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Medicina (Buenos Aires)

versión On-line ISSN 1669-9106

Medicina (B. Aires) v.69 n.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ene./feb. 2009

 

ARTÍCULO ESPECIAL

Detección molecular de enfermedad mínima residual en melanoma y otros tumores sólidos

Valeria Vázquez, Laura L. Otero, Viviana E. Laurent, Mariano R. Gabri, Daniel E. Gómez, Daniel F. Alonso

Laboratorio de Oncología Molecular, Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Buenos Aires

Dirección postal: Dr. Daniel Alonso, Laboratorio de Oncología Molecular, Universidad Nacional de Quilmes, R. Sáenz Peña 352, 1876 Bernal, Buenos Aires, Argentina Fax: (54-11) 4365-7132 e-mail: dfalonso@unq.edu.ar

Resumen
La disponibilidad de métodos altamente sensibles y específicos para la detección de enfermedad mínima residual en pacientes con tumores sólidos podría tener importantes consecuencias pronósticas y terapéuticas. Uno de los métodos más usados para la detección molecular de células cancerosas es la técnica de RT-PCR, que permite la amplificación de secuencias de ARNm específicas de distintos tejidos. La misma fue aplicada por primera vez en la detección de células tumorales circulantes en sangre periférica de pacientes con melanoma avanzado, poco tiempo después fue adaptada para la búsqueda de enfermedad mínima residual en otros tumores sólidos. El objetivo de la presente revisión es evaluar la información publicada desde el primer estudio sobre este tema en 1991 y analizar el valor clínico de los hallazgos obtenidos. Se discute también la importancia del manejo de la muestra y de la estandarización de los procedimientos de RT-PCR.

Palabras clave: ARNm; Transcripción reversa; Reacción en cadena de la polimerasa; Tirosinasa; Melanoma; Cáncer

Abstract
Molecular detection of minimal residual disease in melanoma and solid tumors
. The availability of highly sensitive and specific methods for the detection of minimal residual disease in patients with solid tumors may have important prognostic and therapeutic implications. One of the most widely used methods for the molecular detection of cancer cells is the RT-PCR technique, which leads to the amplification of tissue-specific mRNA. It was firstly applied in the detection of circulating tumor cells in peripheral blood of patients with advanced melanoma; and soon it was adapted for the detection of minimal residual disease in other solid tumors. The aim of the present review is to evaluate the published data since the first study in 1991 and to analyze the clinical value of the findings obtained. The importance of sample handling and standardization of RT-PCR procedures is also discussed.

Key words: mRNA; Reverse transcription; Polymerase chain reaction; Tyrosinase; Melanoma; Cancer

A pesar de los avances terapéuticos logrados en oncología durante las últimas décadas, muchos pacientes mueren a causa de cáncer metastásico, incluso sin haber presentado signos de enfermedad clínicamente detectable luego del tratamiento. En estos pacientes, la recurrencia se origina a partir de residuos tumorales microscópicos que constituyen la denominada enfermedad mínima residual. Esta no se detecta mediante técnicas de imagen convencionales, requiriéndose la aplicación de métodos citométricos o moleculares1. La enfermedad mínima residual puede ser detectada en diferentes compartimientos corporales, incluyendo la sangre periférica, la médula ósea y los ganglios linfáticos2-4.
Los métodos moleculares utilizados en la detección de la enfermedad mínima residual incluyen técnicas derivadas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)1, la cual permite detectar secuencias particulares de ácidos nucleicos, ya sea desoxirribonucleico (ADN) o ribonucleico (ARN). Esta técnica amplifica geométricamente la secuencia de interés y es capaz de poner de manifiesto la presencia de ácidos nucleicos, aun cuando éstos se encuentren en cantidades mínimas. Para llevar a cabo la detección es indispensable contar con secuencias marcadoras específicas, cuya expresión se asocie a determinadas variantes de cáncer. De tal forma, es posible detectar las células tumorales que porten la correspondiente secuencia.

Marcadores tumorales y enfermedad residual

Los marcadores tumorales -o "biomarcadores"- son moléculas producidas tanto por el organismo en respuesta al crecimiento tumoral como por el propio tejido transformado5. Algunos marcadores son específicos de una variante tumoral, mientras que otros pueden encontrarse en varios tipos de cáncer. Los marcadores tumorales no son capaces de asegurar el diagnóstico de procesos neoplásicos por sí mismos, ya que obviamente el diagnóstico certero de la enfermedad depende, en última instancia de un apropiado estudio histopatológico a partir de material biópsico. Sin embargo, proveen una información muy útil, contribuyendo a diagnosticar precozmente la enfermedad, establecer el pronóstico, predecir la respuesta al tratamiento o detectar la recurrencia, por citar algunos ejemplos6-12. La Tabla 1 presenta una clasificación detallada de los marcadores tumorales de acuerdo con el tipo de información que brinda cada uno.

TABLA 1.- Clasificación de los marcadores tumorales

PSA: prostate-specific antigen; CEA: carcinoembryonic antigen.

En el caso de la detección de la enfermedad mínima residual, los biomarcadores aplicables a este objetivo podrían incluirse en la categoría de marcadores de pronóstico. Ayudan a prever en forma anticipada la recurrencia del tumor o la supervivencia del enfermo -sin importar el tipo de terapia utilizada-, constituyendo un indicio del grado de agresividad o progresión de la enfermedad5.
Existe más de una manera de abordar la elección del marcador a utilizar en la detección molecular. Una de ellas es la búsqueda de moléculas que se expresen en la
estirpe celular de la cual proviene el tumor primario, y que no se encuentren normalmente en el compartimiento tisular de donde se toma la muestra. De este modo, la presencia del marcador sólo puede provenir de células diseminadas a partir del tumor. Este es el enfoque predominante para los marcadores utilizados en la detección de células circulantes en tumores sólidos. Resulta fundamental que el marcador se exprese independientemente del grado de diferenciación de las células tumorales, sobre todo si se pretende detectar la enfermedad mínima residual en los estadios más avanzados. Otra alternativa para escoger un marcador tumoral es optar por moléculas que no sólo se expresen en tumores poco diferenciados sino que, además, su presencia aporte ventajas adaptativas a las células tumorales. Esta condición podría proporcionar una mayor confiabilidad al marcador, considerando la inestabilidad genética y fenotípica propia de las poblaciones transformadas.
La presencia de células malignas en la sangre periférica es un fenómeno fundamental durante el desarrollo de la diseminación a distancia de los tumores sólidos4, 13. Por lo tanto, la posibilidad de detectar células metastásicas con métodos confiables de base molecular podría representar una herramienta pronóstica de gran valor en pacientes oncológicos. En los últimos años, la importancia adjudicada a estas herramientas se ha reflejado en una considerable cantidad de trabajos desarrollados en la búsqueda de marcadores tumorales altamente sensibles y específicos, buena parte en melanoma metastásico14-45. El comportamiento agresivo del melanoma ha sido atribuido a características fenotípicas propias del linaje celular de la estirpe melánica, sugiriendo que ciertos factores presentes antes de la transformación neoplásica tendrían un papel central en la propensión a generar metástasis, aun a partir de cargas tumorales muy bajas46. De tal forma que el melanoma es un modelo atractivo en el desarrollo de biomarcadores para la detección de enfermedad residual, atendiendo a su tendencia a diseminarse rápidamente y a la identificación inequívoca mediante métodos moleculares del linaje celular involucrado.
Los marcadores tumorales basados en la técnica molecular de transcripción reversa seguida de PCR anidada (RT-PCR anidada) son los más difundidos para la detección de enfermedad mínima residual. En términos sencillos, la técnica consiste en la retrotranscripción de una secuencia específica de ARN mensajero de interés a "copia" de ADN y, a partir de esta copia se efectúan, dos rondas sucesivas de amplificación por PCR. La corta vida media del ARN mensajero y su inestabilidad fuera de la célula, permiten suponer que una detección positiva de la secuencia debería provenir de una célula íntegra y probablemente viable.

Detección molecular en melanoma

La relevancia clínica de la detección de enfermedad mínima residual en tumores sólidos a partir de muestras de sangre periférica todavía se encuentra en debate. Como se comentó más arriba, el mayor caudal de experiencia se ha obtenido en el estudio de pacientes con melanoma avanzado. Muchos grupos de investigadores abocados al estudio de marcadores pronósticos en pacientes con melanoma han obtenido resultados satisfactorios14-17, 19- 21, 23-26, 28-30, 34, 35, 37-45, aunque en otros trabajos no se ha podido arribar a hallazgos similares18, 22, 27, 31-33, 36. Estas contradicciones han retrasado el posicionamiento de la detección molecular de enfermedad mínima residual en el uso clínico, tanto en melanoma como en otros tumores sólidos.
Smith y col.47 fueron los primeros en desarrollar un método de detección de células de melanoma en sangre utilizando la técnica de RT-PCR anidada. Mediante la misma lograron detectar la presencia del ARN mensajero transcripto a partir del gen de la tirosinasa, el cual se expresa activamente en células de melanoma y es un marcador robusto del linaje melanocítico48. El producto proteico de este gen es una enzima que participa directamente en el proceso de melanogénesis. Se sabe que la tirosinasa se expresa en los estadios avanzados de la enfermedad y se la ha detectado incluso en pacientes con melanoma amelanótico49.
Luego de este estudio pionero en melanoma, continuaron numerosos trabajos orientados, entre otros objetivos, a aumentar la especificidad y sensibilidad de la técnica14, 15, 50, definir otros marcadores útiles14, 15, 25, 28, 50, correlacionar el resultado obtenido con el estadio de la enfermedad48, 51-53 y comprobar el valor pronóstico de los resultados obtenidos en muestras de sangre de pacientes14, 15, 18, 20, 23, 28, 30, 34-36, 50, 54, 55.
Con la intención de aumentar la especificidad y sensibilidad de la detección molecular, se ensayaron técnicas de RT-PCR o RT-PCR anidada seguidas de Southern blots, aplicando sondas específicas para detectar el producto amplificado15, 50. No obstante, la utilización de esta técnica no aportó mayores beneficios a la detección molecular y, para algunos marcadores, la especificidad fue menor50. De tal forma que, siempre ha prevalecido el método de la RT-PCR anidada y, más recientemente, técnicas similares cuantitativas aplicando la denominada RT-PCR en tiempo real, que permite estimar el número inicial de copias del transcripto presentes en la muestra56.
A medida que se fue extendiendo la aplicación de técnicas de detección molecular, surgieron trabajos centrados en la correlación de los resultados con el estadio de la enfermedad. Si bien se han registrado hallazgos contrapuestos, las variaciones aplicadas a la técnica de RT-
PCR -aun usando la misma secuencia marcadora- dificultan la comparación de resultados. Adicionalmente, los primeros trabajos se realizaron en pocos pacientes y ninguno aportó análisis estadísticos definitivos para validar los resultados51-53.
Se introdujo también el estudio de más de un marcador para fortalecer el diagnóstico de enfermedad mínima residual en melanoma. Al respecto, Kulik y col.48 no encontraron correlación estadística entre los marcadores moleculares y el estadio de la enfermedad. De todas maneras, se encontró que la frecuencia de detección positiva en los ensayos con dos marcadores fue mayor que utilizando sólo el marcador de referencia, la tirosinasa. Estos resultados abrieron algunas expectativas con respecto a la utilidad de técnicas de tipo«multimarcador» en la detección de la enfermedad mínima residual.

Evaluación como marcadores de pronóstico

Uno de los primeros trabajos que posicionó a la tirosinasa como marcador pronóstico, fue el de Battayani y col.15, con resultados en 93 pacientes que mostraban su asociación a la progresión de la enfermedad. Por su parte, Hoon y col.14 realizaron un análisis de cuatro marcadores de melanoma (tirosinasa, p97, MUC-18 y MAGE-3) sobre un total de 119 pacientes y encontraron una correlación significativa entre el número de marcadores positivos, el estadio y la progresión de la enfermedad. Sin embargo, cabe aclarar que se ha informado que los marcadores MAGE-3 y MUC-18 poseen una baja especificidad25, 57. Sarantou y col.50 ampliaron el trabajo de Hoon y col.14 estudiando otros marcadores (Trp-1, Trp-2, Pmel17 y MART- 1/Melan-A), además de tirosinasa, y concluyeron nuevamente que la sensibilidad del ensayo aumentaba utilizando más de uno. Este resultado fue explicado por la heterogeneidad tumoral, que afectaría el nivel de expresión génica correspondiente a los distintos marcadores.
Siguiendo esta línea de ensayos con múltiples marcadores y aportando un análisis estadístico consistente, Palmieri y col.25 arribaron a conclusiones diferentes respecto de Hoon y col.28. Informaron una correlación significativa con el estadio de la enfermedad sólo para el marcador tirosinasa25, 28. No pudieron demostrar la utilidad del resto de los marcadores evaluados en la progresión tumoral, ya sea individualmente o combinados entre sí. Más aún, obtuvieron resultados falsos positivos para los marcadores p97, MART-1 y MUC-1825. Esta especificidad limitada de ciertos marcadores complica la adopción de un criterio uniforme al aplicarse múltiples marcadores para la detección de células tumorales circulantes y limita la adjudicación de un significado clínico.
A este panorama complejo se suman otras variables que dificultan aún más las comparaciones de los resultados obtenidos en los distintos estudios realizados. En este sentido, pueden diferir los estadios de la enfermedad analizados en cada trabajo, el tratamiento recibido por los pacientes, la utilización de uno o más marcadores o la periodicidad de muestreo durante el seguimiento, entre otras variables. A modo de resumen, en la Tabla 2 se lista una selección de trabajos realizados sobre melanoma, en los que se incluyeron 20 pacientes o más.

TABLA 2.- Selección de trabajos destacados sobre la detección molecular en sangre en pacientes con melanoma

ASecuencias estudiadas por RT-PCR a partir de muestras de sangre periférica. BPorcentual de casos poSítivos para la detección de uno o varios marcadores de melanoma en circulación. Tyr: tyrosinase; MAGE: melanoma-associated antigen; MUC: transmembrane glycoprotein tumor antigen; MART: melanoma-associated antigen recognized by T-cells; Trp: tyrosinase-related protein; uMAG-A: universal melanoma antigen gene-A.

Por otra parte, podrían existir otros factores que influyen en la validación de la técnica para su uso clínico. Por ejemplo, Hasselmann y col.58 sugirieron que existe la posibilidad de que células tumorales apoptóticas constituyan una fuente de ARN circulante y que este ácido nucleico se encuentre protegido de las ARNasas del suero dentro de los cuerpos apoptóticos. Esta información indica que no siempre que se detecte un marcador tumoral en sangre es posible inferir que proviene de células circulantes capaces de originar metástasis.

Optimización y estandarización de técnicas moleculares

Otro punto muy relevante que se relaciona con la dispersión de resultados que arrojan los distintos trabajos de detección molecular, es la falta de controles de calidad en las técnicas empleadas. Para investigar la consistencia de los estudios, el grupo de melanoma de la EORTC (European Organization for Research and Treatment of Cancer) presentó una serie de recomendaciones para los ensayos clínicos, especialmente en lo referido al control riguroso del procesamiento para RT-PCR59. Todos los pasos del manejo de la muestra hasta completarse la retrotranscripción, con la consecuente síntesis del ADN copia, parecen contribuir a la heterogeneidad de los resultados. En cambio, la amplificación por PCR se muestra como proceso robusto. Así, debe concluirse que la calidad del ARN obtenido de la muestra se convierte en un elemento clave de esta técnica.
Recientemente, completamos la optimización de un nuevo diseño de secuencias para el marcador tirosinasa utilizando software de última generación para el diseño de cebadores para la RT-PCR anidada45. Como resultado del diseño optimizado fue posible identificar cantidades mínimas del mensajero de tirosinasa, requiriéndose menos de 1.5 pg de ARN total de una estirpe melánica, menor al total contenido en una sola célula cancerosa humana. Incluso, la sensibilidad del nuevo diseño fue superior a la del protocolo original de Smith y col.45, 47, tomado como referencia en la mayoría de los ensayos en muestras humanas publicados hasta la fecha.
Más allá de cumplirse las recomendaciones de la EORTC sobre el procesamiento del ARN59, desarrollamos además una serie de estudios en un modelo xenogénico para valorar el desempeño in vivo de la téc
nica en la detección del melanoma45. Fue posible detectar expresión de tirosinasa en la sangre de ratones atímicos portadores de tumores subcutáneos inducidos con células SKmel de melanoma humano, y esta expresión aumentó luego de la manipulación de los tumores. También informamos por primera vez la cinética del marcador luego de que las células cancerosas acceden al torrente circulatorio. Se comprobó que la expresión decae 6 horas después de la inyección endovenosa de células SKmel, sugiriendo que ese sería el lapso durante el cual las células de melanoma se mantienen viables en la circulación45.

Metaanálisis

En un intento por unificar la experiencia ganada en los trabajos de detección molecular de diferentes grupos y conseguir, a su vez, un análisis con mayor poder estadístico que involucre a un gran caudal de pacientes con melanoma, se han conducido estudios de metaanálisis. El metaanálisis se basa en integrar de manera estructurada y sistemática los datos obtenidos previamente en varios estudios clínicos similares. Tsao y col.60 realizaron un análisis de 23 trabajos que incluyó un total de 1799 pacientes, determinando que existe una falla en identificar a más de la mitad de los pacientes con enfermedad metastásica conocida, lo cual sugiere limitaciones para su uso en el ámbito clínico.
Por su parte, Quaglino y col.61 encontraron que la mayoría de los trabajos analizados coincide en que la determinación basal de tirosinasa, tomada antes del inicio del tratamiento, no estaría relacionada con el curso clínico de la enfermedad. Con respecto a la sensibilidad del sistema de detección, encontraron que la misma fue menor cuando se asoció con un período de seguimiento corto. También observaron una mayor sensibilidad en los trabajos en los que se realizó un mayor número de determinaciones por paciente y que todos los pacientes estudiados con dos muestras consecutivas positivas desarrollaron progresión visceral de la enfermedad.
Mocellin y col.62 realizaron un importante estudio de metaanálisis sobre 53 publicaciones que incluyeron un total de 5433 pacientes. Los resultados conseguidos con este trabajo avalaron la hipótesis de que la identificación de marcadores de células tumorales circulantes podría implicar un parámetro pronóstico útil para el seguimiento clínico de los pacientes con melanoma. Más aún, el metaanálisis del conjunto de datos confirmó que la detección molecular de células de melanoma en sangre representa un riesgo significativo, tanto para la sobrevida libre de enfermedad como para la sobrevida global.
Se ha postulado que la especificidad de la técnica de detección podría estar relacionada al estadio de la enfermedad, puesto que dos de los trabajos que informaron una alta especificidad incluyeron sólo pacientes con melanoma en estadío III20, 36. Considerando esto, el ARN de tirosinasa sería un marcador potencialmente útil, al menos en pacientes en estadio III libres de enfermedad, si se realizan determinaciones periódicas cada 2 o 3 meses durante el seguimiento clínico.

Detección molecular en otras variantes de tumores sólidos

Luego del trabajo pionero de detección de enfermedad mínima residual en pacientes con melanoma, se intentaron estrategias similares en diferentes tipos de tumores sólidos. En el trabajo de Corradini y col.63 se estudió un panel de posibles marcadores para la detección de enfermedad mínima residual en pacientes con cáncer de mama, observándose que las secuencias de maspina y mamaglobina ofrecen una sensibilidad y especificidad apropiada, aunque los autores concuerdan en que se requiere evidencia clínica para determinar la utilidad de estos marcadores en relación al pronóstico y el seguimiento del tratamiento. Por su parte, Soria y col.64 notificaron la detección del transcripto correspondiente a la enzima telomerasa en muestras de pacientes con esta misma enfermedad. Para ello utilizaron dos métodos diferentes que combinan las técnicas de PCR y ELISA, no encontrando la presencia del marcador en las muestras de voluntarios sanos.
En otros trabajos fue posible detectar secuencias del antígeno carcinoembrionario en muestras de sangre, médula ósea y ganglios linfáticos de pacientes con carcinoma mamario65, 66. Si bien no se informaron resultados positivos en lesiones benignas, se acepta que dicho marcador es inespecífico. De hecho, se conoce su presencia en muestras de pacientes con carcinoma gástrico, colorrectal y pancreático65-70 y otros investigadores lo encontraron en la médula ósea y ganglios linfáticos de individuos sanos71, 72. En el estudio de Wu y col.67, se evaluó la expresión de telomerasa en la detección de enfermedad mínima residual en pacientes con carcinoma gástrico, pero no se encontró una correlación significativa entre su presencia y los parámetros clínicos de la enfermedad. En cambio, la secuencia del antígeno carcinoembrionario se asoció en este trabajo a un riesgo significativamente mayor de progresión cuando fue encontrada en las células circulantes67.
Por otra parte, varios grupos han detectado células tumorales circulantes en la sangre periférica de pacientes con cáncer de próstata -tanto localizado como metastático- usando la técnica de RT-PCR aplicada al ARN mensajero del antígeno específico prostático73-75. Desafortunadamente, una proporción significativa de pacientes con enfermedad metastásica fue negativa para la presencia de este marcador.
La detección de marcadores en sangre periférica mediante la técnica de RT-PCR fue realizada en otros tipos de tumores sólidos epiteliales. Así, fue posible detectar la secuencia de α-fetoproteína en pacientes con carcinoma hepatocelular76-78, aunque este hallazgo posee un valor limitado puesto que también se ha encontrado este marcador en pacientes con enfermedades hepáticas no neoplásicas, como cirrosis y hepatitis crónica77, 79. El uso de la secuencia de albúmina rindió resultados aún menos específicos que α-fetoproteína, estando presente en la gran mayoría de los voluntarios sanos77, 80. Se postuló que la presencia del transcripto de la telomerasa podría ser un marcador útil para la detección temprana de progresión del hepatocarcinoma, habiéndose encontrado más tarde resultados alentadores al respecto81, 82. Para el caso del cáncer de cuello uterino, ha sido posible hallar la presencia del ARN mensajero del antígeno de carcinoma de células escamosas y del transcripto correspondiente al gen de la oncoproteína E6 del papilomavirus humano 1683, 84.
Las secuencias marcadoras de tiroglobulina y peroxidasa tiroidea han sido evidenciadas en muestras de carcinoma tiroideo y nódulos tiroideos benignos, sin detectarse en la mayoría de las muestras de individuos sanos. Incluso, se ha encontrado una correlación significativa entre su presencia en sangre periférica y el diagnóstico de carcinoma tiroideo. Resta, sin embargo, evaluar el significado pronóstico de esta determinación molecular85.
Con respecto a tumores sólidos no epiteliales, se ha ensayado la detección molecular de células tumorales circulantes en pacientes pediátricos con neuroblastoma. Ha sido posible detectar el ARN mensajero de la enzima tirosina hidroxilasa en sangre periférica y médula ósea, tanto en pacientes con enfermedad confinada al órgano como con metástasis linfáticas86. También pudo evidenciarse la presencia de secuencias del antígeno GAGE en el 50% de las muestras de sangre periférica de pacientes con neuroblastoma diseminado, aunque el significado clínico de estos resultados es todavía incierto87. Adicionalmente, se han detectado falsos positivos en sangre de controles utilizando dicho marcador88. Otra secuencia de mucho interés en neuroblastoma es el transcripto de la enzima gangliósido GD2 sintasa. La misma mostró una alta especificidad, no siendo detectada en muestras normales de médula ósea y sangre. Sin embargo, se expresaría en otros tipos de cáncer, como osteosarcoma, melanoma, retinoblastoma y algunos tumores de cerebro89, 90.

Perspectivas en detección molecular

La detección molecular de enfermedad mínima residual implica el uso de marcadores pronósticos, específicos para cada tipo de cáncer. La utilización de dichos marcadores requiere la aplicación de una técnica optimizada, altamente sensible y específica. Los resultados falsos negativos se encuentran estrechamente ligados a la sensibilidad del sistema, aunque también pueden deberse a la liberación intermitente de células tumorales circulantes hacia la sangre y a la inestabilidad genética de las células malignas. En estas situaciones, la imposibilidad de detectar la presencia de enfermedad mínima residual no permitiría conocer el mayor riesgo de progresión. Si bien en la actualidad no existe una gran variedad de alternativas terapéuticas para el melanoma avanzado, con un resultado falso negativo igualmente se perdería un signo de alerta para prever la progresión.
Una manera de lidiar con las limitaciones en la sensibilidad, es realizar un seguimiento periódico, obteniendo varias muestras de cada paciente. Con respecto al estudio de múltiples marcadores, hay que tener especial cuidado puesto que distintos trabajos en pacientes con melanoma informaron una muy baja especificidad para algunas secuencias. Al respecto, la tirosinasa se muestra como el más robusto para ser utilizado como único marcador, atendiendo a los datos de sensibilidad y especificidad obtenidos en varios estudios.
La consistencia de las técnicas de detección molecular parece ser un factor central para establecer el valor pronóstico de las distintas secuencias marcadoras en la enfermedad mínima residual. Deberían adoptarse como rutina protocolos estandarizados, previamente optimizados y validados mediante estudios in vitro sobre líneas celulares de referencia59. Además, deberían incluirse controles estrictos en cada muestra procesada, como el de integridad del ARN a través de genes testigo de expresión constitutiva (como la actina o la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), para arrojar resultados confiables y comparables entre los distintos ensayos45, 47. Al respecto, estas variables no pueden ser aseguradas simplemente bajo la forma de un kit comercial, sino que dependen de las buenas prácticas de cada laboratorio, aun cuando la metodología ya se encuentre validada en la literatura.
La experiencia acumulada en la detección de melanoma residual seguramente será de gran utilidad para evitar inconsistencias en el desarrollo de sistemas de detección de células cancerosas circulantes en otros tipos de tumores sólidos prevalentes. El cáncer residual parece ser el objetivo de nuevas terapias con compuestos más selectivos y vacunas oncológicas, apuntando a pacientes portadores de enfermedad localmente avanzada al diagnóstico y con alto riesgo de recurrencia91. En este contexto, la detección molecular mediante RT-PCR ha arrojado el mejor desempeño como marcador de pronóstico en el mismo perfil de pacientes. Es probable que pueda ser de utilidad como marcador de recurrencia e incluso como marcador predictivo, ayudando a establecer la probabilidad de respuesta al tratamiento92. Por otra parte, la misma técnica de RT-PCR ha comenzado a adaptarse para detectar células cancerosas en otras muestras o fluidos del paciente -además de la sangre- como es el caso del ganglio centinela93 .
Aunque la información disponible en melanoma es interesante, de todas formas resta mucha investigación clínica prospectiva para definir las secuencias marcadoras más apropiadas para distintos tipos tumorales, considerando el estadio de la enfermedad y los resultados del tratamiento.

Agradecimientos: Valeria Vázquez es Becaria en el marco del convenio I+D entre Universidad Nacional de Quilmes y Laboratorio ELEA SACIFyA, Laura Otero es Becaria de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (PID 0343/03) y Viviana Laurent es Becaria St. Baldricks de la Fundación Flexer. Mariano Gabri, Daniel Gomez y Daniel Alonso son miembros de la Carrera del Investigador Científico del CONICET.

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Recibido: 22-5-2008
Aceptado: 5-8-2008