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Medicina (Buenos Aires)

versión impresa ISSN 0025-7680

Medicina (B. Aires) vol.72 no.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ene./feb. 2012

 

CARTA AL COMITÉ DE REDACCIÓN

Amplificación del oncogén Her-2/neu en el carcinoma mamario

 

La determinación del estado de amplificación génica del Her-2/neu es crucial en el cáncer de mama porque permite seleccionar pacientes que se beneficiarían del tratamiento con trastuzumab. El trastuzumab es un anticuerpo monoclonal diseñado específicamente para reconocer y unirse a la proteína HER2. Según trabajos clínicos publicados, reduce un 50% el riesgo de recurrencia del cáncer en estadio temprano (utilizado en adyuvancia durante el lapso de un año)1 y reduce un 20% el riesgo relativo de muerte en pacientes con cáncer de mama metastásico (asociado a quimioterapia vs. quimioterapia solamente)2. La amplificación del oncogen Her-2/neu determina que cada copia del gen puede ser transcripta y traducida llevando a una sobreproducción de ARNm y de la proteína correspondiente. La célula normal que expresa HER2 posee amplificación del gen Her-2/neu y alrededor de 50 000 copias de la proteína en la membrana celular3. Las células tumorales pueden tener un incremento en el número de receptores a nivel de la membrana citoplasmática de hasta 20 veces sobre el valor normal, conduciendo a la célula a un crecimiento descontrolado. La amplificación/sobreexpresión de oncogén en el tejido tumoral mamario es positiva en el 25-30% de los casos4. Existen diferentes maneras de detectar la amplificación del gen Her-2/neu o el incremento en la expresión de la proteína HER2 en el tumor. Si se quiere detectar la amplificación génica se puede utilizar Southern Blot, hibridación in situ fluorescente (FISH) o PCR; para el aumento del trancripto Northern Blot, y para el aumento de la proteína HER2 Western Blot o inmunohistoquímica (IHQ). La técnica elegida por los laboratorios de Anatomía Patológica por ser costo/beneficio sustentable es la IHQ. Las limitaciones de este método se ven reflejadas en un grupo de tumores con resultado indefinido 2+ (resultados intermedios entre positivos 3+ y negativos 0/1+). En estos casos se recurre al FISH considerado método gold standard.
Diseñamos un ensayo en CEMIC con el objetivo de analizar las dificultades y accesibilidad de la hibridación in situ cromogénica (CISH) en relación al FISH. EL CISH es una técnica de hibridación que permite ver señales de amplificación del gen conjuntamente con la morfología del tejido. Fueron seleccionadas 30 muestras, de un total de 210, con cáncer primario de mama con resultado equívoco de IHQ (2+) e informe confirmatorio de FISH. A esta población se le realizó CISH para Her2/neu por duplicado (sonda SP•T-Light® HER2 Zymed, Hannover, GE). A partir de los resultados de este estudio transversal, se realizó el análisis estadístico para evaluar la exactitud diagnóstica del test. Dos casos no amplificados por FISH resultaron amplificados en forma baja con CISH (11% de falsos positivos) (Tabla 1). La sensibilidad del CISH con respecto al FISH fue de 100% al no hallarse resultados falsos negativos. La especificidad fue del 80%. La concordancia entre FISH y CISH fue de 24/26, es decir que la exactitud global del CISH con respecto al gold standard fue de 92%, teniendo en cuenta los casos que resultaron evaluables por CISH y descartando los no reactivos.

TABLA 1.- Resultados de la amplificación del gen Her-2/neu en 30 muestras de cáncer de mama primario mediante FISH y CISH.

En conclusión, y como ya fue demostrado en otros estudios, la exactitud global del CISH resultó comparable al FISH5, 6.
Nuestra experiencia al iniciarnos en la técnica de CISH puede ser de utilidad para otros laboratorios cuando se trata de optar por uno u otro método. El CISH no requirió equipamiento costoso, solo se utilizó un microscopio óptico que se puede encontrar presente en cualquier laboratorio de Anatomía Patológica, y además facilita la lectura de los resultados al poder apreciar simultáneamente la morfología del tejido. Por el contrario, la técnica FISH implica utilizar un microscopio de fluorescencia no accesible para la mayoría de los centros en nuestro medio. Observar la morfología del tejido con la técnica CISH nos permitió asegurar que las señales provenían del componente infiltrante del cáncer y encontrar las células neoplásicas cuando se disponían aisladamente. Por otro lado, permitió utilizar células normales del tejido mamario o linfocitos acompañantes como controles negativos intrínsecos. Si bien el CISH
detecta el número de copias por núcleo del gen Her-2/neu al igual que el FISH, los materiales necesarios para realizar la técnica y la sonda específica a utilizar fueron más económicos que los de FISH. Los preparados del CISH fueron archivados a temperatura ambiente con el resto de los preparados de hematoxilina-eosina e IHQ. Al emitir una señal que perdura en el tiempo, se contó con dichos preparados para una posterior revisión; no siendo necesario recurrir a un archivo fotográfico, utilizado en el FISH donde la señal decae en el tiempo.
Con respecto a la interpretación de los resultados, con CISH fue menos compleja que con la técnica FISH. Si bien el objetivo óptico 40X seco es el recomendado por los catálogos de la sonda para leer los resultados de CISH, en la mayoría de los casos resultó beneficioso complementarlo con un objetivo 60X seco o 100X de inmersión para mayor comodidad al contar el número de puntos en cada núcleo. Es importante aclarar que siempre se usó el control positivo que venía con el kit, el cual funcionó en todos los casos. Es posible que la dificultad en la lectura de CISH en algunos casos se haya debido a señal débil (a pesar de la señal fuerte del testigo) con mucha señal de fondo. Ha sido publicada una menor efectividad del procedimiento debido a la utilización de alcohol-formol-ácido acético como fijador6, pero en todos nuestros casos se usó formol-buffer neutro. Obtuvimos cuatro casos no reactivos por CISH y reactivos por FISH. Estos casos no deberían ser considerados como falsos negativos ya que los controles internos (células no neoplásicas) permiten discriminarlos. Las posibles explicaciones serían las variaciones en el tiempo de fijación de las piezas operatorias o la curva de aprendizaje del método.
Para finalizar, nuestra experiencia con CISH demostró que puede ser un método al alcance de los laboratorios con experiencia en la realización de técnicas de inmunohistoquímica.

Mariana Cánepa1, Valeria Deninghoff1-2, Florencia Perazzo3, Fernando Paesani4, Silvana Nieto1, Alejandro García1, Alejandra Avagnina1, Boris Elsner1

1Servicio de Anatomía Patológica, Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas Dr. Norberto Quirno (CEMIC),
2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET),
3Servicio de Oncología Clínica, CEMIC,
4Departamento de Ginecología y Obstetricia, CEMIC, Buenos Aires

e-mail: vdenninghoff@cemic.edu.ar

1. Romond EH, Perez EA, Bryant J, et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 2005; 353:1673-84.         [ Links ]

2. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 2001; 44:783-92.         [ Links ]

3. Ni R, Mulligan AM, Have C, O'Malley FP. PGDS, a novel technique combining chomogenic in situ hybridization and immunohistochemistry for the assessment of ErbB2 (HER2/neu) status in breast cancer. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2007; 15:316-24.         [ Links ]

4. Slamon DJ, Godolphin W, Jones LA, et al. Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer. Science 1989; 244:707-12.         [ Links ]

5. Bhargava R, Lal P, Chen B. Chromogenic in situ hybridization for the detection of Her-2/neu gene amplification in breast cancer with an emphasis on tumors with borderline and low-level amplification. Am J Clin Pathol 2005; 123:237-43.         [ Links ]

6. Arnould L, Denoux Y, MacGrogan G, et al. Agreement between chromogenic in situ hybridisation (CISH) and FISH in the determination of HER2 status in breast cancer. Br J Cancer 2003; 88:1587-91.         [ Links ]