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Medicina (Buenos Aires)

versión On-line ISSN 1669-9106

Medicina (B. Aires) v.68 n.5 Ciudad Autónoma de Buenos Aires sep./oct. 2008

 

Trypanosoma cruzi: Transporte de metabolitos esenciales obtenidos del hospedador

Claudio A. Pereira1, Carolina Carrillo2, Mariana R. Miranda1, León A. Bouvier1, Gaspar E. Cánepa1

1Laboratorio de Biología Molecular de Trypanosoma cruzi, Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo P. Lanari, (UBA-CONICET) Facultad de Medicina;
2Fundación Instituto Leloir, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, (UBA-CONICET), Universidad de Buenos Aires

Dirección postal: Dr. Claudio A. Pereira, Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari, Combatientes de Malvinas 3150, 1427 Buenos Aires, Argentina Fax: (54-11) 4514-8708 e-mail: cpereira@mail.retina.ar

Resumen
El Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas, endémica en Argentina y en toda América Latina. Presenta numerosas características metabólicas diferenciales respecto a sus hospedadores insectos y mamíferos. Algunas de estas diferencias fueron consecuencia de millones de años de adaptación al parasitismo en los cuales estos organismos protozoarios reemplazaron, a lo largo de su evolución, muchas rutas metabólicas de biosíntesis por sistemas de transporte de metabolitos desde el hospedador. En esta revisión se describen los avances en el conocimiento de los sistemas de transporte tanto bioquímicos como también de las moléculas involucradas en dichos procesos. Se aborda con especial énfasis los transportadores de aminoácidos y poliaminas de T. cruzi de la familia AAAP (Amino Acid/Auxin Permeases) ya que parece ser exclusiva de los tripanosomátidos. Teniendo en cuenta que estas moléculas se encuentran completamente ausentes en mamíferos podrían ser consideradas como potenciales blancos contra el Trypanosoma cruzi.

Palabras clave: Trypanosoma cruzi; Mal de Chagas; Aminoácidos; Poliaminas; Transportadores; Permeasas

Abstract
Trypanosoma cruzi: Transport of essential metabolites acquired from the host.
Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas disease, a disease endemic not only in Argentina but also in all of Latinamerica. T. cruzi presents several metabolic characteristics which are completely absent in its insect vectors and in mammalian hosts. Some of these differences were acquired after millions of years of adaptation to parasitism, during which this protozoan replaced many biosynthetic routes for transport systems. In the present review, we describe the advances in the knowledge of T. cruzi transport processes and the molecules involved. In particular, we focus on aminoacid and polyamine transporters from the AAAP family (Amino Acid/Auxin Permeases), because they seem to be exclusive transporters from trypanosomatids. Taking into account that these permeases are completely absent in mammals, they could be considered as a potential target against Trypanosoma cruzi.

Key words: Trypanosoma cruzi; Chagas disease; Aminoacids; Polyamines; Transporters; Permeases

Aspectos generales del Trypanosoma cruzi y su relación con el transporte de metabolitos

Según los datos del Instituto Nacional de Parasitología Dr. Mario Fatala Chabén (http://www.fac.org.ar/fec/chagas/fatala/), en la Argentina existen aproximadamente 2.3 millones de personas infectadas con T. cruzi. Por otro lado, luego de programas sanitarios de control de la enfermedad en los países del Cono Sur (Argentina, Bolivia, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay), la OMS anunció la interrupción de la transmisión de la enfermedad de Chagas en diferentes períodos: Uruguay en 1997, Chile en 1999 y Brasil en 20011. A pesar de esto, se han registrado brotes recientes de la enfermedad, por ejemplo en marzo de 2005 en el estado de Santa Catarina, Brasil2.
En la actualidad, las posibilidades de tratamiento quimioterapéutico de la enfermedad de Chagas se restringen básicamente a tratamientos sintomáticos ya que sólo se cuenta con dos drogas de limitada efectividad, desarrolladas hace más de tres décadas3. La identificación y caracterización de nuevas rutas metabólicas en los parásitos, con especial énfasis en aquellas que se encuentran ausentes en mamíferos, son el primer paso en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que complementen las indispensables políticas sociales y de vigilancia sanitaria. Algunas moléculas que cumplen con los requisitos mencionados se encuentran asociadas a los procesos de transporte y al metabolismo energético de los parásitos.
Los organismos denominados genéricamente tripanosomátidos pertenecen a la familia Trypanosomatidae, la cual incluye protozoarios parásitos de gran importancia sanitaria. En nuestro país, y en las Américas en general, el más relevante de esta familia es el Trypanosoma cruzi ya que es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas. A su vez, en Africa el Trypanosoma brucei es responsable de la enfermedad del sueño, mientras que parásitos del género Leishmania causan diferentes enfermedades en el cinturón del trópico4. Estos tres parásitos comparten diversas características comunes que en muchos casos son exclusivas de esta familia como algunos grupos de transportadores de metabolitos5.
El género Trypanosoma tuvo su origen hace 600 millones de años y probablemente los primeros hospedadores de estos parásitos primitivos fueron insectos del género Hemiptera, al cual pertenece la vinchuca. Comenzaron a infectar mamíferos primitivos desde hace 150 millones de años y los primeros humanos hace 15,000-20,000 años6, 7, 8. En tantos millones de años de adaptación al parasitismo estos organismos protozoarios reemplazaron, a lo largo de su evolución, muchas rutas metabólicas de biosíntesis por sistemas de transporte de metabolitos esenciales que adquieren desde el medio extracelular del hospedador. En consecuencia, en muchas vías metabólicas la disponibilidad intracelular de sustratos e intermediarios depende únicamente de esos procesos de transporte. Esto los hace mecanismos fundamentales para la supervivencia del parásito y convierte a las moléculas involucradas en potenciales blancos terapéuticos.
El ciclo vital del Trypanosoma cruzi es conocido desde hace ya casi un siglo9. La infección de los mamíferos hospedadores ocurre cuando el vector infectado, el triatomineo, se alimenta de un hospedador vertebrado y después de succionar la sangre el vector defeca los parásitos infectantes (tripomastigotes metacíclicos). El prurito causado por la lesión cutánea de la picadura facilita el contacto de los parásitos con la lesión y se produce así la infección. Otras vías de infección son a través de las mucosas bucal y conjuntiva10. Los tripomas-tigotes metacíclicos invaden células de varios tejidos, donde se diferencian a amastigotes, los cuales tienen ciclos de división binaria. Una porción de los amastigotes se diferencian a tripomastigotes, que luego retornan al torrente sanguíneo por la lisis de la célula hospedadora. Los tripomastigotes sanguíneos pueden infectar otras células o bien ser ingeridos por el insecto vector durante la picadura al hospedador. En el intestino medio del insecto los tripomastigotes sanguíneos se diferencian a epimastigotes, que son la forma replicativa y no infecciosa dentro del insecto, y a lo largo del tracto digestivo se diferencian a tripomastigotes metacíclicos, completándose de esta manera el ciclo vital del parásito11.
Este resumen del complejo ciclo vital del T. cruzi tiene por objeto resaltar la capacidad del parásito de sobrevivir en ambientes muy diferentes en calidad y disponibilidad de nutrientes, como son el intestino del insecto trasmisor, el torrente sanguíneo y el medio intracelular del hospedador. Durante este ciclo los mecanismos de transporte de nutrientes y la plasticidad metabólica cumplen un papel esencial ya que permiten al parásito adaptar rápidamente su metabolismo y sobrevivir en tan diferentes condiciones.

Transporte de metabolitos en el Trypanosoma cruzi

Los procesos de transporte son el primer paso de una ruta metabólica y de ellos depende la disponibilidad de sustratos dentro de la célula. Esto es importante en los tripanosomátidos porque en muchos casos los procesos de biosíntesis fueron parcial o totalmente reemplazados en la evolución por procesos de transporte. Un ejemplo de ello son las purinas, cuya obtención depende exclusivamente de diversos sistemas de transporte desde el medio extracelular, o bien mediante rutas de "salvataje", ya que los tripanosomátidos no pueden sintetizarlas de novo, mientras que conservan la capacidad de sintetizar pirimidinas12. Siguiendo lo expuesto anteriormente, los diferentes transportadores de membrana plasmática que facilitan el ingreso de purinas y pirimidinas han sido objeto de numerosos trabajos13. Entre los estudios realizados se clonó y caracterizó un transportador de adenosina en Trypanosoma brucei, el cual, además, resultó ser la principal vía de ingreso de drogas como melarsoprol y pentamidina, utilizadas en el tratamiento contra este parásito14.También se ha demostrado que los arsenicales basados en melamina y las diamidinas, utilizados actualmente en terapias para las tripanosomiasis africanas, ingresan al medio intracelular exclusivamente a través de transportadores de membrana15.
La glucosa es la principal fuente de carbono para algunos estadios de estos parásitos que presentan una característica única basada en la compartimentalización de la maquinaria responsable de la glucólisis entre el citoplasma y una organela denominada glicosoma16. Estos organismos poseen también las proteínas necesarias para la adquisición de glucosa desde el medio externo y T. cruzi posee además transportadores de hexosas fosfato tal como existen en bacterias 17. Hasta ahora se ha descripto un único sistema de transporte de glucosa en T. cruzi, presente tanto en epimastigotes como en tripomastigotes. Se trata de un sistema de difusión facilitada, con alta afinidad por la glucosa, que también reconoce D-fructosa18 y está relacionado con los que se han encontrado en Leishmania sp., T. brucei, T. vivax y Crithidia fasciculata17,19.
Gran parte del metabolismo de T. cruzi está basado en la utilización de aminoácidos, no sólo como fuente de carbono sino también como reservorio de energía. El T. cruzi requiere principalmente de prolina20como fuente exógena de carbono, sin embargo también es capaz de utilizar asparagina, glutamina, glutamato, leucina, e isoleucina21. Por otro lado, estos parásitos carecen de enzimas para la síntesis de todos los aminoácidos esenciales humanos22. Finalmente, el aspartato, junto con la prolina y el glutamato, revisten particular importancia en el Trypanosoma cruzi ya que se encuentran involucrados en la diferenciación in vitro del estadio epimastigote a tripomastigote metacíclico (metaciclogénesis) por mecanismos aún desconocidos23.
Nuestro laboratorio estudió las características bioquímicas del transporte de aspartato y sus mecanismos de regulación. Simultáneamente se realizó una predicción mediante estrategias bioinformáticas de los destinos metabólicos del aspartato y se identificaron siete enzimas que utilizan el aspartato como sustrato24; sin embargo, no se pudieron establecer los mecanismos que podrían inducir la metaciclogénesis, más allá del estrés nutricional. Adicionalmente, otros grupos demostraron que existen dos sistemas específicos de transporte activo de prolina en epimastigotes: uno dependiente de H+ y otro dependiente de ATP25.
La cisteína puede ser producida a partir de homocisteína por procesos de trans-sulfuración, además la síntesis de novo también puede obtenerse a partir de serina26. Pero debido a la alta demanda de fuentes de grupos sulfhidrilos, T. cruzi posee un sistema de transporte de alta afinidad para cisteína (datos de nuestro laboratorio no publicados). Otro rasgo importante del metabolismo de los aminoácidos en tripanosomátidos es la necesidad de cisteína, glutamato, glicina y metionina como precursores para la síntesis de glutation. Dicha molécula se conjuga en relación 2:1 con una molécula de espermidina para formar el tripanotión que, como veremos más adelante, posee un papel único en tripanoso-mátidos para las defensas contra el estrés oxidativo27.
La arginina puede ser utilizada como un reservorio de energía en su forma fosforilada, como fosfoarginina, en donde acumula un fosfato de alta energía que puede transferir rápidamente al ADP para regenerar ATP en situaciones de alto consumo energético celular. Esto es particularmente relevante ya que: a) los tripanosomátidos carecen de sustancias de reserva en forma de hidratos de carbono; b) esta ruta metabólica se encuentra completamente ausente en mamíferos28.
Nuestro grupo de trabajo ha caracterizado bioquímicamente un transportador específico y de alta afinidad para arginina en T. cruzi, y hemos descripto parte de los mecanismos que lo regulan29. Dicho transportador presenta características muy particulares, lo que permitió postular que la arginina cumpliría un papel central en el metabolismo del parásito. Estudiando el destino metabólico, posterior a su incorporación por esta vía de transporte, se describió la presencia de fosfoarginina y se identificó a la arginina quinasa, enzima involucrada en su síntesis30.
Más recientemente, nuestro grupo describió en T. cruzi una nueva permeasa de arginina de baja afinidad. Estos dos componentes, uno de alta y otro de baja afinidad, tendrían un papel complementario, siendo posiblemente funcionales en las diferentes condiciones que el parásito enfrenta durante su ciclo de vida como parte de un mecanismo de adaptación a las distintas concentraciones que este aminoácido presenta en los hospedadores mamíferos e insectos31.
Las poliaminas son moléculas sencillas esenciales para la supervivencia de T. cruzi. En relación a su transporte, fueron caracterizados bioquímicamente dos sistemas con alta afinidad para las diaminas putrescina y cadaverina y de baja afinidad para espermina y espermidina32,33. Estos transportadores se regulan por las condiciones de crecimiento y son de particular importancia ya que las poliaminas son precursoras en la biosíntesis de tripanotión, un conjugado de glutation-espermidina fundamental para el equilibrio redox intracelular en tripanosomátidos27. Es interesante resaltar que T. cruzi es auxótrofo (incapaz de sintetizar un compuesto determinado) para poliaminas ya que carece de las enzimas ornitina decarboxilasa y arginina decarboxilasa involucradas en el primer paso de la biosíntesis de poliaminas34,35. Esto destaca la importancia de los sistemas de transporte para cubrir las necesidades metabólicas del parásito.
Hasta el presente, se ha identificado, clonado y caracterizado una permeasa de poliaminas en el parásito Leishmania major que se encuentra predominantemente expresada en el estadio dentro del insecto vector36. Nuestro laboratorio ha caracterizado funcionalmente el gen de T. cruzi ortólogo al transportador de poliaminas de L. major. Este gen, denominado TcPAT12, se expresó en ovocitos de Xenopus y demostró ser un transportador de alta afinidad de espermidina (con valores de Km en el orden de µM) con características cinéticas similares a las medidas en epimastigotes de T. cruzi37.
Debido a su papel y su posible utilización en el desarrollo de nuevas terapias, existe un profundo interés en conocer las características moleculares y funcionales de los transportadores de metabolitos en tripanosomátidos. Por la importancia del transporte, en particular de aminoácidos y poliaminas, existe una gran cantidad de análogos que se encuentran en uso o en proceso de prueba para el tratamiento de tripanosomiasis o leishmaniasis (Fig. 1); entre ellos: eflornitina (análogo de ornitina), acivicina (análogo de glutamina), 6-diazo-5-oxo-l-norleucina (análogo de glutamina), azaserina (análogo de glutamina), triptofano bencil éster (análogo de triptofano), butionina sulfoxamina (análogo de metionina), hidroxidopamina (análogo de tirosina), dihidroxitriptamina (análogo de triptofano)15.


Fig. 1.- Algunos de los análogos de aminoácidos que están en desarrollo como posibles agentes quimioterapéuticos contra las tripanosomiasis (Barrett y Gilbert, 2006)15; en la figura se puede observar el aminoácido junto con su análogo.

Resumiendo, en el transporte de aminoácidos y polia-minas en el T. cruzi hasta el presente se han descripto los procesos de transporte de sólo cuatro aminoácidos: arginina, prolina, aspartato y glutamato24, 25, 29, 31, 38, dos de los cuales fueron realizados por nuestro grupo (arginina y aspartato). Sin embargo, ninguna molécula involucrada en el transporte de aminoácidos en el T. cruzi ha podido aún ser caracterizada desde el punto de vista molecular, siendo los transportadores de hexosas18 y de espermidina37 los únicos caracterizados molecularmente.

La familia AAAP (Amino Acid-Auxin Permeases) del Trypanosoma cruzi

Luego de la reciente secuenciación del genoma de T. cruzi se estima que existen al menos 374 genes que codifican para distintos transportadores (Fig. 2) distribuidos en tres grupos principales: de los canales iónicos, los transportadores dependientes de ATP y los transportadores secundarios (Para más información ver: www.membranetransport.org). Debido a la escasa información que relacione a estas moléculas con procesos de transporte ya descriptos, se decidió analizar los datos preliminares del proyecto genoma de T. cruzi en busca de familias de secuencias que codifiquen para posibles transportadores de aminoácidos. Para ello se diseñaron algoritmos que facilitaran la identificación y ensamblado de las secuencias, y también la predicción de los marcos abiertos de lectura de genes pertenecientes a familias numerosas. De esta manera, se llevó a cabo una caracterización bioinformática de una de las mayores familias de posibles transportadores de aminoácidos de T. cruzi que podría incluirse en la superfamilia denominada AAAP (Amino Acid/Auxin Permeases)39. Se identificaron al menos 60 miembros distribuidos en 12 subgrupos definidos por identidad de secuencia. Se realizaron predicciones de distintas características de esta familia, por ejemplo, el número de genes por subgrupo, la topología de las moléculas y la presencia de ortólogos en otros tripanosomátidos; por último, se verificó la expresión de los miembros de cada uno de los subgrupos predichos como un control de la estrategia utilizada40. Posteriormente, dentro de la familia AAAP se caracterizó también una secuencia ortóloga en Leishmania amazonensis que posee expresión diferencial dentro del ciclo de vida del parásito41. Como ya se mencionó, uno de los aspectos interesantes de esta familia de permeasas es que no se encuentra representada en otros organismos.


Fig. 2.- Esquema de transportadores de metabolitos hallados en el genoma de Trypanosoma cruzi. Adaptado de Berriman et al. 200522. ABC: ATP Binding Casette, APC: amino acid/polyamine/organocation, AAAP: amino acid/auxin permease.

Luego de la publicación de los genomas de Trypano-soma cruzi42, Trypanosoma brucei22 y Leishmania major43, nuestros hallazgos respecto a esta familia de transportadores fueron confirmados por otros grupos5. Mediante un análisis exhaustivo se demostró que esta familia de transportadores se encuentra en los tres tripanosomátidos y que, además, posee una alta fluidez génica, ya que, según la especie, a pesar de haberse originado de un ancestro tripanosomátido común, ocurrieron expansiones unilaterales en el número de loci de transportadores por mecanismos de transposición y duplicación en tándem, así como también pérdida de genes5. Nuestro grupo de trabajo realizó recientemente el clonado y caracterización del primer transportador de poliaminas de T. cruzi, hecho relevante ya que el transporte de poliaminas desde el medio extracelular es el único mecanismo que tiene el parásito para cubrir sus necesidades vitales: el T. cruzi es el único tripanosomátido auxótrofo para poliaminas37. Se encuentra pendiente la caracterización funcional de todos los miembros de la familia AAAP de T. cruzi.

Perspectivas

La evolución a la vida parasitaria necesita la adaptación a un nicho especializado. Ejemplos de adaptaciones comunes incluyen sistemas de interacción con el hospedador, caminos metabólicos que permiten la adquisición de nutrientes y mecanismos de evasión de las defensas. Si bien estos rasgos pueden originarse por un proceso de cambio gradual, existen mecanismos como la transferencia horizontal de genes que permitiría a potenciales parásitos adaptarse rápidamente a los nuevos nichos.
Debido a su naturaleza de parásito, el Trypanosoma cruzi es incapaz de sintetizar numerosos componentes celulares. Esta incapacidad metabólica se compensa mediante sistemas de transporte de múltiples metabolitos del hospedador. El T. cruzi consume 692 metabolitos que es capaz de producir y otros 152 que no puede sintetizar, es decir que los obtiene del medio extracelular44. La evolución del parásito dentro del hospedador ha resultado en la pérdida de ciertos caminos metabólicos y la adquisición de otros procesos bioquímicos exclusivos de T. cruzi. Podrían entonces explotarse las diferencias entre el parásito y el hospedador para el desarrollo de agentes quimioterapéuticos. Por lo tanto son necesarios nuevos estudios sobre la capacidad biosintética de aminoácidos en T. cruzi.
Algunas preguntas surgen observando la redundancia en esta familia de transportadores y su plasticidad génica: ¿Cada molécula transportaría un grupo de aminoácidos, un único aminoácido o existirán ambos casos? ¿Todos los transportadores se expresan en todas las células, estadios del ciclo de vida y condiciones extracelulares? ¿Se trata de transportadores de membrana plasmática o también están presentes en membranas de organelas? ¿La presencia de esta familia multigénica le facilita la adaptación a los diferentes ambientes? ¿Los pseudogenes de transportadores permiten una adaptación a nuevos nichos a lo largo de la evolución?
Para comenzar a responder alguna de estas preguntas es necesario el estudio de diferentes transportadores en los distintos estadios del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi, así como también determinar la especificidad de sustrato y las características bioquímicas de cada uno de ellos, para lo cual estos genes deben ser clonados y expresados en un contexto genético apropiado.

Agradecimientos: Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET, PIP 5492), la Universidad de Buenos Aires (UBACyT X073) y la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (FONCYT-PICT REDES 2003-00300, PICT 2004-26108 y PICT 2005-33431). C.A.P. y C.C. son miembros de la carrera de investigador científico del CONICET, C.C. es docente del Departamento de Química Biológica, FCEN, UBA, M.R.M. es becaria doctoral de la Fundación YPF, G.E.C. es becario doctoral de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica y L.A.B. es becario doctoral del CONICET. Finalmente, un agradecimiento especial al Dr. Juan Antonio Barcat por su paciencia con las correcciones del manuscrito.

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Recibido: 20-11-2007
Aceptado: 16-1-2008