SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.73 número1Osteomalacia por tumor secretor de FGF-23Disnea y petequias luego de una fractura bilateral de tibia índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Servicios Personalizados

Revista

Articulo

Indicadores

  • No hay articulos citadosCitado por SciELO

Links relacionados

  • No hay articulos similaresSimilares en SciELO

Compartir


Medicina (Buenos Aires)

versión impresa ISSN 0025-7680

Medicina (B. Aires) vol.73 no.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires feb. 2013

 

CASUÍSTICA

Detección de un caso de síndrome de Williams-Beuren por MLPA

 

Sergio Laurito1, Teresita Branham1, Gustavo Herrero2, Silvana Marsa3, Fernanda Garro2, María Roqué1

1Laboratorio de Alteraciones Genéticas y Epigenéticas en Patologías Humanas IHEM-CCT-CONICET-Mendoza, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Cuyo, Mendoza;
2Pediátrica San Luis Centro Médico Privado, San Luis;
3GENES, San Luis

Dirección postal: Dra. María Roqué, Laboratorio de Alteraciones Genéticas y Epigenéticas en Patologías Humanas, IHEM-CCT-CONICET, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Cuyo, Parque General San Martín, 5500 Mendoza, Argentina
Telefono (54-261) 4494117 e-mail: mroque@mendoza-conicet.gob.ar

 


Resumen
El síndrome de Williams-Beuren (WBS) es un trastorno del desarrollo neurológico que incluye diferentes manifestaciones clínicas como estenosis aórtica supravalvular, lesiones cerebrovasculares, retraso en el crecimiento, rasgos faciales "élficos" y retraso mental. Es causado por una microdeleción heterocigótica de genes contiguos en la banda cromosómica 7q11.23, generando un cambio en el número de copias (CNV) de esta región crítica. Los pacientes presentan una amplia manifestación clínica y variada expresión fenotípica. La confirmación de la sospecha clínica es esencial para el seguimiento clínico del paciente y el asesoramiento genético de la familia. La técnica estándar para la detección de WBS es la hibridización fluorescente in situ. En los últimos años la metodología MLPA (Multiplex Ligation dependent Probe Amplification) ha sido incorporada a los laboratorios diagnósticos para la detección de CNV relacionados con distintas enfermedades, incluyendo WBS. El objetivo de este trabajo fue confirmar el diagnóstico clínico de WBS en un niño, utilizando la técnica de MLPA. Los ensayos por MLPA permitieron detectar la deleción de los genes CYLN2, FZD9, STX1A, ELN, LIMK1y RFC2. En regiones geográficas donde la determinación por FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) no está disponible para esta enfermedad, la metodología MLPA ha permitido confirmar el diagnóstico clínico y detectar los genes involucrados en la alteración. Hasta nuestro conocimiento no hay otros casos publicados sobre síndrome de WB detectado por la técnica MLPA en la Argentina.

Palabras clave: Síndrome de Williams Beuren; MLPA

Abstract
Detection of a Williams Beuren syndrome case by MLPA. Williams-Beuren syndrome (WBS) is a rare developmental disorder characterized by distinctive facial, neurobehavioral, and cardiovascular features. WBS is caused by a heterozygous contiguous gene microdeletion of the WBS crítical region on chromosome 7q11.23. Confirmation of clinical suspicion is essential for clinical monitoring of the patient and genetic counseling of the family. Fluorescence in situ hybridization (FISH) is considered the gold standard technique for detecting WBS. Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) has been introduced into DNA diagnostic laboratories for the detection of copy number variations in several diseases including WBS. The objective of this study was to confirm, by MLPA, the clinical diagnosis of WBS in a pediatric patient. This technique allowed to detect the deletion of CYLN2, FZD9, STX1A, ELN, LIMK1 and RFC2 genes. In geographic regions were the detection by F ISH is not available for this disease, the MLPA methodology allowed to confirm the clinic diagnostic of WBS. To our knowledge this is the first report demonstrating the confirmation of WBS by MLPA in Argentina.

Key words: Williams Beuren syndrome; MLPA


 

El síndrome de Williams-Beuren (WBS; OMIM 194050) es un trastorno del desarrollo neurológico que incluye diferentes manifestaciones clínicas como estenosis aórtica supravalvular, lesiones cerebrovasculares, retraso en el crecimiento, rasgos faciales "élficos" y retraso mental. Además, en esta enfermedad se han comunicado trastornos en el metabolismo de la vitamina D e hipercalcemia1. Los pacientes con WBS presentan frecuentemente hiperacusia, personalidad amigable y la aparición precoz de arrugas en la piel. La frecuencia varía según los informes entre 1:7 000 y 1:20 000 nacimientos vivos1, sin presentar diferencias entre razas ni sexos.
El síndrome WB es causado en el 90-95% de los pacientes, por una microdeleción heterocigótica de genes contiguos en la banda cromosómica 7q11.23, llamada región crítica de WBS. Esta región abarca de 1.5 a 1.8 Mb y contiene al menos 25 genes (Tabla 1). Flanqueando la región crítica se encuentran 2 regiones
repetitivas (LCRs) con homología cercana al 97%. Son estas regiones LCR las que pueden provocar una recombinación no-homóloga durante la meiosis, generando como consecuencia un cambio en el número de copias (CNV) (deleción o duplicación) de la región crítica en los pacientes WBS. La deleción de esta región es la alteración más frecuentemente relacionada con WBS.

TABLA 1.- Genes de la región crítica de WBS, 7q11.23

*Indica los genes detectados por las sondas de MLPA (kit P064);
**indica que dos sondas reconocen el mismo gen

Si bien el síndrome cuenta con rasgos específicos, los pacientes presentan una amplia manifestación clínica y expresión fenotípica variada. La confirmación de la sospecha clínica es esencial para el seguimiento clínico del paciente y el asesoramiento genético de la familia. Un diagnóstico certero y precoz es fundamental para evitar pasos innecesarios y planificar las medidas óptimas de tratamiento.
Desde que se conoció la causa genética de WBS en 1993, el diagnóstico es confirmado por la técnica de FISH2 (Fluorescence In Situ Hybridization) mediante una sonda que detecta la deleción del gen de la elastina (ELN) y/o por análisis de marcadores microsatelitales ubicados dentro de la región crítica de WBS. En los últimos años la metodología MLPA (Multiplex Ligation dependent Probe Amplification) ha sido incorporada a los laboratorios de diagnóstico para la detección de CNVs relacionados con distintas enfermedades, incluyendo WBS.
El objetivo de este trabajo fue confirmar el diagnóstico clínico de síndrome de WB en un niño, utilizando la técnica de MLPA. Esta metodología permite la detección de variaciones en el número de copias de hasta 50 regiones genómicas diferentes de manera simultánea. La detección tanto de deleción como duplicación de estas regiones es detectada por una PCR fluorescente semicuantitativa a partir de sondas específicas que son previamente hibridadas en cada región a estudiar. La cantidad de producto de PCR fluorescente es indicativa del número de copias de los genes estudiados (www.mrc-holland.com). La metodología es sensible, rápida, requiere de poca cantidad de ADN y sus sondas están diseñadas en sentido 5'→3' evitando de esta manera cualquier posible interferencia del RNAm. A su vez, respecto de FISH, es menos laboriosa y tiene un costo sustancialmente menor, siendo postulada por algunos como la metodología diagnóstica ideal para países en desarrollo1. Los ensayos por MLPA permitieron confirmar el diagnóstico clínico e identificar los genes afectados en el caso clínico comunicado.

Caso clínico

Se presenta el caso de un niño de 2 años de edad, varón, con sospecha clínica de síndrome de WB. Los antecedentes obstétricos revelaron episodios reiterados de infecciones urinarias, toxoplasmosis materna previa al embarazo y un nacimiento por parto normal. El peso al nacer fue 2200 g (p3) y el apgar en 6/7. Post-parto, el paciente estuvo internado en neonatología por 25 días debido a un cuadro de sepsis. Por presentar un soplo cardíaco se realizó ecocardiografía doppler color y se diagnosticó estenosis aórtica supravalvular con un gradiente de 40, e insuficiencia leve de la válvula tricúspide.
A la fecha presenta retraso psicomotriz, lenguaje bisilábico y movimientos permanentes de descarga. El examen físico revela un peso 10.63 kg (p10), talla 85.5 cm (p25) y perímetro cefálico 47 cm (p15). Los rasgos faciales se definen por boca entreabierta permanente, labios prominentes que dan aspecto de macroglosia, mejillas sobresalientes, orejas grandes no en punta, línea media del labio superior larga, cabello normal, puente nasal deprimido y tejido celular subcutáneo aumentado en la región peri-orbitaria.
Se detecta soplo sistólico 4/6 en todo el tórax, pulsos débiles, presión arterial 120/60 mmHg, con leve cianosis con el llanto, saturación 93-94%.
Se realizó estudio genético para CNV de la región 7q11 por MLPA mediante 7 sondas específicas para la región crítica de WBS, incluyendo controles para otros cromosomas. El diseño de las sondas incluidas en el kit comercial P064 permite abarcar la región crítica de WBS completa, basándose en lo informado en la literatura1. El procedimiento se basó en las indicaciones de MRC-Holland, incorporando algunas modificaciones introducidas por nuestro grupo3; 4. Las 7 sondas revelaron una deleción heterocigota de los genes CYLN2, FZD9, STX1A, ELN, LIMK1y RFC2 en sangre periférica del paciente.

Discusión

El estudio por MLPA permitió confirmar el diagnóstico clínico del síndrome de WB.
Para evaluar la presencia de CNV se realizó un análisis de regresión entre los resultados de una muestra control y la muestra de ADN del paciente. Las siete sondas revelaron en el paciente una deleción significativa de una de las copias alélicas abarcando una región de 0.96 Mb (Fig. 1). Las 7 sondas hibridan en los genes contiguos CYLN2, FZD9, STX1A, ELN, LIMK1, RFC2, delecionados en 90-95% de los pacientes con SWB5.


Fig. 1.- A. Representación del cromosoma 7 y localización de los genes detectados por las sondas del kit de MLPA P064. B. Electroferograma obtenido usando el software GenMarker® v1.75. Cada pico corresponde a una región estudiada, los picos grises representan la muestra control y los picos negros la muestra del paciente. Las flechas indican CNV en 7 de las regiones estudiadas. C. Análisis de Ratios para el número de copias del paciente respecto del control (error estándar 0.04). Cada punto representa una región estudiada, los puntos entre ambas líneas horizontales se encuentran dentro del desvío aceptado. Los puntos por debajo de la línea horizontal inferior se encuentran alrededor de un ratio de 0.5, infiriéndose una deleción heterocigota de estas regiones.

Es sabido que la haploinsuficiencia del gen ELN tiene un claro efecto sobre las anomalías cardíacas. Este gen codifica para una proteína llamada elastina y su disfunción está asociada con estenosis supravascular aórtica y con anormalidades del tejido conectivo. Todos los pacientes con síndrome WB presentan alterado el gen ELN y su rol en el desarrollo de la enfermedad ha sido ya comunicado por otros autores6, 7.
Sin embargo, aun no es clara la contribución del resto de los genes localizados en la región crítica. En el caso presentado, además del gen ELN se detectan 5 genes delecionados. El gen CYLN2 codifica para una proteína expresada principalmente en cerebro y se ha propuesto su participación en la interacción entre organelas específicas y los microtúbulos, relacionándola con la estructura y función normal de las células nerviosas. La deleción de este gen podría contribuir a la insuficiencia neurológica y cognitiva de los pacientes con síndrome WB6. El gen FZD9 codifica para un receptor de la vía de señalización Wnt1, inhibiendo β-catenina; se expresa principalmente en cerebro, testículo, ojo, músculo esquelético y riñón7. Se postula que el gen FDZ9 tiene un rol en el desarrollo del hipocampo, siendo el responsable de los rasgos comportamentales de WBS. El gen STX1A codifica para un miembro de la superfamilia de las sintaxinas. Las sintaxinas son proteínas específicas del cerebro que participan en el anclaje de las vesículas a la membrana
presináptica. Tienen un rol importante en la exocitosis de neurotransmisores. Se sugiere que los desórdenes neurológicos del síndrome de WB se deben a la deleción de este gen8. El gen RFC2 codifica para la subunidad 2 del factor de replicación, participando en la elongación de la hebra de ADN durante la replicación. Según Francke y col., la deleción del gen RFC2 podría afectar la eficiencia de la replicación del ADN y en consecuencia contribuir a defectos durante el desarrollo y crecimiento7. El gen LIMK1 codifica para una quinasa serina/treonina, que regula la polimerización de actina vía fosforilación e inactivación del factor de unión cofilina. Esta proteína se expresa de manera ubicua durante el desarrollo y participa en diversos procesos celulares asociados con la estructura del citoesqueleto. Esta proteína también estimula el crecimiento axonal y podría tener un rol durante el desarrollo del cerebro. La deleción de LIMK1 se postula implicada en el impedimento de las habilidades visuo-espaciales en pacientes con WB9.
El caso presentado muestra la sensibilidad y efectividad del diagnóstico de WBS basado en MLPA. En regiones de Argentina como Cuyo, donde la determinación por FISH no está disponible para esta enfermedad, la metodología MLPA ha permitido confirmar el diagnóstico clínico y detectar los genes involucrados en la alteración.
Hasta nuestro conocimiento, esta es la primera confirmación de diagnóstico del síndrome de WB por la técnica de MLPA en la Argentina.

Conflictos de interés: Los autores declaran no tener conflictos de interés.

Bibliografía

1. Dutra RL, Honjo RS, Kulikowski LD, et al. Copy number variation in Williams-Beuren syndrome: suitable diagnostic strategy for developing countries. BMC Res Notes 2012; 5: 13.         [ Links ]

2. Osborne LR, Joseph-George AM, Scherer SW. Williams- Beuren syndrome diagnosis using fluorescence in situ hybridization. Methods Mol Med 2006; 126: 113-28.         [ Links ]

3. Gomez LC, Marzese DM, Adi J, et al. MLPA mutation detection in Argentine HNPCC and FAP families. Fam Cancer 2009; 8: 67-73.         [ Links ]

4. Marzese DM, Mampel A, Gomez LC, et al. Detection of deletions and duplications in the Duchenne muscular dystrophy gene by the molecular method MLPA in the first Argentine affected families. Genet Mol Res 2008; 7: 223-33.         [ Links ]

5. Dutra RL, Pieri PC, Teixeira AC, Honjo RS, Bertola DR, Kim CA. Detection of deletions at 7q11.23 in Williams- Beuren syndrome by polymorphic markers. Clinics (Sao Paulo) 2011; 66: 959-64.         [ Links ]

6. van Hagen JM, van Der Geest JN, van der Giessen RS, et al . Contribution of CYLN2 and GTF2IRD1 to neurological and cognitive symptoms in Williams Syndrome. Neurobiol Dis 2007 April; 26: 112-24.         [ Links ]

7. Francke U. Williams-Beuren syndrome: genes and mechanisms. Hum Mol Genet 1999; 8: 1947-54.         [ Links ]

8. Nakayama T, Matsuoka R, Kimura M, et al. Hemizygous deletion of the HPC-1/syntaxin 1A gene (STX1A) in patients with Williams syndrome. Cytogenet Cell Genet 1998; 82: 49-51.         [ Links ]

9. Frangiskakis JM, Ewart AK, Morris CA, et al. LIM-kinase1 hemizygosity implicated in impaired visuospatial constructive cognition. Cell 1996 July 12; 86: 59-69.         [ Links ]

Recibido: 16-IV-2012
Aceptado: 24-VIII-2012

Creative Commons License Todo el contenido de esta revista, excepto dónde está identificado, está bajo una Licencia Creative Commons