo incluyen la isquemia prolongada, la manipulación quirúrgica y el daño por reperfusión^{6, 7}.
Inicialmente, como consecuencia del trauma asociado a la isquemia y al procedimiento quirúrgico, se promueve en el órgano una condición inflamatoria multifactorial e independiente de antígeno, que puede facilitar la inducción del rechazo del órgano. Los efectos de la isquemia-reperfusión sobre el aloinjerto se evidencian principalmente a corto plazo e inducen la activación del endotelio, aumento en la permeabilidad y en la expresión de moléculas de adhesión⁸.
En las primeras etapas de la respuesta alogénica, las células dendríticas (DC) del donante presentes en el injerto entran a la circulación del receptor, migran hasta el bazo y allí presentan los antígenos del donante a las células T del receptor. Este evento, sumado al aumento en la expresión de selectinas específicas en las células del injerto (E-selectinas), como producto de la reacción inflamatoria que se desencadena tras el proceso de extracción y almacenamiento del órgano, conduce a un aumento en la expresión de quimioquinas y moléculas de adhesión "in situ" que facilitan el tráfico de células T expandidas y activadas hasta el injerto⁹. El reconocimiento de los aloantígenos del injerto y de las células presentadoras de antígeno (APCs), por células T del receptor ocurre por tres vías diferentes. En la vía directa de alorreconocimiento, las células T del receptor a través de su TCR reconocen directamente complejos MHCpéptidos en las DC del donante residentes en el tejido trasplantado, que han migrado hasta el bazo del receptor y que constituyen un potente estímulo para las células T¹⁰. En esta vía, los aloantígenos MHC de clase I son reconocidos por células T CD⁸⁺, y los aloantígenos MHC de clase II son reconocidos por células T CD4⁺¹¹. En la vía indirecta, los aloantígenos MHC de clase I y clase II, que se encuentran como antígenos solubles circulantes o se liberan por daño del injerto, son procesados y presentados por las APCs del receptor como péptidos extraños en el contexto de las moléculas MHC clase II, a células T CD4⁺ del receptor en el bazo^{12, 13}. La tercera vía propuesta, la vía semidirecta, funcionaría como enlace entre las vías directa e indirecta¹⁴. En esta vía, las DC del receptor adquieren y presentan moléculas intactas MHC clase I del donante, capaces de estimular a células T CD8⁺ y a la vez pueden procesar y presentar moléculas MHC del donante, como péptidos, en moléculas MHC clase II a células T CD4⁺¹⁵ (Fig. 1).

Fig. 1.- Vías de alorreconocimiento. Las células T del receptor a través de su receptor celular T (TCR) reconocen complejos MHC-péptidos mediante tres vías distintas. En la vía directa, los aloantígenos MHC de clase I y II son reconocidos por células T CD8⁺ y T CD4^+, respectivamente. En la vía indirecta, los aloantígenos MHC solubles son reconocidos por células T CD4⁺ del receptor, como péptidos extraños presentados por APCs en moléculas MHC de clase II. En la vía semidirecta, las DC del receptor adquieren y presentan moléculas intactas MHC clase I del donante que estimulan a células T CD8⁺ y a la vez procesan y presentan moléculas MHC del donante, como péptidos, en moléculas MHC clase II que son reconocidos por células T CD4^+.

Como resultado de la exposición a aloantígenos y después de la activación por parte de APCs, las células T CD4⁺ antígeno específicas se diferencian en células efectoras especializadas en la producción de diferentes citoquinas y con capacidad citotóxica. Las células T CD4⁺ o ayudadoras, cuya principal función es producir citoquinas que permitan la proliferación y activación de las células efectoras, pueden diferenciarse en tres subtipos: células Th1, Th2 y Th17¹⁶. Las principales citoquinas producidas por las células Th1 son interferón gamma (IFN-g), interleuquina (IL)-2, IL-15 y factor de necrosis tumoral (TNF-b) y su secreción induce la fase efectora de la inmunidad celular, principalmente por activación de linfocitos T citotóxicos CD8⁺ y macrófagos. Las células Th2 producen citoquinas como IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, las cuales son críticas en la inducción de la inmunidad humoral y en la aparición de la eosinofilia¹⁷. De otra parte, las recientemente caracterizadas células Th17 representan una única subpoblación de células T CD4⁺ productoras de IL-17, regulada por IL-23 y distinta de las subpoblaciones Th1 y Th2. La IL-17, una citoquina proinflamatoria, facilita la activación de las células T y estimula fibroblastos, células endoteliales, macrófagos y células epiteliales para producir múltiples mediadores proinflamatorios, incluyendo IL-1, IL-6, TNF-a, NOS-2, metaloproteasas y quimioquinas, resultando en la inducción de inflamación¹⁸. Existe un proceso de regulación cruzada entre las citoquinas Th1, Th2 y Th17, de tal modo que el IFN-g secretado por las Th1, inhibe la diferenciación de las células Th2 y Th17. Similarmente, la IL-4 secretada por las Th2, inhibe la diferenciación de las células Th1 y Th17, mientras que la IL-23 induce selectivamente la expansión de células productoras de IL-17 (Th17) y no de las subpoblaciones Th1 y Th2^{19, 20}. Se ha sugerido que los factores que pueden direccionar esta diferenciación son el entorno local de citoquinas, la dosis de antígeno, la afinidad por el antígeno, los haplotipos del MHC, el tipo de DC (1 o 2), la acción de otras APCs diferentes a las DC y el tipo de ligando para el CD28 (CD80 o CD86)^21-24.
Una vez activadas, las células T funcionan sinergísticamente con células del sistema inmune innato para rechazar el aloinjerto a través de: (1) citotoxicidad de células T dependientes de contacto, mediante la vía perforina/granzima (en células T CD8⁺ y células NK) y la interacción Fas/FasL (en células T CD4⁺); (2) activación de macrófagos mediada por citoquinas tipo Th1 como IFN-g y TNF-a; (3) producción de aloanticuerpos específicos por las células B; y (4) secreción de citoquinas proinflamatorias por células estromales y macrófagos, mediada por las células Th17^{6, 25}.
De acuerdo a los mecanismos predominantes, en la fase efectora del alorreconocimiento se han descrito diferentes tipos de rechazo. El rechazo más inmediato del aloinjerto, denominado rechazo hiperagudo, ocurre en los primeros minutos u horas postrasplante como consecuencia de anticuerpos preformados contra aloantígenos de grupos sanguíneos, endotelio, algunos determinantes de carbohidratos específicos de especie o antígenos HLA (estos últimos por un contacto previo a través de transfusiones, embarazos u otros trasplantes) que activan rápidamente el sistema del complemento y la cascada de coagulación produciendo la lisis de la célula blanco y trombosis arteriolar^{26, 27}. El otro tipo de rechazo que puede ocurrir en los primeros días postrasplante se conoce como rechazo acelerado. Este rechazo es causado por anticuerpos no fijadores de complemento, que generan una respuesta de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mediada por células NK y macrófagos²⁸.
El rechazo agudo, por su parte, puede presentarse en las primeras semanas o meses postrasplante como resultado del reconocimiento alogénico mediado por las células T CD4⁺ y CD8⁺²⁹. Otro tipo de rechazo que puede presentarse después de meses o años postrasplante es el rechazo crónico, el cual se desarrolla a través de vías no muy conocidas e involucra aloinmunidad hacia el injerto mediada por células T y por anticuerpos³⁰. Además, los injertos pueden ser lesionados crónicamente por mecanismos no inmunes, tales como medicamentos, isquemia, envejecimiento o enfermedad parenquimal de novo o recurrente, así como episodios de rechazo agudo tratados inadecuadamente; sin embargo, una definición estricta de rechazo crónico excluye a tales mecanismos. Lo más importante para resaltar de este tipo de rechazo es que se trata de un deterioro gradual de la función del injerto que conduce a una falla tardía del injerto y no puede revertirse con inmunosupresión³¹.

Inmunosupresión y limitantes en el trasplante renal

Para evitar o revertir el rechazo, las estrategias utilizadas en la práctica clínica y en los modelos experimentales incluyen el uso de diversas drogas inmunosupresoras como análogos de nucleótidos (azatioprina y micofenolato mofetil), inhibidores de la calcineurina (ciclosporina, tacrolimus), esteroides (glucocorticoides) y anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra diferentes marcadores de superficie del linfocito (CD3, CD52, CD25, CD40L, CTLA-4). Estos medicamentos inhiben la fase de activación y proliferación de linfocitos T mediante la reducción, la desviación del tráfico de linfocitos y/o el bloqueo de las vías de activación del linfocito T³².
Los agentes inmunosupresores empleados actualmente en la práctica clínica no son específicos y por lo tanto no distinguen entre una respuesta inmune benéfica contra agentes infecciosos y una respuesta inmune destructiva contra el injerto. Esto hace que resulten muy efectivos a corto plazo disminuyendo la incidencia y severidad del rechazo agudo e incrementando la sobrevida de los aloinjertos. Sin embargo, no son eficaces en el tratamiento del rechazo crónico y generan efectos secundarios como la vasculopatía asociada al trasplante (nefropatía crónica del aloinjerto) producto de la toxicidad de los medicamentos y principalmente, una mayor susceptibilidad a infecciones y cáncer^{33, 34}.

Tolerancia en trasplantes

El objetivo más importante en inmunología de trasplantes es inducir tolerancia específica para el donante que permita la supervivencia del injerto a largo plazo sin inmunosupresión farmacológica. La tolerancia inmunológica se define como la ausencia de respuesta efectora frente a un antígeno específico (propio o extraño), inducida por un contacto previo con dicho antígeno³⁵.
La tolerancia puede ser central o periférica. En la inducción de la tolerancia central se eliminan en el timo los linfocitos autorreactivos mediante un proceso de deleción clonal. La tolerancia periférica hace que los linfocitos T maduros, que reconocen antígenos propios en los tejidos periféricos, se tornen incapaces de responder a exposiciones posteriores a estos autoantígenos³⁶. Los mecanismos de tolerancia periférica que se conocen son: 1) la anergia o inactivación funcional de células T por ausencia en la producción de IL-2, de la respuesta dependiente de IL-2 y/o coestimulación ineficiente³⁷, 2) la deleción clonal o eliminación de linfocitos T mediante muerte celular inducida por activación conocida también como "clonal exhausting"³⁸, 3) la desviación inmune, un mecanismo que involucra un predominio de los productos inmunorreguladores de los linfocitos Th2 (IL-4, IL-5 e IL-10), en lugar de los productos proinflamatorios de los linfocitos Th1 (IL-2, IFN-g, IL-15 e IL-18)³⁹ y 4) la regulación inmunológica, la cual implica la supresión de la activación linfocítica y de las funciones efectoras por células reguladoras⁴⁰.
Se ha establecido que los mecanismos inmunológicos que intervienen en la inducción de tolerancia hacia un aloinjerto son básicamente los mismos que mantienen la tolerancia hacia los antígenos propios. Sin embargo, una diferencia importante radica en la alta frecuencia de células T alorreactivas en el repertorio general y en la ausencia de deleción tímica de las células T alorreactivas en humanos. Por esto, la interacción de los mecanismos extratímicos parece ser el factor más importante en la aceptación del injerto a largo plazo, y entre ellos la regulación inmunológica parece ser uno de los mecanismos predominantes⁴¹.
En trasplantes de órganos y tejidos, la tolerancia se define como el mantenimiento a largo plazo de la función del aloinjerto, en ausencia de rechazo y sin inmunosupresión. Este fenómeno ha podido establecerse exitosamente en modelos animales, pero aún constituye una meta evasiva en humanos. Por tal motivo, se ha establecido el término de "tolerancia clínica parcial" para explicar el mantenimiento de la función estable del trasplante en algunos pacientes, en ausencia o con dosis mínimas de inmunosupresión⁴². En estos pacientes, la inducción de tolerancia clínica parcial depende del grado de compatibilidad HLA, el tratamiento previo de los receptores con transfusiones específicas de donante, trasplantes de médula ósea, irradiación corporal total o irradiación linfoide total, o uso de terapias inductoras con drogas inmunosupresoras⁵.

Regulación inmunológica: el nuevo paradigma

La regulación inmune constituye un mecanismo clave para el mantenimiento de la homeostasis del sistema inmune, tanto para el establecimiento de la tolerancia hacia antígenos propios y evitar los fenómenos de enfermedades autoinmunes, como para la modulación de la respuesta inmune hacia antígenos extraños. Las células reguladoras son las principales mediadoras de este mecanismo y se definen funcionalmente como células que inhiben la respuesta inmune al modular la actividad de otros tipos celulares, entre ellos linfocitos T CD4⁺ y CD8⁺, APCs, macrófagos y células NK⁴³.
El concepto de "células T supresoras" fue introducido en los años 70 cuando Gerhson y Kondo reportaron que algunas células estimuladas con antígeno eran capaces de inducir tolerancia después de ser transferidas a ratones vírgenes. Kilswal, Brent y Pinto definieron el papel de estas células en el contexto de la tolerancia al trasplante en ratones. Sin embargo, en los años 80 la dificultad para trasladar a los modelos in vitro el fenómeno de supresión evidenciado in vivo, impidió llegar a un consenso respecto a la validez de las observaciones y fue solo hacia mediados de la década del 90 cuando varios grupos se interesaron nuevamente en estudiar estas poblaciones celulares⁴⁴. Estudios funcionales in vivo, realizados por Sakaguchi et al., permitieron establecer que la tiroiditis autoinmune presente en ratones timectomizados a la edad de tres días, se debía a la ausencia de poblaciones de células T CD4⁺CD25^{+ 45}.
La relevancia de esta población para los trasplantes fue demostrada en ratones con trasplantes de médula ósea, gracias al hallazgo de que estas mismas células atenuaban la enfermedad injerto contra hospedero (GVHD) y transmitían tolerancia^{46, 47}. Graca et al. presentaron evidencias de que la tolerancia estaba mediada de una manera activa por células T CD4+ y requiere una exposición continua al antígeno^{48, 49}.
Además de las células T reguladoras (T_regs) CD4⁺CD25⁺, que han sido las más estudiadas en el contexto del trasplante, se han descrito varias poblaciones con diferentes fenotipos de superficie celular, y en algunos casos con diferentes mecanismos de acción, entre ellas las células CD4⁺ Tr1, CD4⁺ Th3, CD8⁺CD28-, CD4⁺CD28-, CD3⁺CD4-CD8-, NKT, Tgd y DC tipo 2^50-52.
La subpoblación de células T CD4⁺ -T_regs naturales- surge durante el desarrollo de células T en el timo y se caracteriza por la expresión constitutiva de la cadena á del receptor de IL-2, el CD25⁴⁵. Estas células exhiben también otros marcadores de superficie como CD45RB, CTLA-4, GITR (receptor relacionado con la familia de receptores del TNF inducido por glucocorticoides), CD122, CD103 (integrina aEb7), CD134 (OX40) y CD62L (L-selectina), cuyos niveles de expresión relativa fueron usados inicialmente para definir y aislar las Tregs CD4⁺CD25⁺. En la actualidad ninguna de tales moléculas representa por sí sola un marcador definitivo para las T_regs naturales, pues estas moléculas también son expresadas en otras subpoblaciones de células T CD4⁺, particularmente células T activadas⁵³. Recientemente, el análisis de la expresión del gen Foxp3, que codifica para el factor de transcripción "Scurfin", lo ha situado como un gen regulador del desarrollo y función de las células T_regs y por tanto como un marcador muy útil para identificar esta subpoblación, considerando la expresión simultánea del CD25⁵⁴. Sin embargo, se ha demostrado que su expresión, aunque predominantemente alta en células T_regs CD4⁺CD25⁺ naturales, también puede detectarse a muy bajos niveles en células T CD4⁺ y CD8⁺ totales⁵⁵, incluyendo a células CD4⁺CD25⁺ inducidas por aloantígenos y subpoblaciones de células T CD8⁺CD28, con propiedades reguladoras⁵⁶.
Se ha descrito una segunda subpoblación de células T CD4⁺ denominada como T_regs adaptativas, la cual se genera durante el curso de una respuesta inmune normal y expresa igualmente el CD25, pero de manera variable. Tal subpoblación incluye a su vez dos subpoblaciones similares, denominadas Th3 y Tr1, las cuales difieren en la secreción del factor de crecimiento transformante beta (TGF-b) e IL-10 respectivamente y pueden generarse por acción de las T_regs CD4⁺CD25⁺ sobre las células CD4⁺CD25- ⁵⁷.
Las células T CD8⁺CD28- son denominadas por algunos autores como "células supresoras" para distinguirlas de las T_regs T CD4⁺CD25⁺ (naturales o adaptativas). Estas células T CD8⁺ carecen de actividad citotóxica, son FOXP3⁺, están restringidas por moléculas MHC clase I y son capaces de tolerizar APCs profesionales como DC, y APCs no profesionales como células endoteliales⁵⁸. Su actividad supresora es mediada por contacto directo con las APCs, sobre las cuales se regulan positivamente los receptores inhibitorios de transcriptos tipo inmunoglobulina (ILT)-3 e ILT-4 y se regula negativamente la expresión de moléculas coestimuladoras CD80 y CD86⁴³. Varios estudios en pacientes trasplantados de corazón demuestran un incremento progresivo en el porcentaje de células T CD8⁺CD28-CD27⁺ Perforina-, en los pacientes libres de rechazo⁵⁹. Adicionalmente, se ha descrito que estas células exhiben un fenotipo regulador en un modelo de enfermedad autoinmune en ratones⁶⁰.
En relación con las células NKT, éstas constituyen una sublinaje conservado de células T con propiedades únicas que incluyen: reactividad hacia antígenos lipídicos presentados a través de la molécula CD1d, expresión de una cadena á invariante del TCR y requerimientos para la selección tímica diferentes a las células T convencionales⁶¹. Estas células expresan moléculas coestimulatorias como CD40L y producen citoquinas como IFN- g e IL-12, que conducen a la activación de DC y al direccionamiento de las respuestas hacia un patrón tipo Th1. Sin embargo, las células NKT también pueden producir citoquinas tipo Th2 como IL-4, IL-10 e IL-13 después de la estimulación, por lo cual serían capaces de modular diversas respuestas inmunes y procesos patogénicos, especialmente a través de la inducción de DC con propiedades reguladoras y productoras de IL-10, la cual a su vez es esencial para la generación de células T CD4 reguladoras⁶².
Se ha sugerido que las células NKT podrían estar involucradas en la tolerancia hacia aloinjertos mediante la producción de IL-10, debido a sus efectos antiinflamatorios y supresores en la mayoría de células hematopoyéticas⁶³, y a través del bloqueo de moléculas coestimulatorias requeridas para la activación de las células T como CD28/B7 y LFA-1/ICAM-1⁶⁴. Además, se ha descrito recientemente su papel regulador de la homeostasis de la célula T en la enfermedad GVHD⁶⁵.
Las células Tgd se han postulado como importantes poblaciones reguladoras en tejidos epiteliales, que modulan negativamente la repuesta de células Tgd . Aunque los mecanismos de regulación no son claros, los análisis de expresión génica en las células Tgd revelan que expresan altos niveles de RNA mensajero para quimoquinas como RANTES (CCL5), MIP1α (CCL3), MIP1β (CCL4) y linfotactina (XCL1), y además expresan altos niveles de efectores citolíticos como granzima A, granzima B, Fas ligando (CD95L) y linfotoxina⁶⁶.
Se ha propuesto que las células Tgd podrían regular las respuestas inmunes sistémicas, principalmente al inducir la citólisis de células efectoras, mediante la activación de su receptor NKG2D tras el reconocimiento de moléculas como RAE1 y/o MICA en células activadas. Igualmente, al promover la citólisis de células Tgd Fas⁺ (CD95) gracias a su alta expresión de Fas ligando.
La contribución de las citoquinas producidas por las células Tgd murinas aún no es clara, pero se ha descrito que a nivel clonal las respuestas pueden ser tipo Th1 o Th2. El predominio de citoquinas tipo Th1, como IFN-g , favorecería la expresión de FASL y de quimoquinas, como la proteína 10 inducible con IFN (IP10; CXCL10), en las células Tgd , mientras que la producción de citoquinas Th2 como IL-4 e IL-10 permitiría inhibir las acciones de linfocitos T citotóxicos (CTL) y células NK. Las células Tgd también pueden producir timosina-β4 (T-β4) y factor de crecimiento queratinocítico (KGF), los cuales podrían contribuir a la reparación del injerto⁶⁷. Aunque varios modelos murinos han demostrado el papel regulador de las células Tgd en cáncer y enfermedades autoinmunes e infecciosas, en trasplantes poco se ha investigado su posible intervención.

Células T_regs CD4⁺CD25^high: las principales protagonistas

Uno de los aportes más importantes para el conocimiento actual de la función de las células T supresoras o reguladoras fue el de Nishizuka y Sakakura y Penhale et al, con el cual se evidenció cómo en ciertas cepas de ratones timectomizados al tercer día de vida que presentaban un síndrome de tiroiditis autoinmune, era posible prevenir el síndrome al restituirlos con células T CD4⁺CD25^{+ 44}. Posteriormente, Sakaguchi et al. demostraron que después de la transferencia adoptiva de células T depletadas de las subpoblaciones CD4⁺CD25⁺ en ratones inmunodeficientes, era posible la inducción de varias enfermedades autoinmunes órgano-específicas, entre ellas diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis y gastritis. Estos estudios permitieron proponer a las células T CD4⁺CD25⁺ como un componente importante para la generación y el mantenimiento de la tolerancia hacia antígenos propios en ratones^{68, 69}.
Estudios posteriores mostraron que en ratones las células CD4⁺CD25⁺ representan entre un 5-10% del total de las células T CD4, son anérgicas, tienen efectos supresores sobre células T CD4⁺CD25- in vitro, la supresión no constituye una variación de los patrones de citoquinas conocidos y a pesar de que expresan la cadena α del receptor de IL-2, no requieren de esta citoquina^{70, 71}.
El aislamiento, identificación y caracterización en humanos de las poblaciones de células T CD4⁺CD25⁺ circulantes, mediante experimentos in vitro similares a los realizados con las células T CD4⁺CD25⁺ de ratones, ha revelado que en sangre periférica, en lugar de una única subpoblación de células T CD4⁺CD25^+, existen poblaciones circulantes de células CD4⁺CD25^high o CD4⁺CD25^++, capaces de suprimir la proliferación de células CD4⁺CD25-, y células no reguladoras CD4⁺CD25^low que representan, respectivamente, 1-2% y hasta 16% del total de las células T CD4^{+72, 73}. Las células CD4⁺CD25^low, definidas también como células CD4 ⁺ CD25^+, son más similares a las subpoblaciones CD4⁺CD25- que a las células reguladoras CD4⁺CD25^high, dado que la subpoblación CD4⁺CD25⁺ no es homogénea, e incluye linfocitos CD4⁺ activados a partir de la subpoblación CD4⁺CD25- e incluso un pequeño número de células T_regs CD4⁺CD25^{++74, 75}.
En ratones, se ha determinado que las células T_regs naturales se desarrollan en el timo, ejercen sus funciones inmunosupresoras a través de un mecanismo dependiente del contacto célula-célula e independiente de citoquinas y se encuentran predominantemente en los órganos linfoides. Su efecto sobre otras células T, directa o indirectamente, se presenta a través de modificaciones de las APCs que pueden resultar en la regulación negativa de la expresión de moléculas coestimuladoras (CD80 y CD86) o moléculas de adhesión, inhibición de la producción y secreción de citoquinas. Así mismo, las modificaciones en las APCs pueden promover anergia, eliminación de la población efectora al promover la muerte celular y conversión de células T efectoras al fenotipo regulador, para que puedan actuar cooperativamente, propagando y reforzando un estado de tolerancia en períodos post-trasplante^{50, 76}. Otro de los rasgos distintivos de las T_regs CD4⁺CD25⁺ naturales es su habilidad para inhibir la proliferación de otras poblaciones de células T mediante el contacto célula-célula, después de ser activadas a través de su TCR, lo cual resulta en inhibición de la producción de IL-2⁵⁰. Este mecanismo no involucra la muerte de estas células y es independiente de IL-4, IL-10 y TGF-β. Las células T CD4⁺CD25⁺ no previenen la activación inicial de las células T respondedoras, de manera que estas últimas sufren una detención del ciclo celular en el estado G₀/G₁ y no proliferan^{76, 77} (Fig. 2).

Fig. 2.- Control de las respuestas de células efectoras por las células T reguladoras. Aunque los mecanismos moleculares por los cuales las células reguladoras ejercen su función todavía están sujetas a estudio y son algo controversiales, los mecanismos sugeridos para las células T reguladoras incluyen: supresión vía mediadores solubles como citoquinas (IL-4, IL-10 y TGF- β), contacto célula-célula (activación a través del TCR y expresión de GITR, CTLA-4 y FOXP3) y modificación de las APCs (expresión baja de moléculas coestimuladoras y moléculas de adhesión, y expresión alta de moléculas inhibidoras ILT3 e ILT4).

Las células T_regs poseen un TCR altamente diverso, por lo cual son potencialmente capaces de reconocer un gran número de antígenos, y adicionalmente presentan alta afinidad hacia los antígenos propios. Durante su generación tímica requieren la combinación de fuertes señales antigénicas para la unión del TCR, así como una máxima coestimulación, de modo que cuando migran a los tejidos periféricos son completamente funcionales. En contraste, el desarrollo en periferia de las células T_regs puede ser facilitado por señales transductoras del TCR alteradas o por baja afinidad hacia antígenos. Esta característica es determinante para que estas células no sean funcionales sin una activación posterior, por exposición repetida a antígenos, tal como ocurre durante una infección crónica, un trasplante de órganos, o por el uso de algunas terapias inmunomoduladoras. Estos eventos contribuyen a la adquisición de un repertorio diverso y expandido como consecuencia de reactividades cruzadas fortuitas con proteínas extrañas⁷⁶. Además, algunos trabajos recientes con células T CD4⁺CD25⁺ humanas, sin discriminar entre subpoblaciones CD4⁺CD25^low y CD4⁺CD25^high, han encontrado que comparten un repertorio complejo y similar al de las células CD4^₊CD25-, y que esto ocurre tanto en las poblaciones circulantes como en las del timo^{78, 79}.
Los primeros reportes de la actividad alorreguladora de las c élulas CD4⁺CD25⁺ murinas, corresponden a observaciones realizadas en cultivos mixtos de linfocitos. En estos experimentos, las células CD4⁺CD25⁺ fueron activadas por células estimuladoras alogénicas y regularon la proliferación de células respondedoras de un tercero no relacionado, indicando que no se requiere de la compatibilidad MHC entre las células reguladoras y efectoras para que ocurra la regulación⁸⁰. En modelos animales, se ha evidenciado también que las células T CD4⁺ provenientes de receptores de injertos con sobrevida a largo plazo pueden transferir tolerancia; fenómeno denominado como tolerancia infecciosa que ha facilitado el entendimiento de la tolerancia a aloinjertos y el papel de la regulación inmune en modelos in vivo^{81, 82}. Del mismo modo, Graca et al. demostraron en un modelo murino la presencia de células T reguladoras en los aloinjertos tolerantes. Este hallazgo fortaleció la idea de que la actividad supresora de estas células no solo estaba limitada a los tejidos donde están presentes los antígenos blanco⁸³.
En modelos murinos hay numerosas evidencias del papel cr ítico de las células T reguladoras en la tolerancia a aloinjertos. En un modelo de trasplante de piel y trasplante de médula ósea en ratones quiméricos se ha demostrado que las células T reguladoras CD4⁺CD25^+, obtenidas a partir de ratones vírgenes, o a partir de ratones tolerizados mediante tratamiento con anticuerpos no depletantes que promueven quimerismo, pueden prevenir el rechazo de aloinjertos de piel aún sin especificidad hacia los antígenos del donante⁸⁴. Igualmente, en otro modelo de aloinjerto cardíaco o aloinjerto de piel bajo incompatibilidad en el MHC clase II, se ha demostrado que la depleción de células T CD25^high disminuye la sobrevida de los aloinjertos y conduce al rechazo de los aloinjertos, en cada caso respectivamente⁸⁵.
Teniendo en cuenta que los diversos trabajos realizados en modelos murinos han permitido establecer un papel esencial de las c élulas reguladoras en el establecimiento e inducción de la tolerancia hacia aloinjertos, se ha propuesto que la aceptación de trasplantes en humanos también está asociada con la regulación inmunológica y que algunas de estas poblaciones celulares podrían influir en el curso del trasplante y la aceptación a largo plazo. En el seguimiento pos-trasplante de pacientes con aloinjerto renal se ha detectado, a partir del tercer mes, la presencia de células con el fenotipo CD4⁺CD25⁺ totales capaces de persistir por algunos años a pesar del uso de inmunosupresión convencional. Este hallazgo ha permitido proponer la existencia de una población de células CD4⁺CD25⁺ específicas de antígeno que estaría suprimiendo la respuesta a los aloantígenos86. Adicionalmente, el estudio a largo plazo de poblaciones periféricas de células CD4⁺CD25⁺ totales ha pretendido evaluar la utilidad de esta población como un marcador del estado de tolerancia inmunológica; y aunque el número absoluto de células CD4⁺CD25⁺ no permite diferenciar pacientes con rechazo agudo de quienes no lo presentan, una disminución en número de esta población sí podría estar relacionada con la aparición de tales procesos⁸⁷.
Mediante citometr ía de flujo, nuestro grupo ha podido evidenciar que los pacientes sobrevivientes a largo plazo al trasplante renal tienen un porcentaje incrementado de células T CD4⁺CD25⁺ totales circulantes comparativamente con pacientes con trasplante renal en proceso de rechazo crónico, pacientes en diálisis o pacientes con sobrevida del aloinjerto a corto plazo. Además, en los pacientes sobrevivientes a largo plazo, estas células exhiben marcadores de activación, lo cual es concordante con el requerimiento de activación de estas células para ser funcionales. Este hallazgo sugiere que el mantenimiento de la función del trasplante podría ser el resultado de un fenómeno de supresión inmune activa en la periferia que determina el no rechazo del trasplante y por lo tanto ejerce un efecto protector⁸⁸. Otro estudio que ha contrastado la expresión de FOXP3 y la presencia de células T CD4⁺CD25^high en pacientes trasplantados renales con rechazo crónico y con tolerancia operacional libre de drogas, ha demostrado que los pacientes con rechazo crónico tienen menos células T CD4⁺CD25^high y ausencia de transcriptos FOXP3 en comparación con pacientes tolerantes e individuos sanos. Estos hallazgos sugieren que, aunque la tolerancia operacional en los pacientes no pudo ser atribuida a un incremento en las células T CD4⁺CD25^high y en los transcriptos FOXP3, una reducción en los pacientes con rechazo crónico permite proponer que la tolerancia clínica operacional puede deberse a un fenómeno de tolerancia natural, que está ausente en estos pacientes⁸⁹.
A pesar de estos hallazgos interesantes, algunos de los cuales no discriminaron entre las subpoblaciones CD4 ⁺CD25^low y CD4⁺CD25^high, aún no es completamente claro si la presencia de poblaciones de células reguladoras en el trasplante clínico podrá emplearse como un marcador para tolerancia a nivel clínico y si podrán superarse las diversas limitaciones del trabajo en humanos. Además, serían muchas las consideraciones éticas que conllevaría pasar de la evaluación de estas poblaciones en sangre a los tejidos, en los cuales estarían directamente ejerciendo su actividad supresora y cuya caracterización podría revelar de manera más segura el establecimiento de tolerancia clínica⁹⁰.

¿Son clínicamente relevantes las células T_reg CD4⁺CD25^high?

Aunque hasta el momento los progresos en el área de la inmunología de los trasplantes son numerosos, varios problemas permanecen sin resolver en torno al diseño racional de fármacos inmunosupresores y nuevas formas de inducir tolerancia en humanos. En la actualidad el concepto de que las poblaciones de células reguladoras son determinantes para mantener la homeostasis de la respuesta inmune es de gran aceptación entre inmunólogos. El desafío seguirá siendo entender los mecanismos involucrados en la regulación inmune y hallar una forma segura de manipular estas poblaciones para aumentar su número y actividad en los pacientes trasplantados, permitiendo así trasladar protocolos de tolerancia desde modelos animales hasta una fórmula efectiva en humanos, disminuyendo la posibilidad de rechazo y mejorando la calidad de vida del paciente trasplantado.

Agradecimientos: Este trabajo ha sido parcialmente financiado por la Fundación para la Promoción de la Investigación y la Tecnología (Bogotá, Colombia) (Proyecto N° 2128).

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Recibido: 19-01-2007
Aceptado: 5-06-2007