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Medicina (Buenos Aires)

versión impresa ISSN 0025-7680versión On-line ISSN 1669-9106

Medicina (B. Aires) v.68 n.4 Ciudad Autónoma de Buenos Aires jul./ago. 2008

 

Diagnóstico de polineuropatía amiloidótica familiar tipo I en la Argentina

Gladys Pérez1, María Cristina Romero1, 2, Pedro Trigo2, Javier Lendoire2, Oscar Imventarza2, Alcira Nesse1

1Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires;
2
Laboratorio Central y Unidad de Trasplante Hepático, Hospital General de Agudos Dr. Cosme Argerich, Buenos Aires

Dirección postal: Dra. Gladys Pérez, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Ciudad Universitaria, 1428 Buenos Aires, Argentina Fax: (54-11)4576-3342  e-mail: gperez@qb.fcen.uba.ar

Resumen
La polineuropatía amiloidótica familiar (PAF) es un tipo de amiloidosis hereditaria. Constituye un desorden autosómico dominante caracterizado por el depósito sistémico de material amiloide en tejidos  especialmente en nervios periféricos. El principal componente del amiloide es una variante mutada de la transtiretina (TTR), proteína transportadora de tiroxina y retinol. Han sido descriptas numerosas mutaciones en el gen TTR que causan alteración de la secuencia primaria de la proteína. La PAF portuguesa o PAF Tipo I se origina por la variante TTR Val30Met en la cual una valina en posición 30 es reemplazada por una metionina. Es fundamental la identificación temprana de portadores de la mutación porque una vez declarada la enfermedad el único tratamiento efectivo es el trasplante hepático, órgano de síntesis de la TTR. La PAF Tipo I ha sido muy estudiada en la Argentina debido al hallazgo de un área endémica donde habitan familias descendientes de inmigrantes portugueses. El presente trabajo ha sido enfocado a resolver la necesidad diagnóstica de la comunidad, ya que la ausencia de una metodología apropiada en nuestro país ha impedido, hasta ahora, que individuos con antecedentes familiares de PAF puedan tener un diagnóstico precoz y acceder al trasplante hepático temprano. En consecuencia, nuestro objetivo fue optimizar una metodología para detectar la mutación Val30Met adaptando técnicas previamente descriptas. La fiabilidad, sencillez y rapidez en la obtención de los resultados, así como el requerimiento de pequeño volumen de muestra, hacen que la técnica desarrollada en este trabajo sea una herramienta apropiada para procedimientos de screening, permitiendo contar con un marcador preclínico de la enfermedad.

Palabras clave: Transtiretina; Polineuropatía amiloidótica familiar; Mutación TTR Val30Met

Abstract
Diagnosis of familial amyloid polyneuropathy type I in Argentina.
Familial amyloid polyneuro- pathy (FAP) is an autosomal dominant inherited disease, characterized by systemic deposition of amyloid fibrils in various tissues, especially in peripheral nerves, being a variant of transthyretin (TTR) the principal component of amyloid fibrils. TTR is a normal plasma protein (previously called prealbumin) that functions as a transport protein binding tiroxine and retinol. Among many mutations that have been found in the TTR gene, the variant with a single amino acid substitution of methionine for valine at position 30 (TTR Val30Met) is the responsible of the Portuguese-type Familial Amyloidotic Polyneuropathy (FAP Type I). Interest in this pathology has arisen in Argentina because of the finding of an endemic area where a group of Portuguese immigrant families is localized. Since liver transplantation is a widely accepted treatment because it results in the disappearance of variant transthyretin from plasma, an early detection of the altered gene is essential. Thus, the objective of the present work was to optimize a methodology to detect the Val30Met mutation introducing modifications into techniques that were previously developed. The simple method here described is useful to confirm the diagnosis of the potential disease and, therefore, make it possible for patients to gain access to early liver transplantation.

Key words: Transthyretin; Familial amyloidotic polyneuropathy; TTR Val30Met mutation

El término amiloidosis define a un grupo de enfermedades caracterizadas por la formación de depósitos extracelulares de proteínas fibrilares. Algunas de estas enfermedades son localizadas mientras que otras son sistémicas, las cuales a su vez pueden ser esporádicas, secundarias a otras condiciones o hereditarias.
La polineuropatía amiloidótica familiar (PAF) constituye el tipo más prevalente de amiloidosis sistémica hereditaria. Es una enfermedad autosómica dominante, progresiva, invalidante y fatal que se caracteriza por el depósito de material amiloide en diversos tejidos, especialmente en nervios periféricos1.
El principal componente del amiloide es una variante mutada de la proteína transtiretina (TTR)2, cuya función biológica normal es la de transportar tiroxina y retinol en plasma. Esta proteína, antes conocida como prealbúmina, es un tetrámero compuesto por cuatro subunidades idénticas asociadas en forma no covalente. Cada monómero consta de 127 aminoácidos y su masa molecular es de, aproximadamente, 14 kDa3-5.
Han sido descriptas varias isoformas no patológicas de TTR6,7, pero se han identificado alrededor de 100 mutaciones que dan origen a variantes de TTR asociadas a amiloidosis en humanos1,8. Con excepción de Val122Ile, que es el resultado de una deleción en el exón 4, todas las variantes descriptas hasta ahora provienen de mutaciones puntuales que tienen como consecuencia la sustitución de un aminoácido en la cadena proteica9.
La variante patogénica de TTR se encuentra en circulación y forma placas proteicas por mecanismos todavía no bien conocidos. Es probable que las sustituciones en la estructura primaria de la molécula induzcan cambios conformacionales que desestabilicen a la proteína provocando su agregación. El crecimiento de estos agregados proteicos daría por resultado una estructura fibrilar plegada (material amiloide) que se deposita en los tejidos, causando disfunción orgánica y conduciendo, finalmente, a la muerte. Es así que las variantes de TTR constituyen marcadores bioquímicos de PAF. Más aún, estas proteínas mutadas pueden ser consideradas marcadores preclínicos de la enfermedad, ya que pueden ser detectadas no sólo en los pacientes con manifestaciones clínicas asociadas a PAF, sino también en sus familiares, transportadores asintomáticos, quienes padecen el riesgo de desarrollar la enfermedad y/o transmitirla a sus descendientes.
Una de las variantes más frecuentes de TTR es la que posee una sustitución del aminoácido valina por metionina en la posición 30 (Val30Met) y es característica de la PAF Portuguesa o PAF tipo I10. Inicialmente, este tipo de PAF ha sido demostrada en tres áreas endémicas restringidas a Oporto en Portugal, Skelleftea en Suecia y Arao y Ogawa en Japón11. En la Argentina, esta variante ha sido estudiada debido a su detección en un grupo de familias descendientes de inmigrantes portugueses que habitan en la localidad de 25 de Mayo de la provincia de Buenos Aires12, 13.
La PAF tipo I se manifiesta, generalmente, entre los 25 y 35 años y es acompañada por polineuropatía progresiva seguida de disfunción cardíaca e insuficiencia renal. Estos signos fueron inicialmente descriptos por Andrade (1952)14 en familias del norte de Portugal. Otras manifestaciones típicas incluyen pérdida de sensibilidad en la piel de las manos, aumento de la motilidad intestinal con diarrea y malnutrición, proteinuria y dificultad para caminar15. Estas y otras complicaciones relacionadas con neuropatía autonómica conducen al desenlace fatal entre los 7 y 10 años luego de declarada la enfermedad16,17.
Desde el punto de vista terapéutico, se han realizado experiencias con plasmaféresis e inmunoadsorción de TTR en un número restringido de pacientes, pero no existen evidencias definitivas de un aporte terapéutico exitoso18. También se están analizando moléculas que estabilicen la TTR Val30Met en un intento por detener su depósito como material amiloide19. En la actualidad, el único tratamiento definitivo lo constituye el trasplante hepático, el cual comenzó a ser utilizado en Suecia en 199020, 21.
La mayor parte de la TTR (98%) es sintetizada en el hígado y una pequeña proporción proviene del plexo coroideo, intestino delgado, páncreas, pituitaria y epitelio de la retina ocular22-24. A pesar de constituir el mayor sitio de síntesis, el hígado no parece estar macroscópicamente dañado en pacientes con PAF25, ya que si bien se hallan depósitos de material amiloide, la función hepática no se encuentra alterada1. El fundamento de la terapéutica exitosa mediante el trasplante hepático consiste en eliminar la mayor fuente de producción de la proteína mutada. Al sustituir el hígado por otro órgano que no posee alteraciones en el gen TTR, se sintetiza la proteína normal y, por lo tanto, no progresa el depósito de amiloide.
Debido a la importancia del trasplante hepático como único tratamiento disponible y a la necesidad de evitar el deterioro físico del paciente, resulta fundamental realizar la detección temprana de los portadores de una mutación en el gen TTR. La importancia del diagnóstico y trasplante precoz reside en que muchas de las lesiones causadas por la enfermedad no retrogradan a pesar de la síntesis de TTR normal con el hígado implantado26.
Hasta el momento no se disponía en nuestro país de una metodología apropiada para la detección de la mutación Val30Met. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método que resolviera esta necesidad diagnóstica. A través de nuestra investigación y en base a técnicas previamente utilizadas por otros investigadores27, 28, hemos optimizado un método simple, basado en la técnica de Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (Restriction Fragment Lenght Polimorfism, RFLP) luego de la amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR) de un fragmento del gen TTR. La metodología desarrollada fue empleada en estudios familiares para identificar portadores de la mutación Val30Met característica de PAF tipo I, la cual presenta elevada prevalencia en nuestro país.

Materiales y métodos

En el Departamento de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA), fueron analizadas muestras de 37 posibles portadores de la mutación Val30Met derivados por el Servicio de Trasplante Hepático del Hospital General de Agudos Dr. Cosme Argerich. De ellos, 19 individuos pertenecen a 3 generaciones de una misma familia (Familia I) y son descendientes directos de una persona de origen portugués que desarrolló PAF tipo I (JD). La paciente AP perteneciente a la primera generación de dicha familia, se encontraba al momento del análisis en una etapa avanzada de la enfermedad, requiriendo apoyo para caminar, estadio que coincide con el score IIIB de la clasificación de Suhr et al29. Esta paciente, de 49 años, tenía contraindicado el trasplante hepático por lo avanzado de la enfermedad. La población analizada de la segunda generación incluyó 9 mujeres y 5 varones (rango de edad: 16-33 años) y de la tercera generación 3 mujeres y un varón (rango de edad: 13-22 años). Ninguno de los individuos estudiados de la segunda y tercera generación de esta familia presentaba, al momento del estudio, manifestaciones clínicas de PAF (estadio 0).
Otros 16 pacientes que conforman el grupo en estudio son integrantes de una familia no relacionada con la anterior (Familia II). Pertenecen a dos generaciones, la primera de las cuales está constituida por hermanos descendientes de la misma madre. Uno de ellos (HP) mostraba al momento del estudio manifestaciones coincidentes con el score IIIA29.
Además, fueron analizados dos pacientes de los cuales no existen hasta la actualidad evidencias que permitan relacionarlos con ninguna de las dos familias anteriormente mencionadas.
Como controles, fueron incorporados al estudio individuos que no presentaban manifestaciones clínicas ni antecedentes familiares de la enfermedad. El estudio cuenta con la aprobación del Comité de Etica del Hospital Dr. Cosme Argerich y el consentimiento de los pacientes e individuos controles.
Se extrajeron muestras de sangre con anticoagulante. Inmediatamente se realizaron las pruebas bioquímicas y una alícuota fue conservada a -20°C para su posterior análisis por técnicas de biología molecular.
Se realizaron determinaciones bioquímicas en suero para evaluar la función renal y hepática de los individuos en estudio. Se utilizó un autoanalizador Hitachi 917 (Boehringer Mannheim Diagnostica, EE.UU.), con calibradores, controles y reactivos Roche Diagnostica GmbH, Alemania. El Laboratorio Central del Hospital General de Agudos Dr. Cosme Argerich se encuentra incorporado al Programa de Control de Calidad Externo Buenos Aires-CEMIC (República Argentina).

Se efectuaron:
a) Pruebas de la función renal: urea por test cinético UV, creatinina por método cinético basado en la reacción de Jaffé y ácido úrico por test enzimático.
b) Pruebas de la función hepática: colesterol (colesterol lCHOD-PAP), bilirrubina total (Bilirrubina DPD), bilirrubina directa (JENDRASSIK-GROF), proteinas totales por test colorimétrico basado en la reacción de biuret, albúmina por método BCG, aspartato-aminotransferasa (AST) mediante AST IFCC sin activación por piridoxalfosfato, alanino-aminotransferasa (ALT) por ALT IFCC sin activación por piridoxalfosfato, fosfatasa alcalina (ALP) por método optimizado, utilizando buffer DEA, gamma-glutamiltranspeptidasa (γGT) por método gamma-glutamiltransferasa líquida.

Por otra parte, se realizó el estudio genético para investigar la presencia de la mutación Val30Met. La metodología utilizada se describe a continuación:

a) Extracción de ADN

A una alícuota de 500 µl de sangre entera anticoagulada se agregó, aproximadamente, 1 ml de solución de lisis de eritrocitos (buffer TE: Tris 10 mmol/l, EDTA 1 mmol/l, pH 8). Luego de homogeneizar, se centrifugó a 17000 g durante 2 min a 20 °C. El sobrenadante fue descartado y se repitieron los lavados hasta eliminar totalmente las trazas de hemoglobina, la cual posee un efecto inhibitorio sobre la reacción de amplificación en la técnica de PCR30.
El pellet fue suspendido en solución de lisis nuclear (Tris 10 mmol/l, KCl 50 mmol/l, MgCl2 2.5 mmol/l, Tween 20 0.5%, pH 9). Se agregó proteinasa K en concentración final de 0.1 mg/ml y se incubó durante la noche en baño de agua a 56 °C.
La concentración de ADN fue estimada midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) y considerando que una unidad de A260 corresponde a una concentración de 50 µg/ml. El grado de purificación del ADN obtenido fue determinado a través del índice A260/A280 (relación entre ADN/proteína)31.

b) Amplificación del ADN genómico

Un fragmento de 362 pares de bases comprendiendo al exón 2 del gen TTR5, fue amplificado por PCR (Mastercycler gradient, Eppendorf) a partir de un volumen conteniendo 0.5-1.0 µg de ADN genómico.
Las secuencias de los primers utilizados (Invitrogen Life Technologies), de acuerdo a Date et al27, se indican a continuación:
Forward 5' - ATT GTC GAC ACT TAC GTT CCT GAT
Reverse 5' - TTC TTT AGC AGA TGA TGT GAG CCT
Luego de una desnaturalización inicial de 5 min a 94 °C, se desarrollaron 30 ciclos de amplificación (94 °C por 30 s, 63 °C por 40 s y 72 °C por 1 min) y una última etapa de elongación durante 8 min a 72 °C.
La longitud del fragmento amplificado fue analizada por electroforesis en gel de agarosa conteniendo bromuro de etidio.

c) Análisis de restricción de los productos amplificados

Una alícuota del producto de amplificación fue digerida con 5 U de la endonucleasa de restricción Nsi I (Invitrogen Life Technologies), incubando a 37 °C durante toda la noche para garantizar una digestión completa27, 28.
El producto de la reacción de digestión fue sometido a electroforesis en gel de agarosa 2% (p/v) con bromuro de etidio. El tamaño de las bandas observadas fue determinado por comparación con las del marcador de pares de bases  (Biodynamics SRL) por observación en transiluminador.

Resultados

Las Tablas 1 y 2 muestran los resultados de las pruebas de laboratorio realizadas para evaluar la función renal y hepática de los individuos en estudio (n=37).

TABLA 1.- Evaluación de la función renal del grupo en estudio

TABLA 2.- Evaluación de la función hepática del grupo en estudio

(*): ver explicación en el texto

Los valores de las determinaciones bioquímicas descriptivas de la función renal se encontraron dentro del rango de referencia, con una excepción. La paciente AP perteneciente a la primera generación de la Familia I, única en estadio avanzado de la enfermedad, presentó alteración de la función renal con valores de urea y creatinina elevados.
La mayoría de los valores de las pruebas de laboratorio practicadas para describir la función hepática se encontraron dentro del rango de referencia, con algunas excepciones que presentaron valores aumentados de AST (3/37), ALT (2/37) y bilirrubina (1/37).
Con respecto a la ALP (Tabla 2, *), los adolescentes de entre 13 y 18 años (n=6) presentaron niveles ubicados dentro de los rangos de referencia, ya que los valores límites correspondientes a la metodología utilizada son 930 U/l para los varones y 440 U/l para las mujeres (Manual de Procedimientos Autoanalizador Hitachi 917). Entre los sujetos mayores a 18 años, 7/31 mostraron valores de ALP superiores al rango de referencia (hasta 250 U/l).
No se encontraron asociaciones entre las observaciones clínicas y los datos bioquímicos fuera del rango de referencia.
Los índices de purificación (relación ADN/proteínas) obtenidos con la metodología de extracción de ADN empleada, variaron entre 1.3 y 1.5. Estos valores son inferiores a lo recomendado (≥ 1.7), indicando una concentración de proteínas residuales mayor a lo sugerido como óptimo. Sin embargo, este factor no interfirió con el proceso de amplificación, siendo el producto obtenido a partir de este material adecuado para la detección de la mutación Val30Met. Por lo tanto, y teniendo en cuenta la sencillez de la técnica de extracción, no fue necesario realizar etapas adicionales para incrementar el grado de pureza del ADN.
La Figura 1 representa esquemáticamente al gen TTR y resume el fundamento de la técnica utilizada para la detección de la presencia de la mutación Val30Met.


Fig. 1.- Esquema del gen TTR y detección de la mutación Val30Met.
El fragmento que comprende la secuencia de ADN en la que se produce la mutación característica de PAF tipo I, posición 1679, es amplificado por PCR.
Cuando se produce la mutación puntual, una G es reemplazada por una A, generando un sitio de corte reconocido por la enzima de restricción Nsi I. La secuencia normal no posee dicho sitio de corte.

El fragmento de 362 pb amplificado por PCR abarca la secuencia de ADN entre las posiciones 1464 a 1825 del gen TTR. La mutación puntual que caracteriza a la PAF tipo I es una sustitución en la posición 1679 (G es reemplazada por A). En el ADN con la secuencia normal no existe ningún sitio de corte para la enzima de restricción Nsi I. Sin embargo, cuando la secuencia está mutada, se genera un sitio de corte para la enzima, originándose dos fragmentos de 216 y 146 pares de bases como consecuencia de la digestión del producto de amplificación.
En el marco de la estandarización y control de calidad de la metodología desarrollada, se utilizaron diferentes condiciones para realizar la amplificación del ADN genómico y su posterior digestión:
a) Fueron ensayadas diferentes temperaturas de apareamiento de los primers, observándose mayor nivel de amplificación cuando el procedimiento fue desarrollado a 63 °C.
b) Se analizaron diferentes masas iniciales de ADN en un rango de 0.5 a 8.0 µg/50 µl de volumen final de reacción, encontrándose una relación inversa entre la cantidad del producto de amplificación obtenido y la masa inicial de ADN, cualquiera fuera la temperatura de apareamiento de primers utilizada. En base a los resultados obtenidos se seleccionó el rango comprendido entre 0.5 y 1.0 µg como masa de ADN óptima de trabajo.
c) Se ensayaron distintas concentraciones de la enzima de restricción. Los resultados obtenidos con 5 o 10 U de Nsi I, en un volumen final de reacción de 25 µl, fueron similares. Por lo tanto, se decidió emplear 5 U de la enzima en el protocolo final.
En la Figura 2 se observan las bandas obtenidas en el análisis electroforético de los productos de amplificación por PCR (líneas A y C) y de digestión con la enzima de restricción Nsi I (líneas B y D) a partir del ADN extraído de un individuo control (líneas A y B) y de otro previamente diagnosticado como portador de la mutación Val30Met (líneas C y D)13.


Fig. 2.- Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación por PCR y digestión con Nsi I.
Los productos de amplificación por PCR (líneas A y C) y posterior digestión con la enzima de restricción Nsi I (líneas B y D) del ADN de un individuo control negativo (líneas A y B) y de otro portador de la mutación Val30Met (líneas C y D), fueron analizados en gel de agarosa 2% conteniendo bromuro de etidio.
La digestión con Nsi I originó fragmentos de 216 y 146 pb en la muestra del portador de la mutación (línea D) mientras que no modificó el fragmento amplificado de 362 pb del control negativo (línea B).

El tamaño de los fragmentos obtenidos en cada caso fue determinado mediante un marcador de número de pares de bases (M). Comparando las bandas de las líneas A y B puede observarse que el fragmento de 362 pb producto de la reacción de PCR no fue cortado por la enzima de restricción, indicando ausencia de la mutación puntual. En cambio, en la línea D aparecen dos fragmentos de 216 y 146 pb como productos de la digestión con Nsi I, demostrando la presencia de la sustitución G→A en el paciente con PAF tipo I. La coexistencia del fragmento de 362 pb con los de 216 y 146, demuestra que el individuo es heterocigota para la mutación Val30Met.
Una vez estandarizado el método y controlado frente a los respectivos controles positivo y negativo, fue aplicado al estudio de integrantes de grupos familiares con historia previa relacionada con PAF tipo I.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo, en conjunto con los de los estudios previos realizados en Suecia13, permitieron construir las historias familiares de ambos grupos afectados con PAF tipo I, las cuales se esquematizan en la Figura 3 (A y B).

Fig. 3.- Historia familiar de amiloidosis portuguesa
A: integrantes de la Familia I. B: integrantes de la Familia II.
Los círculos indican sexo femenino y los cuadrados, masculino.
JD presentó manifestaciones clínicas de PAF y falleció como consecuencia de la enfermedad sin habérsele realizado el estudio genético.

Los miembros de la Familia I (Figura 3A) son descendientes de una inmigrante portuguesa (JD) que tuvo manifestaciones clínicas de la enfermedad y falleció como consecuencia de la misma antes de que en nuestro país se empleara el trasplante hepático como tratamiento para PAF. Como se indica en la Figura, cinco de los miembros de la segunda generación habían sido diagnosticados previamente como portadores de la variante Val30Met. Cuatro de ellos (OD, ND, SD y MD), presentaron signos de PAF tipo I por lo que fueron sometidos a trasplante hepático. Con el objeto de utilizar la detección de la mutación Val30Met como marcador preclínico de la enfermedad, en nuestro laboratorio se estudiaron individuos jóvenes de esta familia para identificar a los portadores asintomáticos (PF, HF, RD, FD, MD, CD, AD, SD, DA y JA).
Entre los miembros de la Familia II (Figura 3B), se diagnosticó la mutación en el paciente que mostraba signos clínicos de PAF tipo I (HP), como así también en cinco de sus hermanos (JP, LA, JA, MA y RA) y en tres integrantes de la segunda generación (JG, MG y MV). Aunque no se dispone de información de la historia clínica de la madre, ya fallecida, ni de sus cónyuges, los resultados obtenidos en nuestro análisis sugieren el origen materno de la herencia de la mutación Val30Met.
Finalmente, la mutación fue también detectada en los otros dos pacientes analizados (JL y CA) de los cuales no existen al momento indicios que permitan establecer su parentesco con ninguno de los dos grupos familiares estudiados en el presente trabajo.

Discusión

La PAF es un tipo de amiloidosis hereditaria en la cual mutaciones en el gen que codifica para TTR producen alteración en la secuencia de la proteína1. En su informe inicial, Costa et al 2 mostraron evidencias que permitían sugerir la asociación entre TTR y el componente principal de las fibrillas amiloides depositadas en tejidos de pacientes de origen portugués que presentaban signos de polineuropatía. Esa proteína fue identificada como una variante de TTR, en cuya estructura primaria un residuo valina en la posición 30 es reemplazado por metionina (TTR Val30Met)32. Si bien esta mutación en la TTR es la más frecuente entre los pacientes afectados de PAF, en la actualidad se conocen muchas otras variantes derivadas de distintas mutaciones puntuales en el gen TTR.
El trasplante hepático como tratamiento definitivo para la PAF fue propuesto por Holmgren et al en 1991 como forma de detener la síntesis de TTR anormal20. Tras el trasplante, se ha constatado un acusado descenso de la proteína mutada y, en general, una evolución favorable del cuadro clínico, con mejoría progresiva de las manifestaciones neurológicas y la función normal del injerto24, 33, 34. Por lo tanto, es fundamental la identificación de individuos portadores de la mutación genética asociada a esta enfermedad antes de que se establezcan serias complicaciones neurológicas. El tratamiento está especialmente indicado en pacientes jóvenes, portadores de la variante más prevalente en nuestro país (TTR Val30Met), cuando aún presentan síntomas leves35. Por esta razón, el objetivo de nuestro laboratorio fue desarrollar un método apropiado para detectar la mutación Val30Met.
Para investigar la presencia de variantes de TTR en sangre y tejidos han sido empleados diferentes métodos, basados en análisis por espectrometría de masa34,36, electroforesis37, 38 e immunoblotting39. La técnica de ESI-MS (electrospray ionization mass spectrometry) permite determinar variantes de la proteína en base a las pequeñas diferencias de tamaño que presentan las isoformas de TTR. Esta metodología requiere de etapas previas para el aislamiento de la proteína. La TTR es aislada a partir de sangre por inmunoprecipitación, y el complejo antígeno-anticuerpo disociado por centrifugación a través de membranas de cut off definido34, o bien la TTR es extraída de plasma empleando una resina de inmunoafinidad36. En otros trabajos, la TTR sérica nativa fue separada de varias isoformas mutadas por un procedimiento en dos etapas: electroforesis en gel de poliacrilamida nativo y posterior análisis de la banda correspondiente a la TTR por isoelectroenfoque bajo condiciones parcialmente desnaturalizantes37. Altland et al38 desarrollaron un método, basado en la técnica de isoelectroenfoque, sensible a las diferencias de estabilidad de las formas tetramérica y monomérica de algunas variantes de TTR. De esta manera, resulta especialmente apropiado para estudiar mutaciones en las que las sustituciones son indetectables por técnicas de separación basadas en diferencias de carga eléctrica. Saraiva et al39 identificaron la presencia de TTR Val30Met en suero mediante una secuencia de etapas que incluye aislamiento de la proteína por cromatografía, clivaje con bromuro de cianógeno e identificación de los péptidos resultantes por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), electrotransferencia y reacción inmunológica empleando antisuero anti-TTR.
Por otra parte, las mutaciones del gen TTR han sido investigadas por análisis de ADN. Los ensayos están basados en la amplificación de regiones codificantes para la proteína empleando PCR y el análisis de los productos de digestión obtenidos con enzimas de restricción. En la metodología descripta por Nichols y Benson28, el ADN genómico es obtenido a partir de leucocitos periféricos, requiriendo elevados volúmenes de sangre (30 ml).
El método optimizado en nuestro laboratorio permite detectar la presencia de la mutación Val30Met utilizando la técnica de PCR-RFLP. La fiabilidad, sencillez y rapidez en la obtención de los resultados, así como el requerimiento de pequeño volumen de sangre entera, hacen de esta técnica una herramienta apropiada para ser utilizada en procedimientos de screening en gran número de individuos. De esta manera, a través de estudios familiares, la variante TTR Val30Met puede constituir un marcador bioquímico diagnóstico de PAF en la etapa preclínica de la enfermedad.
El método desarrollado ofrece las siguientes ventajas con respecto a otros similares publicados: a) la extracción de ADN se realiza a partir de sangre entera anticoagulada y b) para el ensayo se emplea un pequeño volumen de muestra (500 µl), el cual provee una cantidad de ADN suficiente para repetir los análisis, o bien, para encarar el estudio de otras mutaciones. Esto hace que la metodología resulte sencilla y rápida, dado que no se necesita el aislamiento previo de los leucocitos periféricos ni realizar pasos adicionales de purificación del material genético. Si bien este método es apropiado para el estudio de los miembros de familias en las que se conoce o sospecha una determinada mutación, puede ser aplicado para la detección de otras mutaciones si se emplea una batería de enzimas de restricción, tal como ha sido informado por otros autores28, 37.
En la Argentina, se han identificado varios grupos familiares con antecedentes de PAF tipo I12, 13, relacionados, en general, con inmigrantes portugueses. De hecho, en la Unidad de Trasplante Hepático del Hospital General de Agudos Dr. Cosme Argerich, los casos de polineuropatía amiloidótica familiar constituyen el 6% de todas las indicaciones de trasplante hepático40. Algunos de esos pacientes habían sido diagnosticados como portadores de la mutación TTR Val30Met, estudios que fueron realizados en Suecia y EE.UU.13. La carencia de una metodología apropiada impidió que los individuos pertenecientes a sus grupos familiares pudieran tener un diagnóstico precoz y, así, acceder a un tratamiento de trasplante hepático temprano. De hecho, algunos miembros de la primer familia estudiada no pueden ser trasplantados actualmente debido al grado avanzado de la enfermedad. El impacto del presente estudio reside en la posibilidad de contar con un marcador preclínico de la enfermedad hasta ahora no desarrollado en nuestro país.
La técnica descripta posibilita resolver la necesidad diagnóstica en un importante número de miembros de la comunidad, número que continúa en aumento debido a la relativamente alta prevalencia de la PAF tipo I en Argentina.
Esto redunda en beneficio de los pacientes portadores de la mutación Val30Met, ya que el creciente riesgo que involucra el trasplante en individuos en estadios avanzados de la enfermedad, enfatiza la necesidad de realizar el trasplante en forma temprana, mientras la sintomatología es aún leve y el estado nutricional es satisfactorio.
En conclusión, podemos afirmar que el desarrollo de la metodología descripta para detectar la mutación Val30Met de la TTR, constituye un avance importante para el diagnóstico de la PAF tipo I, la amiloidosis de mayor prevalencia en la Argentina.
La identificación temprana de los portadores de esta mutación permite que estos individuos puedan acceder al trasplante hepático antes de que se establezcan serias complicaciones neurológicas. Por otra parte, se otorga a los familiares no portadores de la mutación la posibilidad de descartar el riesgo de desarrollar la enfermedad y/o transmitirla a sus descendientes. En ambos casos, se logra mejorar la calidad de vida de los miembros de la comunidad.

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Recibido: 19-09-2007
Recibido: 8-05-2008

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