EDITORIAL

La nicking enzyme de Staphylococcus aureus, un blanco de acción muy promisorio

Hay reglas sencillas para el uso de la penicilina:
usarla solo para los microbios que sean vulnerables a ella,
aplicar la dosis indicada y que el tratamiento dure lo suficiente para
eliminar la infección; siguiendo estas reglas, todos quedarán satisfechos;
de lo contrario, el resultado será decepcionante.
Sir Alexander Fleming (1881-1955)
Premio Nobel de Fisiología o Medicina 1945

La aparición de la multirresistencia a los antimicrobianos en los diferentes microorganismos ha sido motivo de desvelos en los últimos 60 años y es un problema de salud pública mundial. Así, luego del genial descubrimiento de la penicilina por Alexander Fleming en 1928¹, en 1947, a los cuatro años de su producción y administración masiva, alrededor del 40% de las cepas de Staphylococcus aureus eran resistentes a la penicilina por su habilidad de producir penicilinasa. La respuesta efectiva, al menos por un tiempo, se logró tras la aparición en 1960 de una penicilina semisintética resistente a la penicilinasa, la meticilina². Desafortunadamente, ya en 1961 se describió la primera cepa de S. aureus resistente a la meticilina (SARM) y en 1963 se produjo el primer brote informado en el Queen Mary´s Hospital for Children en Carshalton, Inglaterra, que comprometió a 37 pacientes. De manera muy rápida, las cepas SARM emergieron en casi todos los países del mundo³. La resistencia a la meticilina a expensas fundamentalmente de la presencia del gen mecA, que codifica la síntesis de una proteína ligadora de la penicilina adicional (PLP2a) de muy baja afinidad por los antibióticos ß-lactámicos, implica resistencia a todos ellos y a las combinaciones de estos con los inhibidores de ß-lactamasas³.
Son varios los mecanismos que en los distintos microorganismos determinan resistencia a los antimicrobianos, entre ellos la presencia de bombas de eflujo que expulsan a los antibióticos, la impermeabilidad de membrana por ausencia o alteración de las porinas, la hiperproducción cromosomal o plasmídica de enzimas inactivantes, la presencia de proteínas ligadoras de la penicilina con escasa o nula afinidad por el antibiótico, alteraciones por mutaciones en el sitio blanco (deleciones, inserciones), entre otros. Una de las formas más eficientes de transferencia de la resistencia intra e interespecie es a través de los plásmidos conjugativos portadores de casetes en transposones, que codifican los múltiples factores de resistencia.
En los primeros años de la década de los ochenta, se detectó en EE.UU. un drástico incremento en la resistencia a los aminoglucósidos en diversas cepas de S. aureus⁴. Estudios moleculares posteriores en estas cepas determinaron la presencia de genes que codificaban las enzimas inactivantes de los aminoglucósidos; estos genes estaban ubicados en grandes plásmidos conjugativos (40-60 kb). pGO1 es el prototipo de los plásmidos clase III en S. aureus; codifica también resistencia a trimetoprima, bleomicina y a las sales de amonio cuaternario⁵.
En las últimas décadas, las infecciones graves causadas por SARM -cepas que suelen ser, además, multirresistentes- son tratadas con vancomicina (VAN), glucopéptido descubierto en 1952, que en 1958 fue registrado por la US Food and Drug Administration para el tratamiento de los aislamientos SARM. Contrariamente a lo acontecido con las penicilinas y las penicilinas semisintéticas, recién en 1988 la VAN supo seleccionar el primer aislamiento de Enterococcus faecium con altos niveles de resistencia [concentración inhibitoria mínima (CIM)_VAN > 1024 µg/ml]. Esto se debió a la presencia del cluster vanA que contiene al transposón Tn1546, responsable de la resistencia a la VAN por codificar las proteínas que modifican el sitio blanco del antibiótico en la pared celular bacteriana, en el cual se cambian los residuos de D-Ala-D-Ala por D-Ala-D-lactato, con mucha menor afinidad por el antibiótico⁶. A partir de ese momento, la potencial transferencia de la resistencia a VAN desde los enterococos a S. aureus permaneció latente, hasta que en 1996 Hiramatsu et al. aislaron en Japón la primera cepa de SARM con sensibilidad disminuida a la vancomicina [vancomycin-intermediate S. aureus (VISA)], con CIM = 8 µg/ml⁷, siendo el punto de corte de sensibilidad ≤ 2 µg/ml. Sin embargo, esta cepa denominada Mu50 no poseía ninguno de los genes van y se observó, por microscopía electrónica, un engrosamiento de la pared celular que dificultaba la llegada de la VAN hasta su sitio blanco. Finalmente, en junio de 2002 se aisló de un paciente en diálisis en Michigan, EE.UU., una cepa SARM con altos niveles de resistencia a VAN y a teicoplanina (TEI) (CIM_VAN = 1024 µg/ml y CIM_TEI = 128 µg/ml). Esa cepa, denominada USA100, era además resistente a los aminoglucósidos, a los ß-lactámicos, a las fluoroquinolonas, a los macrólidos, a la rifampicina y a la tetraciclina; y sensible al linezolid y a la trimetoprima-sulfametoxazol. En este caso la resistencia a la VAN era mediada por el operón vanA y residía en el transposón Tn1546, el mismo ya descripto en E. faecium resistente a la VAN y ahora presente en el plásmido pLW1043 en S. aureus⁸.
Este plásmido y otros relacionados, como el pGO1 y el pSK41, codifican una relaxasa denominada nicking enzyme en S. aureus (NES), que inicia y culmina el proceso de transferencia del ADN.
En 2013, Edwards et al.⁹ muestran la estructura cristalina y proveen información a nivel molecular de la NES y del complejo NES-ADN, determinan el sitio blanco de la enzima, logran su inhibición (y, por lo tanto, de sus funciones como relaxasa in vitro) a través de una poliamida a 50 µM, y determinan las regiones esenciales de la NES para la transferencia exitosa del plásmido de resistencia en S. aureus.
La figura de la tapa de este número, de Redinbo et al., es una composición donde se observa la estructura cristalina del extremo N-terminal de la enzima NES (color rojo) en complejo con el ADN (color amarillo) sobre un fondo de estafilococos y un átomo de níquel (esfera azul), esencial para la actividad de la enzima y, por lo tanto, para la transferencia del ADN plasmídico con los genes de resistencia a la VAN.
La NES posee 665 aminoácidos, su extremo N-terminal (~ 220 aa) es común a otras relaxasas, en cambio, su región C-terminal (residuos 221-665) es única del plásmido pLW1043 y de otros plásmidos de S. aureus, no comparte identidad con ninguna otra proteína bacteriana y hasta el momento se desconocía su función. Edwards et al. mostraron la estructura cristalina del dominio de la NES relaxasa determinada con una resolución de 2.9 Å; definieron que contiene el átomo de Ni rodeado de tres histidinas y una tirosina, y el oligonucleótido unido contiene, a su vez, una horquilla de 7 pb seguida de una cadena simple que se extiende hacia el sitio activo de la enzima. La estructura cristalina del dominio C-terminal de la NES plasmídica, determinada con una resolución de 3,0 Å, mostró una estructura a helicoidal única. En conjunto, estos hallazgos aportaron información a nivel atómico sobre la NES, que permite la transferencia de la resistencia en S. aureus.
Mediante anisotropía de fluorescencia, Edwards et al. mostraron que la NES tiene sitios específicos de contacto en las curvaturas mayor y menor de la doble hélice del ADN en las horquillas (loops 1 y 2), como así también interacciones base-específicas como para alinear al ADN sustrato para la catálisis. Los autores trabajaron con mutantes en el dominio de la NES relaxasa y determinaron que la integridad de este y la presencia del metal son necesarios para la unión con el ADN. Por otra parte, la eliminación del sitio de unión en el loop 1 o en el 2 y en la Gua-26 altera espectacularmente la actividad de la NES, en cambio, la presencia del dominio C-terminal impacta de manera significativa en la actividad de la relaxasa N-terminal regulando el delicado equilibrio clivaje-religamiento de la enzima intacta. En definitiva, ambas regiones trabajan en conjunto y coordinadamente.
En S. aureus y con el plásmido pSK41 -muy similar al pLW1043, pero sin los genes de resistencia a la vancomicina- demostraron mediante la determinación del número de transconjugantes que la alteración de los genes nes truncaba la transferencia del plásmido, con lo cual confirmaron el rol esencial de la NES en la transmisión del plásmido pSK41 y de todos los plásmidos relacionados. Asimismo, deleciones en los loops 1, 2 o en ambos también reducían la transferencia del ADN entre células de S. aureus. Por último, los autores investigaron las posibilidades de inhibición de la NES mediante una sustancia sintética, la poliamida 1, que se unió selectivamente a la secuencia 5'-GCGAA-3' del loop1. El clivaje del ADN por parte de la región NES relaxasa (1-220) fue totalmente inhibido por la poliamida 1 a una concentración de 50 µM. Con la NES intacta (1-665) se requirió no más de 25 µM. Los autores proponen que este modelo puede ser muy interesante para el desarrollo de pequeñas moléculas que puedan inhibir las interacciones NES-ADN, alterar la actividad de la NES y evitar la transferencia de los plásmidos de resistencia.
De todos modos, no se debe olvidar que el uso masivo y a veces abusivo de los agentes antimicrobianos ha determinado siempre, y a veces muy rápidamente, la aparición de cepas resistentes. Esto ha puesto en evidencia la notable e infinita capacidad de los microorganismos de generar los más envidiables mecanismos de supervivencia a través de la selección y expresión de los múltiples genes de resistencia, algunos de ellos referidos en este editorial.

Silvia C. Predari

Departamento de Microbiología, Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari, Universidad de Buenos Aires
e-mail: predari.silvia@lanari.fmed.uba.ar

1. Fleming A. On the antibacterial action of cultures of a penicillium, with special reference to their use in the isolation of B. influenzae. Br J Exp Pathol 1929; X: 226-36.         [ Links ]

2. Rolinson GN, Batchelor FR, Stevens S, Cameron Wood J, Chain EB. Bacteriological studies on a new penicillin-BRL. 1241. Lancet 1960; 2: 564-7.         [ Links ]

3. Gardella N, Picasso R, Predari SC, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains in Buenos Aires teaching hospitals: replacement of the multidrug resistant South American clone by another susceptible to rifampin, minocycline and trimethoprim-sulfamethoxazole. Rev Argent Microbiol 2005; 37: 156-60.         [ Links ]

4. Archer GL, Johnston JL. Self-transmissible plasmids in staphylococci that encode resistance to aminoglycosides. Antimicrob Agents Chemother 1983; 24: 70-7.         [ Links ]

5. Caryl JA, O'Neill AJ. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from staphylococci. Plasmid 2009; 62: 35-8.         [ Links ]

6. Leclerq R, Derlot E, Duval J, Courvalin P. Plasmid-mediated resistance to vancomycin and teicoplanin in Enterococcus faecium. N Engl J Med 1988; 319: 157.         [ Links ]

7. Hiramatsu K, Hanaki H, Ino T, Yabuta K, Oguri T, Tenover FC. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility. J Antimicrob Chemother 1997; 40: 135-6.         [ Links ]

8. Weigel LM, Clewell DB, Gill SR, et al. Genetic analysis of a high-level vancomycin-resistant isolate of Staphylococcus aureus. Science 2003; 302: 1569-71.         [ Links ]

9. Edwards JS, Betts L, Frazier ML et al. Molecular basis of antibiotic multiresistance transfer in Staphylococcus aureus. Proc Natl Acad Sci USA 2013: 110: 2804-9.         [ Links ]