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Medicina (Buenos Aires)

versión On-line ISSN 1669-9106

Medicina (B. Aires) v.69 n.2 Ciudad Autónoma de Buenos Aires mar./abr. 2009

 

ARTÍCULO ESPECIAL

Señales purinérgicas

Eduardo R. Lazarowski1, Pablo J. Schwarzbaum2

1School of Medicine, Department of Medicine, The Cystic Fibrosis Treatment and Research Center, University of North Carolina, USA;
2Instituto de Química y Fisicoquímica Biológicas (IQUIFIB), Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires

Dirección postal: Dr. Pablo J. Schwarzbaum, IQUIFIB, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Junín 956, 1113 Buenos Aires, Argentina. Fax (54-11) 4 962 5457 e-mail: pablos@qb.ffyb.uba.ar

Resumen
En la última década se ha aportado clara evidencia de que tanto nucleósidos como nucleótidos de adenina y uridina pueden funcionar como factores de señalización extracelular. Su acción es mediada por dos tipos principales de receptores de superficie denominados purinérgicos. Los receptores P1 se activan por adenosina, y son todos metabotrópicos, mientras que los receptores de nucleótidos (ATP, ADP, UTP y UDP) y nucleótidos-azúcares (UDP-glucosa y UDP-galactosa) pueden ser metabotrópicos (P2Y) o ionotrópicos (P2X). La importancia y complejidad de este sistema de señalización se evidencia por la diversidad de mecanismos de liberación de nucleótidos al medio extracelular y por la distribución ubicua de varios grupos de ectonucleotidasas capaces de catalizar la degradación y conversión de nucleótidos. Hasta el momento se han descrito y clonado una veintena de estos receptores que modulan una variedad de respuestas, como el impulso nervioso, la respuesta inflamatoria, la secreción de insulina, la regulación del tono vascular y la percepción del dolor. En la presente revisión se describen las características estructurales y farmacológicas de los receptores purinérgicos y se analiza la interacción dinámica entre estos receptores, los nucleósidos y nucleótidos, y las ectonucleotidasas, con especial atención a la dinámica de la agregación plaquetaria, la respuesta inmune y la hidratación de las mucosas respiratorias.

Palabras clave: Receptores purinérgicos; Ecto-apirasa; CFTR; Transducción de señal

Abstract
Purinergic signals
. In the last decade evidence accumulated that nucleosides and nucleotides of both uridine and adenine can act as extracellular signaling factors. Their action is mediated by two main types of surface receptors commonly known as purinergic. P1 receptors are metabotropic and activated by adenosine, whereas receptors for nucleotides (ATP, ADP, UTP and UDP) and nucleotide-sugars (UDP-glucose and UDP-galactose) can be either metabotropic (P2Y) or ionotropic (P2X). The importance and complexity of this signaling system is evidenced by various mechanisms of nucleotide release, as well as by the ibiquitous distribution of various types of ectonucleotidases which catalyze and convert extracellular nucleotides. Up to now about twenty receptors have been cloned and found to modulate the nerve impulse, inflammatory response, insuline secretion, the regulation of the vascular tone and nociception, among other processes. In the present review we describe the main structural and pharmacological features of purinergic receptors, and analyze how the dynamic interaction between these receptors, nucleotides and nucleosides, and ectonucleotidases modulate several biological responses. Particular focus is given to platelet aggregation and thrombus formation, the immune response and the hydration of the mucosal linings of the respiratory tract.

Key words: Purinergic receptors; Ecto-apyrase; CFTR; Signal transduction

Los nucleósidos y nucleótidos son componentes esenciales de todo sistema biológico. Forman parte de la estructura de los ácidos nucleicos, son fuente de energía en la gran mayoría de los procesos metabólicos y participan como co-factores en numerosas reacciones bioquímicas. Un nucleósido consta de una base nitrogenada unida a una ribosa o deoxiribosa. Los nucleótidos resultan de la unión de un nucleósido con uno, dos o tres fosfatos identificados con las letras griegas α, β, γ. De acuerdo al tipo de base nitrogenada que posean, los nucleósidos y sus nucleótidos se denominan purinas o pirimidinas. Los nucleósidos adenosina y guanosina son purinas, mientras que la uridina, la timidina, y la citosina son pirimidinas. Los nucleótidos se encuentran en la célula mayoritariamente libres en forma de nucleósido trifosfato, el más abundante de los cuales es el ATP. Le siguen en abundancia la uridina trifosfato (UTP), guanosina trifosfato (GTP), adenosina difosfato (ADP), y ciertos nucleótidos-azúcares. En menor concentración se encuentran los nucleósidos monofosfatos.
Además de sus funciones dentro de las células, los nucleótidos pueden ser liberados al medio extracelular, donde gatillan diversas respuestas mediante su interacción con receptores de superficie denominados receptores purinérgicos. El presente artículo se propone discutir brevemente tres aspectos importantes relacionados a la señalización mediada por nucleótidos extracelulares: ¿Cuál es el papel fisiológico de los nucleótidos extracelulares? ¿Qué mecanismos regulan la liberación celular de los nucleótidos? ¿Qué son y cómo funcionan los receptores purinérgicos?

Reseña histórica

Cerca de setenta años han transcurrido desde que Fritz Lipmann y Herman Kalckar establecieran que el ATP es el principal dador de energía metabólica en los sistemas biológicos. El concepto ha sido verificado hasta el presente por incontables trabajos de fisiólogos y bioquímicos. La energía almacenada en el enlace fosfato terminal (fosfato γ) del ATP es obtenida primariamente a partir del metabolismo de la glucosa, azúcar que se almacena en el organismo en forma de glucógeno. Un hito importante en el estudio del papel de los nucleótidos en las reacciones de transferencia de energía fue el descubrimiento, por Leloir y su grupo, del nucleótido-azúcar UDP-glucosa, un intermediario en la incorporación de la glucosa al glucógeno. Un cuarto de siglo más tarde estos trabajos le valdrían a Leloir el premio Nobel en Química1.
Entre muchas otras funciones, los nucleótidos son las unidades que forman la estructura compleja del ADN y ARN. Algunos derivados de nucleótidos sirven como intermediarios en reacciones biosintéticas, como por ejemplo los nucleótidos-azúcares UDP-galactosa y UDP-N-acetilglucosamina que participan en la síntesis de glicoproteínas (proteínas unidas a polisacáridos) y fosfolípidos. Ciertos nucleótidos complejos (nicotina-adenina- dinucleósido o NAD, flavina-adenina-dinucleósido o FAD, y otros) sirven de cofactores en numerosas reacciones enzimáticas, mientras que algunos nucleótidos participan como cofactores (GTP) o como segundos mensajeros (Ej. AMP cíclico) en la transducción de señales. Es a través de estos segundos mensajeros que los estímulos externos desencadenan respuestas celulares específicas. Los nucleótidos extracelulares pueden activar un tipo específico de proteína G. Por ejemplo, la proteína Gs activa la enzima adenilato ciclasa (AC) que convierte al ATP citosólico en AMP cíclico (AMPc), un potente segundo mensajero que estimula numerosas respuestas celulares (Fig. 1).


Fig. 1.- Nucleótidos y transducción de señales. La activación de receptores (R) de superficie por un estímulo externo causa la activación de un tipo de proteína G. La proteína Gs activa la enzima adenilato ciclasa (AC) que convierte al ATP citosólico en el segundo mensajero AMP cíclico (AMPc).

Dado que tanto el ATP como los demás nucleótidos y nucleótidos-azúcares no atraviesan libremente la membrana plasmática, se supuso durante mucho tiempo que estas moléculas sólo podrían existir en el interior de la célula. Esta visión era reforzada principalmente por ser el ATP la moneda energética de las reacciones intracelulares. Dado que la célula posee complejos mecanismos de síntesis y reserva de nucleótidos, era esperable que también poseyera mecanismos que evitaran la salida de estos componentes. Este concepto comenzaría a cambiar cuando en 1970 Geoffrey Burnstock, pionero en el estudio de la señalización por nucleótidos, postulara que el ATP podría actuar como transmisor en el espacio sináptico2,3.
Deberían transcurrir otros veinte años hasta que se aceptara definitivamente la idea de que los nucleótidos actúan como factores de señalización extracelular. La identificación a nivel genético y molecular de una veintena de receptores de superficie que traducen en respuesta fisiológica la presencia extracelular de los nucleótidos y nucleósidos (Figs. 2 y 3), ha convertido al campo de los receptores purinérgicos en uno de los de mayor expansión de la farmacología y fisiología modernas4,5.


Fig. 2.- Estructura y selectividad de los receptores purinérgicos P2X, P2Y y P1. El esquema ilustra los dominios hidrofóbicos dispuestos en la membrana plasmática (MP), y los dominios hidrofílicos que se expanden hacia el interior (In) o el exterior (Ex) de la célula. En la parte inferior se indican las selectividades de los distintos receptores purinérgicos por los nucleótidos y nucleósidos.


Fig. 3.- Mecanismos de acción de los receptores purinérgicos. Los receptores P2Y y P1 están acoplados selectivamente a diversos tipos de proteína G, las cuales en respuesta a la estimulación del receptor activan distintas enzimas, generando segundos mensajeros. Los receptores P2X son canales catiónicos.

Si bien inicialmente el término purinérgico hacía referencia a los nervios que utilizan ATP como su principal neurotransmisor, actualmente "purinérgico" se refiere más ampliamente a las señales impartidas por nucleótidos y nucleósidos extracelulares en todo tipo de células. Es así que varios receptores son activados por pirimidinas (UTP, UDP, UDP-glucosa), como veremos más adelante.
Dos factores adicionales han contribuido al desarrollo de las investigaciones en el campo de los receptores purinérgicos. Primero, la identificación y caracterización de varios grupos de ecto-nucleotidasas, enzimas de membrana que hidrolizan nucleótidos extracelulares, posibilitó comprender cómo se controlan los niveles extracelulares de los nucleótidos, y por ende, la duración y magnitud del estímulo purinérgico6. Segundo, el desarrollo de técnicas analíticas (fluorométricas y radiométricas) de alta sensibilidad verificó la presencia extracelular de nucleótidos y nucleósidos en la mayoría de los tejidos4,7.
Actualmente, el nucleósido adenosina, los nucleótidos ATP, ADP, UTP, y UDP, y ciertos nucleótidos-azúcares (UDP-glucosa, UDP-galactosa) son reconocidos como potentes y selectivos mensajeros extracelulares que controlan, entre otras funciones, el impulso nervioso, la respuesta inflamatoria, la secreción de insulina, la agregación plaquetaria, la hidratación y protección de las mucosas respiratorias, la regulación del tono vascular y la percepción del dolor. Tantas son las funciones fisiológicas reguladas por los nucleótidos extracelulares y sus receptores que el interés en el tema ha experimentado en los últimos años un crecimiento exponencial. Sólo a partir del año 2005, se han publicado más de 2.000 artículos científicos avalando el rol fisiológico de los receptores purinérgicos.

Aspectos estructurales y farmacológicos de los receptores purinérgicos

Las acciones extracelulares de los nucleótidos son mediadas por dos familias de receptores purinérgicos, los receptores P2X y P2Y (Fig. 2). Una tercera familia, constituida por los llamados receptores P1, reconoce como activador (agonista) selectivo al nucleósido adenosina (Fig. 2). Los receptores P2X poseen dos dominios hidrofóbicos expandidos a través de la membrana plasmática, formados por 20-30 aminoácidos mayoritaria-mente no polares, y que por lo tanto tienden a disponerse alejados del contacto con el agua. Ambos dominios hidrofóbicos están unidos entre sí por una extensa cadena extracelular de aminoácidos predominantemente polares. Dos dominios hidrofílicos relativamente pequeños se expanden hacia el interior de la célula formando los segmentos amino- y carboxi-terminales de estos receptores. La característica estructural saliente de los receptores P2Y y P1 es la presencia de siete dominios hidrofóbicos expandidos a través de la membrana plasmática, separando al segmento amino-terminal extracelular del carboxi-terminal citosólico (Fig. 2).
Los receptores P2X (P2X1-P2X7) conforman poros o canales catiónicos (principalmente canales de calcio, Ca2+) que se activan (abren) en presencia de ATP extracelular. Ni el ADP, ni la adenosina, ni los nucleótidos de uridina activan a estos receptores8.
Los receptores P2Y reconocen como agonistas selectivos a distintos nucleótidos de adenina y/o uridina (Fig. 2), y pertenecen a la superfamilia de los llamados receptores acoplados a proteínas G (indicados en inglés con la sigla GPCR)9.
Cuando un receptor de tipo GPCR se activa, produce un cambio conformacional en la proteína G y seguidamente la activación de enzimas que promueven la activación de señales intracelulares o segundos mensajeros. En la Fig. 3 se ilustran las selectividades de los receptores
P2Y para distintos tipos de proteínas G (Gs, Gi, Gq) y los segundos mensajeros generados por las mismas. El grupo mayoritario de receptores P2Y (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6 y P2Y11) está acoplado a la proteína Gq, que activa a la fosfolipasa C (PLC) y genera como segundos mensajeros al inositol tri-fosfato (InsP3) y el diacil-glicerol (DAG).
El InsP3 promueve la movilización de Ca2+ de compartimentos intracelulares; el DAG activa a la proteína quinasa C (PKC). El receptor P2Y11, además de acoplarse a Gq, se acopla a Gs, promoviendo la estimulación de la enzima adenilato ciclasa (AC), aumentando la producción de AMP cíclico (AMPc). Los receptores P2Y12, P2Y13 y P2Y14 están acoplados a la proteína Gi que inhibe la adenilato ciclasa, regula ciertos canales iónicos, y activa una quinasa de fosfolípidos, la PI-3 quinasa (PI3K). Los receptores P1 (de adenosina) están acoplados ya sea a Gi (receptores A1 y A3) o a Gs (receptores A2A y A2B). Los receptores P2X son canales iónicos y su activación resulta en la entrada de Ca2+ desde el espacio extracelular.
Los receptores de adenosina, de los cuales hay cuatro tipos (A1, A2A, A2B y A3), sólo se activan por este nucleósido y, al igual que los receptores P2Y, están acoplados a proteínas G. Estos receptores fueron inicialmente denominados P1 para diferenciarlos de los receptores P2 activados por nucleótidos.
El grado de activación de los receptores purinérgicos depende del tipo y concentración de los nucleótidos extracelulares. Por ende, antes de analizar el papel fisiológico de estos receptores, es conveniente discutir cómo se liberan los nucleótidos, y una vez en el espacio extracelular, qué tipo de reacciones permiten que éstos se conviertan y/o degraden.

Mecanismos de liberación de nucleótidos

La liberación celular de nucleótidos es reconocida hoy día como un fenómeno fisiológico generalizado10. El ATP, ADP, adenosina, UTP, UDP, y UDP-glucosa, todos ellos potentes y selectivos agonistas purinérgicos, se encuentran presentes en el medio extracelular de cuanto tejido haya sido investigado. Al menos que ocurra muerte celular, los nucleótidos no difunden libremente al exterior de la célula, sino que cuentan con mecanismos especializados en el control de la liberación de ATP y otros agonistas purinérgicos.
Los nucleótidos pueden ser liberados por las células en dos contextos no excluyentes: 1) difusión a través de canales presentes en la membrana plasmática (mecanismo conductivo), y 2) secreción de gránulos conteniendo nucleótidos (exocitosis). El primero de ellos se fundamenta en que las concentraciones citosólicas de ATP y otros nucleótidos (0.1-10 mM) superan por varios órdenes de magnitud a las observadas en el medio extracelular (< 100 nM), hecho que facilitaría el flujo de nucleótidos desde el citosol hacia el exterior a través de canales presentes en la membrana plasmática (Fig. 4). Además, los nucleótidos generalmente se encuentran como aniones, y el interior celular es electronegativo con respecto al exterior, de modo que no solamente el gradiente químico, sino también el gradiente eléctrico a través de la membrana celular favorecería la salida de nucleótidos. Los estudios farmacológicos y electrofisiológicos sugieren que en algunas células, ciertas proteínas de superficie (Ej. conexinas, panexinas, y canales aniónicos dependientes de voltaje) podrían servir como canales de ATP11.


Fig. 4.- Liberación y metabolismo extracelular de nucleótidos. La liberación celular de nucleótidos puede ocurrir por flujo conductivo o exocitosis. Tanto el UTP como el ATP pueden ser degradados a nucleósidos di- (NDPs) y monofosfato (NMPs) por E-NTPDasas (i). Además, tanto el ATP como el UTP y la UDP-glucosa (UDP-Glc) pueden ser hidrolizados por las ecto-nucleótido-pirofosfatasas E-NPPs (ii), generando AMP y UMP. Estos últimos son substrato de la ecto-5'-nucleotidasa (E-5'NT; iii). La uridina (URI), la adenosina (ADO) y eventualmente la inosina (INO) generada por acción de la adenosina deaminasa (ADA) (iv), penetran a la célula a través de transportadores de nucleósidos (NS).

Por otro lado, en algunos tejidos el ATP y posiblemente el UTP son almacenados en altas concentraciones en vesículas o gránulos citoplasmáticos especializados, y liberados por exocitosis en respuesta a ciertos estímulos (Fig. 4). Este proceso, conocido como exocitosis regulada, ha sido descrito en terminales nerviosas, células cromafines, plaquetas, páncreas exocrino y otros tejidos secretorios. Aunque en la vasta mayoría de los tejidos periféricos, la existencia de gránulos secretorios ricos en ATP no ha sido demostrada, en muchos casos la liberación de ATP y UDP-glucosa se reduce considerablemente en presencia de agentes que inhiben el tráfico de vesículas hacia la membrana plasmática. Es sabido que el ATP y los nucleótido-azúcares son activamente transportados desde el citosol hacia el retículo endoplásmico (RE) y el aparato de Golgi, para ser utilizados en la biosíntesis de glicoproteínas y otras moléculas complejas destinadas a ser transportadas hacia la superficie celular. El hecho de que prácticamente todas los nucleótidos involucrados en reacciones bioquímicas dentro del RE o del aparato de Golgi sean detectados en el medio extracelular, sugiere que la inserción de vesículas en la superficie celular podría ser uno de los mecanismos de liberación de nucleótidos (Fig. 6).

Metabolismo extracelular de nucleótidos

La regulación de las concentraciones extracelulares de los nucleótidos impide que los receptores purinérgicos estén permanentemente activados, llegando incluso a desensibilizarse (inactivarse) frente a la estimulación excesiva o prolongada de un ligando. Este papel lo cumplen las ecto-nucleotidasas, enzimas presentes en la superficie de la gran mayoría de las células que metabolizan los distintos nucleótidos extracelulares. La actividad de las ecto-nucleotidasas garantiza no sólo la terminación de un estimulo específico, sino que posibilita la conversión de unos agonistas en otros, los cuales presentan diferentes selectividades hacia distintos receptores12.
Existen tres grupos de ecto-nucleotidasas, esquematizadas en la Fig. 4. (i) Las apirasas o ecto-nucleósido trifosfato-difosfohidrolasas (E-NTPDasas), (ii) las ectonucleótido- pirofosfatasas (E-NPP), y (iii) la ecto-5'- nucleotidasa. Las E-NTPDasas remueven secuencialmente al fosfato (Pi) terminal de los nucleósido di (NDPs) y trifosfato (NTPs). Las E-NPP remueven ambos fosfatos (β y γ) juntos de los NTPs, liberando pirofosfato (PPi). Ademas, las E-NPP remueven glucosa-1P de la UDPglucosa. La 5'-nucleotidasa promueve la formacion de nucleósidos a partir del correspondiente nucleósido-monofosfato (NMPs). La adenosina deaminasa (ADA) convierte a la adenosina en inosina (otro nucleósido). Los nucleósidos generados como resultante de estas actividades son captados por la célula a través de transportadores específicos, sirviendo de substrato para la síntesis de NTPs y UDP-glucosa (Fig. 4).

Papel fisiológico de los receptores purinérgicos

Los receptores purinérgicos están presentes en todos los tejidos. Los receptores P2X están ampliamente distribuidos a través del sistema nervioso central y periférico así como también en los endotelios y epitelios, en la musculatura vascular, en leucocitos y plaquetas, mastocitos y macrófagos. Dentro del sistema nervioso, los receptores P2X se encuentran tanto en neuronas pre- y post-sinápticas como en células de la glía. Los receptores sinápticos P2X responden rápidamente (en milisegundos) al ATP liberado en las terminales nerviosas, facilitando la entrada de Ca2+ a la neurona, y han sido asociados funcionalmente a la percepción del dolor y otras sensaciones. Estudios realizados en ratones genéticamente carentes de receptor P2X3 (P2X3-R -/-) indican que estos animales pierden la sensibilidad a la distensión mecánica de la vejiga urinaria. Dado que la distensión del urotelio (el epitelio que cubre la pared interior de la vejiga) provoca la liberación de ATP, el receptor P2X3 actuaría como "detector" de los cambios de volumen (llenado) de la vejiga urinaria. Trabajos similares han establecido que los receptores P2X2 y P2X3 participan en la sensación gustativa y que, además, el receptor P2X3 presente en terminales nerviosas de la arteria carótida juega un importante papel en la respuesta a la escasez de oxígeno en la sangre.
Uno de los fenómenos más investigados dentro del campo de las señales purinérgicas debido a sus implicaciones fisio-patológicas, es la acción del ADP sobre los receptores P2Y1 y P2Y12 de las plaquetas. Al dañarse los vasos, las plaquetas se adhieren al tejido expuesto, aglutinándose en el sitio donde se ha producido la lesión. Así se forma el llamado tapón plaquetario que detiene la hemorragia. La formación del tapón plaquetario depende en gran medida de la capacidad de las plaquetas activadas de reclutar nuevas plaquetas en el sitio lesionado. Esta respuesta es mediada principalmente por el ADP liberado por las propias plaquetas, y la consiguiente activación de los receptores P2Y1 y P2Y12.
La activación del receptor P2Y1 induce movilización de Ca2+ y activación de la proteína quinasa C (Fig. 3), lo que lleva a la fosforilación y polimerización de proteínas integrales del esqueleto celular (citoesqueleto) y cambios en la forma de las plaquetas. El receptor P2Y1, al activarse, inicia la agregación plaquetaria, pero ésta es débil y reversible. Se requiere de la activación del receptor P2Y12 para que la agregación iniciada por el receptor P2Y1 prosiga en forma sostenida e irreversible. Esto se debe principalmente a la capacidad del receptor P2Y12 de activar señales (entre ellas PI3-quinasa, Fig. 3), que controlan la activación y expresión de proteínas de superficie (ej. integrinas) responsables de la adhesión fuerte entre plaquetas.
La activación del receptor P2Y12 también es importante para la agregación plaquetaria iniciada por otros estímulos no purinérgicos, como trombina, serotonina, adrenalina y tromboxano A2. Dado el rol del receptor P2Y12 en el desarrollo de trombos, sus antagonistas (ej. clopidogrel) son utilizados en la clínica médica como agentes anti-trombóticos13.
De lo arriba expuesto se deduce que si la activación de los receptores P2Y1 y P2Y12 no fuera controlada entonces una simple lesión, por ejemplo una herida menor, provocaría un trombo y consecuentemente oclusión de los vasos sanguíneos. Este control es llevado a cabo por las diversas E-NTPDasas presentes en la superficie del endotelio de los vasos sanguíneos y tejido circundante. Es interesante notar que la E-NTPDasa-1, la enzima que hidroliza al ATP y al ADP con igual eficacia, se ubica en las células endoteliales, mientras que la E-NTPDasa-2, que hidroliza al ATP mucho más eficazmente que al ADP se halla presente en la superficie de las células del tejido
circundante14. Esta distribución asimétrica de ecto-nucleotidasas previene la activación de las plaquetas dentro de vasos intactos. Es decir, en ausencia de lesión, la E-NTPDasa-1 que se encuentra dentro del vaso no permite que se acumule ADP. Por el contrario, en el caso de rotura de vasos, la E-NTPDasa-2 del tejido circundante favorece la agregación plaquetaria al promover la conversión de ATP en ADP.
La hidrólisis del ADP no sólo finaliza la activación de los receptores P2Y1 y P2Y12 sino que promueve, a través de la formación de adenosina, la activación de receptores plaquetarios A2A que inhiben la agregación de las plaquetas.
Otro receptor ampliamente estudiado es el P2Y2, presente en la mayoría de los tejidos periféricos y en células de la glía del SNC. El receptor P2Y2 está involucrado en la amplificación de la respuesta inmune mediada por los neutrófilos, los más abundantes leucocitos circulantes. La función primordial de los neutrófilos es destruir las bacterias patógenas que penetran en el organismo. En un proceso conocido como quimiotaxis, los neutrófilos reconocen la presencia de moléculas de origen bacteriano, el quimioatrayente, y migran hacia la zona de origen de las mismas llamada foco de infección. El neutrófilo se orienta y mantiene su movimiento direccional a través de pequeñísimos gradientes de concentración
del quimioatrayente. Al detectar un estímulo (por ejemplo, el péptido bacteriano fMLP) la superficie del neutrófilo se deforma y emite un seudópodo en dirección a aquel (Fig. 5). La deformación de la membrana plasmática promueve la liberación de ATP, el cual activa al receptor P2Y2 presente en el seudópodo naciente y amplifica la señal quimiotáctica iniciada por el fMLP. Un segundo mecanismo de amplificación involucra la conversión del ATP en adenosina -por acción de las E-NTPDasas y ecto- 5'-nucleotidasa- y la consiguiente activación del receptor A3 de los neutrófilos (Fig. 5). Como contrabalance, la misma adenosina, al difundir sobre la superficie del neutrófilo, activa al receptor A2A localizado en la región central de la célula, causando inhibición de la quimiotaxis. Dada su importancia en la migración de neutrófilos, el desarrollo de antagonistas selectivos de los receptores P2Y2 y A3 podría conducir a nuevas terapéuticas anti-inflamatorias.


Fig. 5.- Receptores purinérgicos y respuesta inflamatoria. La activación del receptor FPR por el fMLP, causa la liberación de ATP y activación del receptor P2Y2 amplificando la respuesta quimiotáctica del neutrófilo. La conversión de ATP en adenosina resulta en activación del receptor A3, también pro-quimiotáctico, y del receptor A2A, inhibidor de la quimiotaxis.


Fig. 6.- Componentes del epitelio respiratorio. El aclaramiento mucociliar (MCC) es regulado por receptores purinérgicos de la superficie apical (Ap) de células epiteliales. Los receptores A2B están presentes en las células ciliadas mientras que los receptores P2Y2 se encuentran tanto en las células ciliadas como en las células caliciformes, productoras de mucinas. La Ap de las células epiteliales está separada de la superficie basolateral (Bl) por uniones fuertes (UF).

Como veremos luego, el receptor P2Y2 también cumple importantes funciones en los mecanismos de defensa innata del epitelio respiratorio.
Otros ejemplos de funciones reguladas por receptores P2Y incluyen el control de la secreción de electrolitos en el yeyuno y en la vesícula biliar, mediados por los receptores P2Y4 y P2Y6 respectivamente, y la regulación de la respuesta inmune mediada por el receptor P2Y11, expresado en linfocitos, monocitos y neutrófilos4.
Los receptores P1 (de adenosina) se encuentran distribuidos dentro y fuera del sistema nervioso central. En el cerebro, la adenosina funciona como depresor, actuando a través de receptores A1 y A2A presentes en terminales nerviosas de la corteza y en vías motoras. Muchas de las acciones psico-estimulantes de la cafeína se deben a que ésta es un inhibidor de los receptores A1 y A2A, y por lo tanto contrarresta la acción depresora ejercida por la adenosina endógena. Ya hemos mencionado el papel de los receptores A2A, A2B, y A3 en el control de la activación de las plaquetas y en la respuesta inflamatoria. El receptor A2B también cumple importantes funciones en el mantenimiento de la secreción de electrolitos en el epitelio pulmonar.

Los receptores purinérgicos y los mecanismos de defensa pulmonar

El epitelio que recubre el árbol respiratorio desde las vías aéreas superiores hasta los bronquios y bronquiolos representa la primera línea de defensa contra las infecciones pulmonares. La capa más superficial del epitelio respiratorio está formada mayoritariamente por células ciliadas, secretoras de iones y agua, y en menor proporción por células caliciformes. Tanto éstas como células de las glándulas mucosas son las responsables de la producción de mucinas, macromoléculas de alto peso molecular que, al ser liberadas a las vías respiratorias, forman la capa viscosa de mucus que atrapa las bacterias inhaladas.
La eliminación del mucus y de las partículas en él retenidas es propulsada por el movimiento direccional coordinado de las cilias, proceso conocido como aclaramiento mucociliar o muco-ciliary clearance (MCC). Es importante destacar que las cilias no penetran la capa viscosa del mucus sino que están "sumergidas" en un film acuoso, el líquido periciliar, por encima del cual "flota" el mucus. El líquido periciliar recubre la superficie del epitelio respiratorio en toda su extensión y, con un espesor similar a la altura de las cilias, brinda la lubricación necesaria para el movimiento de éstas. La remoción eficiente de las partículas inhaladas depende no sólo de la secreción de mucinas y del movimiento ciliar, sino fundamentalmente de la producción de líquido periciliar. Esta a su vez está determinada por la capacidad de las células ciliadas de regular la concentración de electrolitos en el compartimiento extracelular apical.
La enfermedad fibroquística (FQ): La falta de producción de líquido periciliar provoca la deshidratación del mucus y el colapso de las cilias, y lleva a la obstrucción e infección pulmonar. Este es el caso típico de la enfermedad fibroquística pulmonar. La enfermedad fibroquística es la más común de las enfermedades genéticas letales en la población blanca15, 16, y es causada por mutaciones en el gen que codifica a la proteína CFTR, un canal de cloruro (Cl-) regulado por AMP cíclico (Fig. 7). El mal funcionamiento del CFTR genera la disminución de la secreción de Cl- y aumento de la absorción de sodio (Na+), seguido de depleción del líquido periciliar. Estudios recientes han demostrado que el CFTR se encuentra mayoritariamente expresado en las células ciliadas17. Aunque la enfermedad FQ afecta numerosos órganos y tejidos (páncreas, intestino, sistema reproductor masculino, conductos biliares, piel) los síntomas más graves se manifiestan en el sistema respiratorio.


Fig. 7.- Regulación purinérgica de la producción de líquido periciliar. En las vías aéreas, el flujo de agua hacia la superficie epitelial está determinado por la secreción de cloruro (Cl-) y la absorción de sodio (Na+). La secreción de Cl- ocurre primordialmente a través del CFTR, aunque las células epiteliales también expresan un canal de Cl- regulado por calcio citosólico (Ca2+), el CACC. En reposo, el ATP extracelular (1-10 nM) es insuficiente para activar al receptor P2Y2 ; los niveles de Ca2+ son bajos y la secreción de Cl- a través del CACC es mínima. La adenosina del líquido periciliar (~100 nM) activa receptores A2B, seguido de aumento de AMP cíclico (AMPc), fosforilacion de proteina quinasa A (PKA) , y activación del CFTR. Con ATP > 100 nM , la activación del receptor P2Y2 induce aumento de Ca2+ y activación del CACC. La absorción de Na+ ocurre a través de su canal específico, el ENaC (epithelial Na+ channel), el cual es inhibido por activacion de receptores P2Y2.

En las células epiteliales de individuos con enfermedad FQ, la disminución de la secreción de Cl- causada por la deficiencia del CFTR podría ser compensada mediante mecanismos que promuevan la activación del receptor P2Y2. Esto ha sido verificado experimentalmente, ya que la estimulación de receptores P2Y2 en células epiteliales FQ promueve la secreción de Cl- ,vía CACC (Fig. 7), revirtiendo la depleción del líquido periciliar característico de estas células.
Resulta paradójico que, mientras las células normales necesitan convertir al ATP por ellas liberado en adenosina para activar CFTR, las células FQ (defectuosas de CFTR) requieren de la estabilidad del ATP extracelular para promover la activación de los receptores P2Y2 y así estimular los canales CACC. La posibilidad de administrar nucleótidos no hidrolizables en forma de aerosol para inducir la producción de líquido periciliar en las vías respiratorias de pacientes con en fermedad fibroquística pulmonar, es tema de extensa investigación.

Perspectivas

Los avances registrados en biología molecular durante las dos últimas décadas han influido en todas las áreas de las ciencias biológicas. Disciplinas tradicionales como la farmacología y la fisiología han experimentado cambios impensables sólo un par de décadas atrás. Gracias a estos cambios, la visionaria hipótesis purinérgica de Bursntock ha sido verificada y aceptada. La existencia de una veintena de receptores purinérgicos que median la acción de nucleótidos extracelulares ha sido corroborada por innumerables trabajos. Hoy nadie discute que el ATP, el UTP, y otros nucleótidos, además de sus funciones esenciales en el metabolismo celular, desempeñan importantes papeles como mensajeros intercelulares en la gran mayoría de los tejidos.
Hemos ilustrado en este artículo cómo la interacción entre receptores purinérgicos, nucleótidos extracelulares y ectonucleotidasas contribuye a la regulación de varios procesos biológicos. En ciertos casos, la acción iniciada por un nucleótido es contrarrestada por el producto de su propia hidrólisis, la adenosina. En este sentido resulta interesante notar que los receptores plaquetarios P2Y (P2Y1 y P2Y12) y P1 (A2a) actúan como pares antagónicos. Así, cuando el ADP es liberado por las plaquetas, los receptores P2Y activados por aquel promueven agregación plaquetaria. Pero a medida que pasa el tiempo las ectonucleotidasas, además de reducir la concentración efectiva de ADP, generan adenosina y por consiguiente activan mecanismos antiagregantes vía A2a. Un efecto antagónico similar entre receptores P1 y P2 ha sido postulado en la regulación del transporte de agua de células hepáticas. La acción de la adenosina no siempre es antagónica respecto a la del ATP. Como hemos visto, en el epitelio respiratorio, el ATP actuando sobre el receptor P2Y2 y la adenosina actuando sobre el receptor A2b promueven complementariamente la secreción de cloruro y agua. Una interacción más compleja entre receptores P2 y P1 ocurre en la respuesta de los neutrófilos durante la inflamación. Allí, el ATP liberado y la adenosina generada localmente tienen un efecto inicialmente sinergístico, estimulando la respuesta quimiotáctica vía receptores P2Y2 y A3 co-localizados en la superficie del seudópodo naciente. Pero la adenosina, al difundir y estimular receptores distales A2a, contrarresta la acción iniciada por los receptores P2Y2 y A3.
Un tema poco investigado en el terreno de las señales purinérgicas es el del papel fisiológico de los receptores P2Y13, y P2Y14. Sólo recientemente se ha podido asociar a estos receptores con funciones específicas18. En el caso del receptor P2Y13, activado por el ADP, se ha postulado que regula el transporte de colesterol en hepatocitos, lo cual tendría implicancias en el tratamiento de la arteriosclerosis. También se ha postulado que este receptor está presente en los glóbulos rojos, aunque su papel en estas células no ha sido elucidado. El receptor P2Y14, que como hemos mencionado se activa por UDP-glucosa, podría estar involucrado en la respuesta inmune, dado que se encuentra abundantemente expresado en neutrófilos, linfocitos y células dendríticas.
Los nuevos conocimientos sobre la acción extracelular de los nucleótidos aportan perspectivas interesantes para entender y tratar numerosas afecciones, algunas de las cuales hemos descrito brevemente en estas líneas. Uno
de los desafíos de la investigación biomédica pasa por desarrollar potentes y selectivos agonistas y antagonistas que permitan manipular las numerosas respuestas controladas por los receptores purinérgicos.

Agradecimientos: Este trabajo fue financiado con subsidios de NIH P01-HL034322, CONICET, UBA y ANPCYT (1432).

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Recibido: 12-8-2008
Aceptado: 20-2-2008