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Medicina (Buenos Aires)

versión impresa ISSN 0025-7680

Medicina (B. Aires) vol.70 no.6 Ciudad Autónoma de Buenos Aires nov./dic. 2010

 

ARTÍCULO ESPECIAL

Rho GTPasas como blancos terapéuticos relevantes en cáncer y otras enfermedades humanas

Pablo Lorenzano Menna1, Georgina A. Cardama1, María J. Comin2, Daniel F. Alonso1, Daniel E. Gómez1

1Laboratorio de Oncología Molecular, Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes,
2Centro Investigación y Desarrollo en Química, Instituto Nacional de Tecnología Industrial (INTI), Buenos Aires

Dirección postal: Dr. Daniel Gómez, Laboratorio de Oncología Molecular, Universidad Nacional de Quilmes, R. Sáenz Peña 352, 1876 Bernal, Buenos Aires, Argentina Fax: (54-11) 4365-7132 e-mail: degomez@unq.edu.ar

Resumen
Las Rho GTPasas son una familia de proteínas clave en la transmisión de señales provenientes del exterior celular hacia efectores intracelulares tanto citoplasmáticos como nucleares. En los últimos año ha habido un desarrollo vertiginoso de múltiples herramientas genéticas y farmacológicas, lo que ha permitido establecer de manera mucho más precisa las funciones específicas de estas proteínas. El objetivo de la presente revisión es hacer foco en las múltiples funciones celulares reguladas por las Rho GTPasas, describiendo en detalle el mecanismo molecular involucrado. Se discute además la participación de estas proteínas en diversas enfermedades humanas haciendo énfasis en su vinculación con el cáncer. Por último, se hace una actualización detallada sobre las estrategias terapéuticas en experimentación que tienen a las Rho GTPasas como blancos moleculares.

Palabras clave: Señalización celular; Citoesqueleto; Migración celular; Enfermedades neurodegenerativas; Cáncer

Abstract
Rho GTPases as therapeutic targets in cancer and other human diseases
. Rho GTPases are a key protein family controlling the transduction of external signals to cytoplasmatic and nuclear effectors. In the last few years, the development of genetic and pharmacological tools has allowed a more precise definition of the specific roles of Rho GTPases. The aim of this review is to describe the cellular functions regulated by these proteins with focus on the molecular mechanism involved. We also address the role of Rho GTPases in the development of different human diseases such as cancer. Finally, we describe different experimental therapeutic strategies with Rho GTPases as molecular targets.

Key words: Cell signaling; Cytoskeleton; Cell migration; Neurodegenerative diseases; Cancer

Los mecanismos de señalización celular son determinantes fundamentales en la coordinación y las funciones de los distintos tipos celulares. Las células reciben información del ambiente, ya sea mediante interacciones célula-célula y célula-matriz u otros estímulos del microambiente tisular, como citoquinas y factores de crecimiento. Diferentes vías de señalización median respuestas celulares, incluyendo cambios en la conformación de proteínas, la actividad enzimática y la regulación de la expresión génica, resultando en cambios morfológicos, migración celular, proliferación, diferenciación o muerte.
Las vías de señalización no se encuentran aisladas, sino que están interconectadas y forman redes complejas con múltiples elementos que se interconectan entre sí. En los procesos fisiológicos cada uno de los elementos está finamente regulado espacial y temporalmente, mientras que la desregulación de vías de señalización lleva al desarrollo de numerosas enfermedades1. En las últimas décadas se han descripto vías y elementos involucrados en la señalización celular, entre los cuales se encuentran las proteínas Rho GTPasas. Las proteínas Rho forman una de las subfamilias de la superfamilia Ras de GTPasas. Los más de cincuenta miembros de dicha superfamilia se agrupan en función de la homología de su composición aminoacídica en las siguientes subfamilias: Ras, Rho, Rab, Arf y Ran que se detallan en la Tabla 1 2. Estas proteínas tienen pesos moleculares semejantes (20-25 kDa) y se denominan genéricamente “GTPasas pequeñas” (small GTPases, o también small GTP-binding proteins), diferenciándose así del resto de las proteínas con actividad GTPasa como las proteínas G heterotriméricas.

TABLA 1.- Clasificación de los miembros de la Superfamila Ras

La subfamilia Rho en mamíferos está formada por varios miembros: RhoA, B, C, D y E; Rac 1, 2 y 3; Cdc42, TC10 y otras. Estas proteínas son estructuralmente muy parecidas (40 a 95% de identidad en su composición aminoacídica), además de tener un tamaño muy similar (190-195 aminoácidos)3.
Una de las principales características de las proteínas Rho, como de todas las proteínas G, es que unen nucleótidos de guanina y ciclan entre un estado inactivo unidas a GDP y un estado activo unidas a GTP (Fig. 1). Estas proteínas al igual que Ras tienen actividad GTPasa endógena, pudiendo hidrolizar el GTP a GDP en un proceso dependiente de Mg2+. Se asume que las proteínas de la superfamilia Ras se activan para interaccionar con sus efectores cuando se encuentran unidas a GTP, los cuales a su vez interactúan con otras proteínas produciendo una cascada de señalización.


Fig. 1.- Modelo de regulación de Rho GTPasas. Las proteínas actúan como transductores de señales al ser activados por GEFs, que responden a una gran variedad de estímulos extracelulares a través de la activación de diferentes receptores de membrana. La conformación activa de Rho es capaz de unirse a diversos efectores celulares, regulando así variadas funciones celulares.

Las Rho GTPasas tienen dominios funcionales comunes, similares a los de Ras. Estos dominios consisten en cuatro regiones que participan en la unión e hidrólisis del nucleótido de guanina (G1, G3, G4 y G5), una secuencia terminal CXXX (donde C es cisteína y X cualquier otro aminoácido) y una región G2 involucrada en la interacción con moléculas efectoras4.
El motivo CXXX localizado en el -COOH terminal actúa como señal para tres modificaciones post-transduccionales secuenciales: prenilación, proteólisis y metilación. Las GTPasas sintetizadas de novo son citosólicas y posteriormente se modifican por la adición, al grupo sulfhidrilo de la cisteína de un grupo isoprenilo farnesilo de 15 carbonos o geranilgeranilo de 20 carbonos. La proteína prenilada es entonces modificada por proteólisis de los tres últimos aminoácidos en el extremo carboxi-terminal y metilación del grupo carboxilo de la cisteína. Las modificaciones post-transduccionales no afectan la actividad GTPasa pero son esenciales para la función biológica de estas proteínas, ya que controlan su anclaje a la membrana celular y por ende su localización dentro de la célula5.
La alternancia entre los estados inactivo-activo de las proteínas Rho está altamente regulada por proteínas que regulan la actividad de GTPasa o el intercambio de nucleótidos. Existen tres clases de proteínas reguladoras: (a) los factores intercambiadores de guanina (GEF, guanine exchange factors), que activan a las GTPasas incrementando la tasa de liberación del nucleótido unido y por lo tanto facilitando el intercambio de GDP por GTP; (b) las proteínas activadoras de la actividad GTPasa (GAP, GTPase-activating protein) que estimulan la actividad de GTPasa endógena y así facilitan la hidrólisis de GTP a GDP; (c) los inhibidores de la disociación de GDP (GDI, GDP-dissociation inhibitors), que inhiben la disociación del GDP previniendo su reemplazo por GTP6, 7.
Las Rho GTPasas regulan la morfología celular y la reorganización del citoesqueleto de actina. De tal forma, Rho puede ser activado por ligandos extracelulares como ácido lisofosfatídico y regular la formación de fibras de estrés. Rac es activado por distintos factores de crecimiento como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o la insulina, dando lugar a la formación de lamelipodios y ondulaciones de membrana conocidas como ruffles. En cambio, la activación de Cdc42 produce filopodios8-11. Los cambios morfológicos inducidos por las formas activadas de esta familia de GTPasas comparten muchos aspectos: incremento en la polimerización de actina, agrupamiento de integrinas y ensamblaje de complejos de proteínas citoesqueléticas (contactos focales). Los contactos focales tienen una función importante en los mecanismos de transducción de señales. La adhesión celular mediada por integrinas dispara la fosforilación en tirosinas, el flujo de iones y el metabolismo lipídico que finalmente, de manera conjunta o individualmente, afectan la expresión de genes, la progresión del ciclo celular y los procesos de apoptosis8, 11, 12.
Además de las acciones sobre el citoesqueleto, Rho, Rac y Cdc42 regulan una gran variedad de funciones celulares, mediando la regulación transcripcional de determinados genes. Rac, por ejemplo, estimula la cascada de Jun quinasa (JNK) y transmite así información al núcleo para regular la expresión de un número importante de genes13-15.
Si bien se han descripto diferentes procesos celulares modulados por Rho GTPasas, es importante destacar que los eventos celulares están regulados por redes de señalización intercomunicadas y no por una única cascada de señalización. Es así como un mismo estímulo en diferentes contextos puede provocar diferentes respuestas.
Un ejemplo de intercomunicación entre Rho GTPasas y otras vías es la regulación de la Rac-GAP β2-quimerina mediante proteína-quinasa C (PKC). En este sentido, se comunicó recientemente que en condiciones normales la β2-quimerina permanece en un estado inactivo en el citosol. Cuando el receptor de EGF es estimulado, se genera diacilglicerol (DAG) mediante fosfolipasa C y activa a PKCd, que a su vez fosforila a β2-quimerina en un residuo de serina. Esta fosforilación impide su traslocación a membrana y permanece inactiva en el citosol. Por otro lado, cuando este GAP no está fosforilado, es activado de manera alostérica por DAG, ya que β2-quimerina cuenta con un dominio C1 al igual que PKC, y fosfolípidos acídicos en la membrana plasmática donde es capaz de inactivar a Rac16.
Asimismo, existen evidencias de intercomunicación entre las diferentes Rho GTPasas, donde Rho y Rac se regulan mutuamente modulando así diferentes procesos celulares17-19.

Principales efectores de Rho GTPasas

La gran variedad de funciones biológicas de los distintos miembros de la familia de las Rho GTPasas está dada por la unión a distintos efectores celulares. Se conocen más de cincuenta efectores de Rho, Rac y Cdc42 que incluyen serina-treonina quinasas, tirosina-quinasas, lípido-quinasas, lipasas, oxidasas y proteínas estructurales (scaffold proteins)20, según se presentan en la Tabla 2.

TABLA 2.- Principales efectores de Rho GTPasas y sus funciones

a JNK: c-Jun N-terminal quinasa
b PIP3: Fosfatidil inositol 3-fosfato

El grupo de proteínas efectoras más conocidas es el que está involucrado en la reorganización del citoesqueleto de actina. Se conocen al menos dos efectores de Rho, la Rho quinasa (ROCK) y la formina mDia, los cuales se requieren para el ensamblaje de fibras de estrés, la formación de adhesiones focales y la unión de actina a la membrana. Por otra parte, proteínas efectoras de Cdc42 como WASP y N-WASP (Wiskott-Aldrich sindrome proteins) están involucradas en la formación de filopodios. A su vez, estas proteínas se unen directamente a monómeros de actina y activan al complejo Arp2/3, el cual actúa como un sitio de nucleación para comenzar la polimerización21. Por su parte, Rac también es capaz de activar el complejo Arp2/3 mediante la interacción con WAVE (WASP-like verprolin-homologous protein) provocando la formación de lamelipodios. Otro de los efectores importantes tanto de Rac como de Cdc42 es la familia de PAK (p21-activated kinase), capaces de activar a LIM quinasa y así modular la longitud de los microfilamentos.
De su rol preponderante en la regulación del citoesqueleto de actina, se desprende la contribución de la familia de las Rho GTPasas en la regulación de la morfología celular, las interacciones célula-célula, polaridad celular y migración.
Otro de los procesos regulados por Rho GTPasas es la organización intracelular de microtúbulos jugando un rol importante en la polaridad celular y en la distribución de organelas intracelulares y del huso mitótico. En este caso, proteínas como Op18/estatmina están reguladas por el efector PAK, mientras que el efector IQGAP tiene un rol importante tanto en la organización del citoesqueleto de microtúbulos como de actina20.
Además de su efecto sobre el citoesqueleto, las Rho GTPasas regulan diferentes vías de transducción de señales que llevan a cambios en la expresión génica. Las proteínas Rho regulan a factores de transcripción como SRF (serum response factor) y NFκB y a diferentes vías de señales como JNK (c-jun N-terminal kinase) y p38 MAP quinasa.
Por otra parte, las Rho GTPasas son capaces de influenciar diferentes actividades enzimáticas. Uno de los primeros blancos de Rac identificados fue p67phox, un componente estructural del complejo NADPH oxidasa que se encuentra en células fagocíticas. A partir de estos datos, se comunicó que Rac promueve la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en varios tipos celulares diferentes, actividad posiblemente mediada por la familia de oxidasas Nox21.
Las Rho GTPasas controlan múltiples aspectos de la progresión de la fase G1 y de la fase M en el ciclo celular, ya que controlan vías mitogénicas como ERK, activan proteínas, como Par6, claves en la división celular y modulan la expresión de moléculas reguladoras del ciclo celular como ciclina D1.

Papel en enfermedades humanas

Como hemos expuesto, las Rho GTPasas tienen un rol central en la regulación de diversos procesos celulares, por lo que su alteración o desbalance puede ser la causa molecular de diversas enfermedades del ser humano. Debido a que las Rho GTPasas median un gran número de eventos celulares, como reorganización del citoesqueleto, ciclo celular, tráfico vesicular, migración o apoptosis, las aberraciones en las vías de señalización asociadas a estas proteínas, cumplen un rol esencial en un grupo heterogéneo de enfermedades que incluyen a cáncer, desordenes neurodegenerativos, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias crónicas.

Cáncer

Se conocen varias mutaciones causantes de afecciones tanto en proteínas reguladoras (GAPs, GEFs, GDIs) como proteínas efectoras de Rho GTPasas22. Sin embargo, sólo se cuenta con un ejemplo de mutación en Rho GTPasas en humanos y corresponde a RhoH encontrado en linfomas no-Hodgkin y mieloma múltiple23.
Tradicionalmente, se ha asociado la sobreactivación de vías de señalización de Rho GTPasas con la transformación maligna. Las primeras evidencias provienen de ensayos en los que Rac1 constitutivamente activo, y en menor medida RhoA, inducen transformación maligna en fibroblastos y tumorigenicidad en ratones atímicos, siendo además requeridos para la trasformación mediada por Ras24, 25. Actualmente se conocen muchos tipos de cáncer en los cuales las vías de señalización de Rho GTPasas se encuentran alteradas. Entre ellos se encuentran cáncer de páncreas, cáncer de mama, melanoma, carcinomas colorrectales, leucemias, osteosarcomas, carcinomas hepatocelulares, neuroblastomas, carcinomas de pulmón (tanto de células pequeñas como de células no-pequeñas), cáncer gástrico y glioblastomas26.
Las Rho GTPasas están implicadas en diferentes procesos asociados al cáncer, como la proliferación celular, migración, invasión y metástasis debido a que estas proteínas son mediadores comunes en múltiples vías oncogénicas. En particular, se estableció que estas proteínas regulan la transición de fase G1 a fase S del ciclo celular de células tumorales, modulando los niveles de expresión de ciclina D1 y de los inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (CDKs)27. Por otro lado, las proteínas Rho influyen en la supervivencia celular, ya que Rac, Rho y Cdc42 regulan positivamente la transcripción mediada por NFκB28, evitando que las células transformadas entren en apoptosis. Sin embargo, se ha podido demostrar que podrían estar mediando señales anti o pro-apoptóticas en función del contexto celular y tisular29-33.
Con respecto a la motilidad celular, las proteínas Rho cumplen un rol crucial en la adquisición de propiedades migratorias e invasivas de las células tumorales, ya que están implicadas en la remodelación del citoesqueleto de actina, en la adhesión intercelular mediada por cadherinas y en la remodelación de la matriz extracelular3. Particularmente, se publicó que Rac1 es una proteína clave en el proceso invasivo de tumores como el meduloblastoma pediátrico34. En modelos de glioblastoma multiforme Rac1, Rac3 y ciertos GEFs median la capacidad migratoria e invasiva de dichos tumores35-37.
En cuanto al estado de las proteínas reguladoras de las GTPasas afectadas, uno de los ejemplos más estudiados en cáncer es el Rac-GEF Tiam1 (T-cell lymphoma invasion and metastasis 1). Si bien las GTPasas no son consideradas oncogenes, Tiam1 sí lo es, ya que está implicado en la transformación oncogénica de fibroblastos38, 39. El gen tiam1 fue identificado a partir de un ensayo de mutagénesis insercional en un modelo de linfoma de células T, donde se realizó una selección in vitro de clones altamente invasivos. Así se estableció que Tiam1 aumenta la capacidad invasiva y el potencial metastático de células tumorales39. Adicionalmente, los niveles de Tiam1 se encuentran elevados y pueden ser correlacionados con el pronóstico de carcinomas prostáticos humanos y de carcinomas nasofaríngeos y con el grado de progresión de tumores mamarios3, 40, 41.
Por su parte, los niveles de expresión de β2-quimerina, un GAP específico de Rac, se encuentran significativamente disminuidos tanto en líneas tumorales mamarias humanas como en tumores mamarios con respecto a tejidos normales42. La sobreexpresión de β2-quimerina en un modelo de carcinoma mamario murino provoca la reducción de la tasa de crecimiento tumoral así como también disminuye la capacidad invasiva y el número de metástasis pulmonares43.
Entre los muchos efectores diferentes de Rho GTPasas, cuatro de ellos están directamente vinculados con la transformación maligna mediada por las proteínas Rho. En primer lugar, se puede citar a la familia de las proteínas WASP, las cuales son efectores de Rac y de Cdc42 y están vinculadas con la reorganización del citoesqueleto de actina. Esto impacta sobre la regulación de la migración celular, de la formación de filopodios, ondulaciones de membrana y podosomas. Otro de los efectores descriptos es IQGAP, el cual interactúa con Rac1 y Cdc42 y está implicado en la formación de ondulaciones de membrana y en las uniones célula-célula mediadas por E-cadherina44, 22.
El rol de las proteína-quinasas Pak en cáncer está ampliamente descripto. Estas quinasas presentan más de 40 posibles sustratos diferentes y median procesos biológicos como proliferación celular, supervivencia celular, motilidad celular, angiogénesis, crecimiento independiente de sustrato, entre otras45. Se ha descripto que mediante Rac activo, Pak es capaz de activar a PKCγ, evento indispensable para la interacción con la proteína fascina mediando la migración celular en un modelo de carcinoma de colon humano46.
Por último, se ha descripto a las proteínas de la familia de proteín-quinasas ROCK, efectores directos de las proteína RhoA, las cuales median efectos sobre el citoesqueleto como formación de fibras de estrés y ensamblaje de adhesiones focales44, 22.

Desórdenes neurodegenerativos

Debido a que las Rho GTPasas están implicadas en distintos fenómenos neuronales, la desregulación de estas vías de señalización está asociada a múltiples desórdenes neurodegenerativos. En particular, las Rho GTPasas están involucradas en la migración y polarización neuronal, en la guía axonal y la formación de dendritas y también en la organización sináptica y en la plasticidad.
El ensamblaje de redes neuronales funcionales en el desarrollo animal se basa en la polarización de neuronas. Diversas señales extra e intracelulares convergen en la regulación del citoesqueleto, siendo las Rho GTPasas uno de los reguladores intracelulares más importantes47. En un trabajo muy reciente, se propone a Rac1 y Rac3 como proteínas claves en el desarrollo del sistema nervioso, donde juegan roles complementarios en estadios tardíos del desarrollo neuronal y cerebral48.
Se conoce desde hace décadas que el retraso mental está asociado con anomalías en las dendritas y las espinas dendríticas. Sin embargo, en los últimos años se lograron describir algunos mecanismos celulares causantes del retraso mental, la cual es una discapacidad caracterizada por una deficiencia global en habilidades cognitivas. Se clonaron siete genes causantes del retraso mental no específico ligado al cromosoma X, un grupo heterogéneo de desórdenes asociados al cromosoma X. Se sabe que tres de estos genes están asociados directamente a la vía de las Rho GTPasas: un Rho-GAP (oligofrenina1), un efector de Rac y Cdc42 (Pak3) y un GEF de Rac y Cdc42 (αPix). Diferentes grupos reportaron que mutaciones en estos genes están presentes en el retraso mental no-sindrómico asociado al cromosoma X49.
Existen evidencias que indican que el mecanismo de endocitosis, la macropinocitosis, y el posterior tráfico vesicular serían indispensables para la integridad de neuronas motoras. En este sentido, un GEF (Als) y las GTPasas Rab5 y Rac1 están implicadas en estos eventos celulares, viéndose afectadas en enfermedades neurodegenerativas
como la esclerosis lateral amiotrófica, la cual consiste en la disminución gradual y muerte de neuronas motoras provocando parálisis muscular progresiva22, 50. También se han asociado diferentes proteínas implicadas en las vías de Rho GTPasas, como Cdc42 y WASP, en la enfermedad de Huntington, la cual es un desorden neurodegenerativo progresivo que afecta la coordinación muscular y algunas funciones cognitivas51.
Por otro lado, se comunicó que Pak, efector de las GTPasas Rac y Cdc42, presenta niveles de activación disminuidos y una traslocación aberrante del citosol a la membrana en el cerebro de pacientes con Alzheimer y en ratones transgénicos con enfermedad de Alzheimer52.

Otras enfermedades

Se ha especulado sobre el rol de Rho GTPasas en otras enfermedades, incluyendo autoinmunidad y desórdenes inflamatorios. La activación de Rho GTPasas es un evento clave en la coordinación de las respuestas inmunes, en particular en la activación de linfocitos T. Defectos en la regulación de la activación de células T, su expansión y la supervivencia son la base para la patogénesis de varias enfermedades autoinmunes, como el lupus eritematoso sistémico y la esclerosis múltiple, donde se sugieren a las Rho GTPasas como componentes claves de la patofisiología53, 54.
En el síndrome de Wiskott-Aldrich, que presenta una desregulación inmunológica y microtrombocitopenia, se describió un mecanismo biológico responsable, caracterizado por la desregulación del citoesqueleto de actina en células hematopoyéticas, evento regulado principalmente por proteínas como WASP, Cdc42 y el complejo Arp2/3. Las aberraciones en estas vías de señalización se traducen en defectos en la polarización celular y motilidad55.
Adicionalmente, se ha descripto que vías de señalización aberrantes asociadas a la GTPasa Rac1 son claves en afecciones inflamatorias crónicas como la enfermedad de Crohn y de Bowel, causando una resistencia aumentada a la apoptosis de linfocitos T CD4+56, 57.
Por otro lado, se cuenta con evidencias en modelos animales que sugieren que la vía mediada por RhoA/ROCK es importante en la patogénesis de la hipertensión pulmonar arterial, enfermedad caracterizada por un aumento progresivo de la presión arterial pulmonar y de la resistencia vascular debido a la vasoconstricción pulmonar y remodelado de la vasculatura, así como también a la inflamación58.

Rho GTPasas como blancos terapéuticos

La acumulación de evidencias que relacionan a las Rho GTPasas con diferentes enfermedades humanas, las ha convertido en blancos de diferentes estrategias terapéuticas a nivel molecular, tal como se observa en la Fig. 2. En este sentido, es en cáncer donde más se han estudiado estas estrategias, aunque también existen reportes en trastornos inmunológicos y neurodegenerativos.


Fig. 2.- Diferentes estrategias utilizadas para interferir en procesos regulados por proteínas Rho. (a) depletar el pool de precursores isoprenoides mediante estatinas. (b) inhibición del agregado de motivos isoprenoides a proteínas Rho inhibiendo farnesiltrasnferasas y geranilgeranilo-transferasas. (c) inhibición del ciclo de activación de Rho GTPasas, ya sea inhibiendo interacción Rho-GEF (NSC23766), Rho-Efector (EHT-1864) o acumulando una conformación inactiva de Rho en el citosol (azatioprina). (d) Inhibiendo a efectores de Rho GTPasas.

Uno de los caminos más prometedores de búsqueda de nuevas terapias para inhibir desarrollo tumoral y metástasis es utilizar como blancos moleculares proteínas clave en vías de señalización oncogénicas. Más aún, el diseño racional de drogas es considerado como la estrategia que revolucionará la clínica en el futuro59.
En el caso del cáncer, un blanco molecular ideal sería aquel que resulte esencial para el crecimiento y supervivencia de las células tumorales, pero del cual las células normales pudieran prescindir. Sin embargo, existen pocas proteínas blanco que cumplen con esta premisa. Otro tipo de blanco ideal sería aquel que no está presente en el tejido normal o aquellas proteínas señalizadoras implicadas en el proceso de angiogénesis.
En la práctica, la gran mayoría de los blancos moleculares que permitieron el desarrollo exitoso de nuevas drogas caen en un pequeño número de categorías. Hasta el momento, anticuerpos monoclonales, pequeñas moléculas inhibidoras y la combinación de ambos fueron las estrategias más exitosas en los ensayos clínicos60.
Uno de los ejemplos más importantes es el imatinib (Gleevec®), cuyo blanco es la proteína ABL (Abelson laeukemia viral oncogen), una tirosina-quinasa constitutivamente activa que promueve la proliferación de células mieloides inmaduras. Este compuesto inhibe la fosforilación de proteínas “río abajo” de ABL, inhibiendo a células BCR-ABL positivas61, 62.
Otros ejemplos de drogas desarrolladas bajo el concepto de blanco molecular en cáncer son el monoclonal trastuzumab (Herceptin®) cuyo blanco es el receptor HER2 y el gefitinib (Iressa®) una pequeña molécula inhibidora del receptor de EGF, entre otros62. También se han desarrollado estrategias para el diseño de agentes terapéuticos cuyo blanco molecular es PKC, para la cual se han descripto varios puntos de interacción con las vías de Rho GTPasas. Algunos inhibidores de su actividad catalítica, así como también activadores selectivos de diferentes isoenzimas, están siendo estudiados en fase clínica I, II y III63-66.
Las proteínas Rho participan de manera activa en múltiples procesos celulares, los cuales pueden estar relacionados en particular con la invasión y metástasis tumoral. Existen varios pasos en las vías de señalización de Rho GTPasas que pueden ser blanco de agentes terapéuticos. Las proteínas Rho requieren de la adición post-traduccional de restos lipídicos en su región carboxiterminal, en este sentido se han desarrollado un gran número de compuestos encaminados a prevenir esta modificación. Dentro de estos compuestos están los inhibidores de la farnesil-transferasa y los inhibidores de la gerenilgeranilo-transferasa, ambas enzimas son las
principales encargadas de la adición de restos lipídicos a las pequeñas GTPasas en general. Estos compuestos demostraron tener un alto efecto antitumoral encontrándose varios en fases clínicas de experimentación44, 67.
También se cuenta con inhibidores de la HMG-CoA reductasa, llamados estatinas, que bloquean la síntesis de precursores isoprenoides, disminuyendo así los niveles de colesterol y de Rho GTPasas con las modificaciones lipídicas requeridas. Una de las posibles desventajas de la inhibición de la isoprenilación es la poca selectividad encontrada para las diferentes GTPasas. Sin embargo, estudios clínicos indican que afectan a la progresión tumoral68, 69. Adicionalmente, hay estudios clínicos en fase I en curso para determinar el efecto de simvastatina sobre la inflamación de las vías aéreas de pacientes con fibrosis quística70.
Otra de las estrategias utilizadas ha sido inhibir las proteínas efectoras, modulando así de una forma más específica la vía. El compuesto Y-27632 es un inhibidor específico de la proteína ROCK, una quinasa activada por RhoA. Este compuesto demostró un fuerte efecto anti-metastásico en varios modelos tumorales in vivo. Por otro lado, se informó que la utilización de este inhibidor puede disminuir la neurotoxicidad provocada por la exposición a drogas anticancerígenas como cisplatino y metotrexato71.
Otro inhibidor competitivo de ROCK, el compuesto Wf-536, demostró ser un inhibidor de la angiogénesis, del crecimiento tumoral y de metástasis in vivo72.
Una tercera estrategia que ha sido explorada es la de inhibir el ciclo de activación de las proteínas Rho. Mutantes de Rho que secuestran los Rho-GEF en complejos no funcionales inaccesibles para las proteínas Rho endógenas son capaces de bloquear la función de estas proteínas. Se ha demostrado que la toxina fúngica brefeldina A interfiere con la GTPasa ARF1, uniéndose al complejo ARF1-GEF y convirtiendo a este en un complejo no funcional73. Al respecto, se han identificado y caracterizado varios compuestos capaces de inhibir esta interacción74, 75. El primer compuesto que se caracterizó es el NSC23766 que inhibe la activación de Rac mediante Tiam1 y Trio, uniéndose a la superficie de Rac impidiendo la interacción con dichos GEFs75.
Una de las drogas inmunosupresoras ampliamente utilizada en enfermedades inflamatorias crónicas -como la enfermedad de Bowel- es la azatioprina y su metabolito 6-mercaptopurina. Si bien son drogas ampliamente utilizadas, su mecanismo de acción fue recientemente dilucidado y se propuso a Rac1 como blanco específico en linfocitos T57. Posteriormente, nuestro grupo informó que la azatioprina y su metabolito son capaces de disminuir los niveles de Rac1 activo en un modelo de carcinoma mamario murino in vitro76.
La redundancia entre diferentes vías y la plasticidad de las mismas permite a las células tumorales adaptarse y superar múltiples condiciones estresantes tanto microambientales como terapéuticas. Esto implica que terapias con un único blanco altamente específico no siempre
alcancen los niveles de eficacia esperados. Por ello, se requieren diferentes estrategias terapéuticas77.
Una opción es combinar drogas moduladoras de múltiples vías de señalización. Las combinaciones con mejores perspectivas podrían ser las que incluyan a agentes que actúan inhibiendo señales de supervivencia en múltiples vías de transducción.
Dokmanovic y col. demostraron que Rac1 se encuentra sobreactivada en células SKBR3 de cáncer de mama, positivas para ErbB2, que habían adquirido resistencia al trastuzumab (anticuerpo monoclonal que inhibe el receptor ErbB2) a diferencia de la variable parental sensible a este tratamiento78. Además, demostraron que la inhibición específica de Rac1 con NSC23766 era capaz de restaurar la sensibilidad al trastuzumab de las células SKBR3 resistentes. En la misma línea, Halatsch y col. demostraron que la sobreexpresión de Rac1 está relacionada con la adquisición de resistencia a erlotinib (anticuerpo monoclonal que inhibe el receptor de EGF) en 9 líneas celulares de glioblastoma multiforme humano79. Estos resultados sugieren la potencial acción cooperativa entre compuestos que actúan sobre distintos blancos moleculares vinculados en vías de señalización utilizadas por las células tumorales para mantener el fenotipo transformado.
En el mismo sentido se pueden citar varios casos que han sido publicados o evaluados, entre los cuales se encuentran la combinación de inhibidores del receptor de EGF con inhibidores de la serin-treonina proteína kinasa mTOR, inhibidores de la farnesilación-geranilación de proteínas de la familia Ras en combinación con inhibidores de la kinasa regulatoria Chk1, inhibidores de las proteínas de la familia Bcl-2 combinadas con inhibidores de la actividad degradativa del proteosoma, etc.77.
Por otro lado, uno de los indicios de progresión tumoral en cáncer mamario y de próstata es el paso de su condición hormono-dependiente a hormono-independiente. Los tumores hormono-dependientes requieren de hormonas específicas para su crecimiento, lo cual los hace sensibles a terapias anti-hormonales, mientras que los tumores hormono-independientes no requieren de tales hormonas específicas para su crecimiento, por lo cual se hacen resistentes a los tratamientos anti-hormonales. En los últimos años se ha reportado que la vía de señalización de Rac1 está implicada en la hormono-independencia de tumores prostáticos in vitro e in vivo80, 81. Por su parte, el efector Pak y el GEF AND-34 podrían estar asociados a la hormono-independencia en tumores mamarios82, 83. Estos datos sustentarían el uso de terapias antihormonales combinadas con inhibidores de la vía de señalización de Rac en el tratamiento de tumores hormono-independientes de mama y próstata.
Las Rho GTPasas también fueron vinculadas con el aumento del potencial invasivo de glioblastomas posterior a la exposición a radioterapia, una de las estrategias terapéuticas actuales para el tratamiento de este tipo de tumor altamente refractario. Se propone así la posibilidad de inhibir farmacológicamente la vía de señalización de Rac con el objetivo de aumentar la eficacia terapéutica de la radioterapia84-86.
Está claro que la función de las proteínas Rho contribuye a la pérdida del control del crecimiento celular, al fenotipo invasivo en varios tipos tumorales e incluso a la resistencia al tratamiento. Adicionalmente, se ha establecido el rol preponderante de las Rho GTPasas en enfermedades neurodegenerativas e inmunológicas. Si bien aún quedan muchas preguntas por responder en cuanto a los mecanismos celulares y moleculares mediados por esta familia de proteínas, los estudios existentes muestran el gran potencial terapéutico asociado al diseño racional de drogas cuyos blancos moleculares sean las Rho GTPasas.

Agradecimientos: Georgina Cardama es becaria y Pablo Lorenzano Menna, Daniel Alonso y Daniel Gómez son miembros de la Carrera del Investigador Científico del CONICET. María J. Comin es Investigadora en el Instituto Nacional de Tecnología Industrial.

Conflictos de interés: No existen conflictos de interés.

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Recibido: 26-6-2010
Aceptado
: 12-8-2010