ARTÍCULO ORIGINAL

Mutación V600E del oncogén BRAF en nódulos tiroideos en Argentina

 

Verónica Ilera¹, Ricardo Dourisboure², Antonio Colobraro³, María Del Carmen Silva Croome¹, Gustavo Olstein⁴, Alicia Gauna¹

¹División Endocrinología,
²Sección Biología Molecular, División Laboratorio Central,
³División Anatomía Patológica,
⁴División Cirugía. Hospital General de Agudos José María Ramos Mejía, Buenos Aires, Argentina

Dirección postal: Dra Verónica Ilera, Hospital J. M. Ramos Mejía, Urquiza 609, 1221 Buenos Aires, Argentina
e-mail: veronicailera@gmail.com

Recibido: 14-IV-2015
Aceptado: 10-V-2016

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Resumen

Este estudio prospectivo analizó en una población argentina la frecuencia de la mutación V600E del oncogén BRAF en pacientes operados por nódulos tiroideos benignos y por carcinoma papilar de tiroides. En estos últimos se compararon las características clínicas y anatomopatológicas en relación a la presencia o ausencia de la mutación. Se estudiaron prospectivamente 25 pacientes consecutivos operados en nuestra institución. Se obtuvieron muestras histológicas de tejido nodular y el adyacente no nodular en fresco. Se extrajo ADN, se amplificó según técnica amplification refractory mutation system polymerase chain reaction (ARMS PCR). Se efectuó secuenciación directa del gen en 4 muestras. El 77% de los operados por carcinoma papilar resultaron BRAF+. Todas las muestras de tejido adyacente no tumoral y de los nódulos benignos fueron negativas para la mutación. La secuenciación directa confirmó los resultados obtenidos por ARMS PCR en las muestras en que fue efectuada. Los pacientes BRAF+ presentaron mayor edad al diagnóstico vs. aquellos BRAF- (47.7 ± 12.7 vs 24.7 ± 8.1 años, p < 0.01). Nueve de diez carcinomas papilares de tiroides con mutación de BRAF correspondieron a la variante histológica clásica, la cual no se observó en los tumores BRAF- (p < 0.02). En conclusión, comunicamos una elevada frecuencia de mutación V600E del oncogén BRAF en pacientes operados por carcinoma papilar de tiroides en Argentina. Estos resultados son acordes a lo referido en la bibliografía.

Palabras clave: Nódulos tiroideos; Carcinoma papilar de tiroides; BRAF; Análisis molecular.

Abstract

BRAF V600E mutation in thyroid nodules in Argentina.

This prospective study analyzed the frequency of V600E mutation of oncogene BRAF in patients operated for benign thyroid nodules and for papillary thyroid cancer in an Argentine population. In patients with papillary thyroid cancer we compared clinicopathological characteristics between those harboring BRAF mutation and those without it. Twenty five consecutive patients operated for benign nodules and for papillary carcinoma were prospectively included. Fresh tissue samples of thyroid nodules and of adjacent thyroid parenchyma were obtained. DNA was extracted and amplified by amplification refractory mutation system polymerase chain reaction (ARMS PCR). Direct sequencing was performed in four samples. Of those patients operated for papillary thyroid cancer, 77% harbored BRAF mutation. All samples from adjacent thyroid parenchyma and from patients operated for benign nodules tested negative for the mutation. Direct sequencing confirmed the results obtained by ARMS PCR. Patients with BRAF mutation were significantly older at the time of diagnosis (BRAF+ 47.7 ± 12.7 years vs. BRAF- 24.7 ± 8.1 years, p < 0.01). Nine out of ten papillary carcinomas with BRAF mutation corresponded to the classic histological subtype, which was not observed in BRAF negative tumors (p < 0.02). In conclusion, we found a high frequency of BRAF V600E mutation in this population of patients operated for papillary thyroid carcinoma in Argentina. These results are consistent with those reported in the literature.

Key words: Thyroid nodules; Papillary thyroid cancer; BRAF; Molecular testing.

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El carcinoma diferenciado de tiroides es el tumor maligno endocrino más común, y su incidencia se incrementa en distintas partes del mundo. El carcinoma papilar es la forma más frecuente de tumor maligno tiroideo, representando más del 85% de los casos. Este aumento en la incidencia se atribuye, por lo menos en parte, a un mayor diagnóstico de esta entidad por mejores métodos y uso rutinario de ecografías de vasos de cuello^1-3. En general, el carcinoma papilar de tiroides (CPT) presenta un pronóstico excelente, con una supervivencia a 10 años mayor al 90%. Sin embargo, un 20-30% de los pacientes pueden presentar recurrencia de la enfermedad hasta 30 años después del diagnóstico⁴. Un porcentaje menor desarrolla metástasis a distancia y fallece finalmente a consecuencia de ésta⁵.
En las últimas décadas hubo un gran avance en los conocimientos de las bases genéticas y moleculares involucradas en el desarrollo de los cánceres de tiroides, que podrán contribuir a una identificación temprana y mejor manejo de aquellos pacientes con mayor riesgo de persistencia o recurrencia de la enfermedad.
El desarrollo del carcinoma papilar implica la activación de la vía de la proteína kinasa mitógeno activada (MAPK por sus siglas en inglés), la cual modula la expresión de genes blanco involucrados en la proliferación celular, supervivencia y apoptosis. La activación constitutiva de esta vía lleva a tumorigénesis^{6, 7}. El oncogén BRAF es un fuerte activador de esta señal, y ha sido implicado en el desarrollo de numerosos carcinomas incluyendo melanoma, cáncer de colon, sarcomas⁸ y también en cáncer de tiroides. BRAF está localizado en el cromosoma 7q24 y codifica para una proteína serina-treonina kinasa. Luego de la activación por RAS, la fosforilación de BRAF gatilla una serie de activaciones a lo largo de la cascada de la MAPK⁹. Una mutación puntual de BRAF en el codón 600 del exón 15 resulta en una sustitución de valina por glutamato (V600E), que lleva a una activación constitutiva de la vía de la MAPK. La mutación BRAF V600E es la alteración genética más común en el carcinoma papilar de tiroides, y ha sido informada en 29 a 83% de estos tumores^10-15.
En los estudios publicados hasta la fecha, la mutación BRAF (V600E) ha sido detectada solo en carcinoma papilar, carcinoma pobremente diferenciado y algunos carcinomas anaplásicos^{10, 16}. No se ha encontrado en carcinomas foliculares o neoplasias benignas de tiroides. Entre los subtipos histológicos del CPT, la mutación se ha descripto en la variante convencional y en la variante de células altas, encontrándose con mucha menor frecuencia en la variante folicular. La alta frecuencia y especificidad de la mutación BRAF sugiere que jugaría un papel fundamental en la iniciación de la tumorigénesis del carcinoma papilar¹⁷.
Los carcinomas papilares con mutación de BRAF presentan características fenotípicas y biológicas diferentes. Parecen tener un comportamiento más agresivo y acarrear un peor pronóstico^{6, 7, 12}. El carcinoma tiroideo de células altas, una variante agresiva de carcinoma papilar, frecuentemente exhibe mutación de BRAF^{10, 16}. La presencia de mutación de BRAF en carcinoma papilar se asocia con edad más avanzada de los pacientes, extensión extratiroidea del tumor, multicentricidad y metástasis en ganglios linfáticos^{18, 19}. Algunos autores encontraron también una mayor incidencia de recurrencia locorregional y una disminución de la respuesta del tumor recurrente al tratamiento con iodo radiactivo^{18, 20, 21}. Se ha demostrado también una asociación entre mutación de BRAF V600E y una menor supervivencia²².
La frecuencia de mutación BRAF en carcinoma papilar de tiroides varía según la región geográfica analizada. No se han comunicado hasta el momento estudios de la misma en la Argentina. En este estudio analizamos en forma prospectiva en la Argentina, la frecuencia de la mutación del oncogén BRAF en tejido tumoral y no tumoral de pacientes operados por CPT y nódulos tiroideos benignos. En los pacientes con CPT, se evaluaron las características clínicas y anatomopatológicas en relación a la presencia o ausencia de la mutación.

Materiales y métodos

Se estudiaron en forma prospectiva 25 pacientes consecutivos tratados con cirugía de tiroides por nódulos benignos o malignos en el Hospital Ramos Mejía entre noviembre de 2011 y noviembre de 2012. Todos eran mayores de 18 años. A partir de la pieza quirúrgica, se obtuvo un fragmento fresco de tejido tumoral de hasta 0.5 × 0.5 × 0.5 cm, que se colocó en un tubo con solución fisiológica. Se procedió de la misma manera con una muestra de tejido circundante sano. Los tubos se mantuvieron en heladera durante 24 h o en freezer a -20 °C hasta el procesamiento.
Cada muestra de tejido, sano y tumoral, se disgregó a temperatura ambiente con bisturí y luego se digirió con proteinasa K y dodecilsulfato de sodio (SDS) a 56°C para liberar en solución los ácidos nucleicos. Se extrajo el ADN con fenol alcalino/cloroformo y se precipitó con acetato de sodio 0.3 M/etanol absoluto. Se eliminaron las sales con etanol 75%, se dejó secar a temperatura ambiente y se re-suspendió en buffer TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM).
El ADN obtenido se corrió en un gel de agarosa 1% para observar integridad. Las muestras se amplificaron por PCR para detectar la mutación. Se desarrolló una técnica de ARMS PCR para detectar el alelo normal GTG (valina) y el alelo mutado con el cambio por GAG (glutamato) en el codón 600 del exón 15. Esta técnica permite visualizar tanto la secuencia normal como la secuencia mutada con un alto grado de sensibilidad (se considera aproximadamente 0.1%)23-25. El producto amplificado se corrió en un gel de agarosa 2% teñido con bromuro de etidio para analizar el patrón de bandas y se fotografió posteriormente. Al momento de realizar los estudios genéticos el operador desconocía el resultado anatomopatológico de las muestras.
En cuatro muestras se realizó además secuenciación directa del exón 15 del gen, a fin de comparar estos resultados con los obtenidos por ARMS PCR.
En cuanto al análisis estadístico, los datos se expresaron como porcentaje, media, desvío estándar, mediana y rango. En los pacientes con carcinoma papilar de tiroides, se aplicó el test exacto de Fischer para la comparación de las características clínicas y anatomopatológicas en relación a la presencia o ausencia de la mutación de BRAF. Para la comparación de las variables cuantitativas se utilizó el test T para datos no apareados con corrección de Welch. Se consideró significativa una p < 0.05.
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital y se obtuvo consentimiento informado de los pacientes.

Resultados

Se analizó un total de 46 muestras obtenidas de 25 pacientes. Las características de la población en estudio, así como el diagnóstico anatomopatológico final se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Características clínicas de la población y diagnóstico anatomo-patológico

Se incluyeron un total de 25 pacientes operados, 21 mujeres y 4 hombres. La edad promedio fue de 48.9 años, con una mediana de 53 y un rango de 19 a 74 años. Doce pacientes, todas mujeres, fueron operadas por nódulos benignos. En todos los casos el resultado anatomopatológico fue de hiperplasia nodular coloide. A todas se les practicó tiroidectomía total, excepto a un caso en que se realizó hemitiroidectomía. En los restantes 13 (9 mujeres y 4 hombres) el diagnóstico fue de carcinoma papilar de tiroides. A todos se les realizó tiroidectomía total. Según la estadificación propuesta por la American Joint Committee on Cancer²⁶, 8 pacientes correspondieron a un estadio I, 4 a estadio II y 1 a estadio III.
Se realizó detección de mutación V600E del oncogén BRAF en 46 muestras, 24 de las cuales provinieron de pacientes operados por carcinoma papilar de tiroides (13 muestras se obtuvieron del tejido tumoral y 11 muestras del tejido adyacente no tumoral). Veintidós muestras correspondieron a las pacientes operadas por nódulos benignos (12 obtenidas del tejido nodular y 10 del parénquima adyacente no nodular). La mutación estuvo presente en 10 de las 13 muestras de carcinoma papilar, mientras que sólo 3 no presentaron dicha mutación. La mutación estuvo ausente en todas las muestras de tejido adyacente no tumoral respectivo y en todas las muestras obtenidas de nódulos benignos.
Se realizó secuenciación directa del gen en 4 casos: 3 operadas por carcinoma papilar (dos positivas y una negativa para BRAF por ARMS) y una por hiperplasia nodular coloide. En todos ellos, el resultado de la secuenciación confirmó el obtenido por ARMS PCR; es decir, se detectó la mutación en 2 con carcinoma papilar que habían sido detectados por ARMS PCR, mientras que la mutación estuvo ausente en la paciente operada por nódulos benignos y en otra con carcinoma papilar, en que la técnica de ARMS PCR arrojó un resultado negativo para la mutación del BRAF. Los resultados de la secuenciación directa y de la corrida electroforética del producto amplificado por ARMS PCR de los pacientes mencionados anteriormente se observan en las Figs. 1 y 2.

Fig. 1. Electroforesis en gel de agarosa del producto amplificado por ARMS PCR. Calle 1: marcador de peso molecular (banda intensa de 500 pb); calle 2: paciente A; calle 3: paciente B; calle 4: paciente C; calle 5: control negativo; calle 6: paciente D. La banda intensa de 245 pb corresponde al control de amplificación que debe dar positivo en todas las muestras. La banda de 179 pb corresponde a la amplificación específica del alelo mutado del gen BRAF. Se observa solamente amplificación del alelo mutado en los pacientes A y D, los demás son negativos.

Fig. 2. Resultados de la secuenciación directa de los mismos casos anteriores. A: carcinoma papilar de tiroides (CPT) BRAF positivo. B: hiperplasia nodular coloide. C: CPT BRAF negativo. D: CPT BRAF positivo. Las flechas indican el sitio de mutación, donde cambia timina por adenina, lo que determina la sustitución del aminoácido valina por glutamato (V600E).

Se compararon posteriormente las características clínicas y anatomo-patológicas de los pacientes operados por carcinoma papilar según presentaran o no la mutación de BRAF. Los pacientes con BRAF mutado tenían mayor edad al diagnóstico de CPT con respecto a aquellos con ausencia de la mutación (47.7 ± 12.7 vs. 24.7 ± 8.1 años, p < 0.01). Nueve de los 10 con carcinoma papilar y mutación de BRAF correspondieron a la variante histológica clásica del tumor, mientras que no se observó esta variante en ninguno de los tres casos de carcinoma papilar en que la mutación de BRAF resultó negativa (p < 0.02). El tamaño tumoral fue significativamente mayor en los pacientes con ausencia de la mutación (p < 0.001). No hubo diferencias en cuanto a sexo, extensión extratiroidea, multifocalidad, metástasis ganglionares o estadificación en relación a la presencia o ausencia de la mutación (Tabla 2).

Tabla 2. Características clínicas y anatomopatológicas de los pacientes con carcinoma papilar de tiroides (CPT) en relación a la presencia o ausencia de mutación de BRAF

Discusión

En este estudio analizamos en una población de pacientes operados por nódulos tiroideos benignos y malignos en la Argentina, la presencia de la mutación V600E del oncogén BRAF en la anatomía patológica y su relación con las características clínicas.
Esta mutación fue detectada en 10 de 13, es decir el 77%, de los casos de carcinoma papilar de tiroides estudiados en este trabajo. La mutación V600E de BRAF constituye la alteración genética más común del carcinoma papilar de tiroides, estimándose la prevalencia global mundial en un 45%, con variaciones referidas según distintos estudios entre el 29 y el 83%^{6, 10, 27}. Esta diferencia puede ser debida a diferentes metodologías y poblaciones. En algunos países, como Corea, la prevalencia llega hasta el 90% de los carcinomas papilares²⁸. Existen pocos datos con respecto a la frecuencia de esta alteración genética en Sudamérica. En Brasil, Oler y col. encontraron la mutación en 58 de 120 pacientes (48%)²⁹. Recientemente en Chile, Osorio y col. comunicaron la presencia de la mutación en el 69.6% de un total de 56 muestras analizadas (Osorio F, Pineda P, Cabané P, et al. Alta frecuencia de mutación de BRAFV600E en cáncer papilar de tiroides, asociación con marcadores de diferenciación celular y factores pronósticos clínicos e histológicos. Abstract presentado en el XXIII Congreso de la Sociedad Chilena de Endocrinología y Diabetes, 2012). Nuestros resultados son acordes a la alta prevalencia encontrada en la región.
En este trabajo, de los diez casos de carcinoma papilar que presentaron la mutación V600E, nueve correspondieron a la variante clásica o convencional y solo uno a la variante folicular. La mutación estuvo ausente en las pacientes con variante cribiforme y esclerosante difusa. Estos hallazgos son acordes a lo referido en cuanto a la prevalencia de la mutación según los diferentes subtipos del carcinoma papilar. Se ha comunicado una mayor frecuencia en la variante de células altas (80-83%), seguida de la variante clásica o convencional (60-67%), mientras que se la detecta con menor frecuencia en la variante folicular (12-18%)^{6, 10}. Respecto de los otros subtipos de carcinoma papilar de tiroides poco frecuentes, la mutación V600E de BRAF no ha sido habitualmente estudiada. Trovisco y col.30 detectaron la misma en algunos casos de carcinoma papilar variante oncocítica y símil Warthin, mientras que fue negativa en esclerosante difuso, columnar y mucoepidermoide. Otros autores tampoco la han encontrado en la variante cribiforme³¹.
No detectamos la mutación en ninguna de las muestras obtenidas de nódulos benignos o de tejido tiroideo adyacente normal, acorde a lo referido en la bibliografía. Un metaanálisis basado en estudios que informaron el análisis de la mutación en más de 5000 muestras obtenidas por punción con aguja fina señaló que la presencia de la mutación confiere un riesgo de cáncer tiroideo > 99% en la anatomía patológica³². Solo existen seis casos comunicados de resultados falsos positivos, pero que fueron estudiados en material obtenido por punción con aguja fina, en los que no se encontró cáncer luego de la cirugía^{6, 33}. Es aceptado que el hallazgo de mutación de BRAF en el estudio de los nódulos tiroideos confiere una altísima especificidad para cáncer tiroideo.
Diversos estudios investigaron la relación entre la mutación de BRAF y las características clínico patológicas del carcinoma papilar de tiroides. Si bien los resultados no son completamente consistentes, en la mayoría de los trabajos, de diferente origen geográfico y étnico, se demostró una asociación significativa entre la mutación V600E del oncogén BRAF con uno o más marcadores clínico patológicos de mayor agresividad como extensión extratiroidea, metástasis ganglionares, invasión capsular y vascular, enfermedad más avanzada al momento del diagnóstico y mayor edad^{7, 18-20, 27, 34}. En contraposición, en nuestro trabajo encontramos que el tamaño tumoral fue significativamente mayor en pacientes con ausencia de la mutación. Pero cabe destacar que dos de estos tres pacientes correspondieron a las variantes histológicas esclerosante difuso y cribiforme, asociadas a mayor agresividad. No hubo diferencias significativas en las otras variables clínicas y patológicas analizadas según la mutación estuviera o no presente. No puede excluirse un error estadístico tipo alfa, dado el bajo número de pacientes del estudio. Nuestros pacientes con BRAF mutado tuvieron una edad significativamente mayor al momento del diagnóstico. Este hallazgo puede tener implicancias pronósticas. En un estudio de Howell y col. los pacientes BRAF positivo con edad más avanzada tuvieron tasas de recurrencia más altas³⁵. Recientemente, Xing y col. encontraron una interacción aditiva significativa entre la edad mayor a 45 años y la positividad para la mutación con respecto a la mortalidad por carcinoma papilar³⁶.
La limitación de este estudio es el número acotado de pacientes. Consideramos como fortaleza que fue realizado en una población argentina, según nuestro conocimiento sin datos de referencia previos y que los pacientes se reclutaron en forma prospectiva y consecutiva, evitando posibles sesgos.
En conclusión, comunicamos en una población argentina una frecuencia elevada de mutación V600E del oncogén BRAF en pacientes operados por carcinoma papilar de tiroides. A su vez, la mutación estuvo ausente en todos los casos de nódulos tiroideos benignos y en las muestras obtenidas de tejido adyacente no tumoral. Nuestros hallazgos están en concordancia con lo reportado en la bibliografía.

Conflictos de intereses: Ninguno para declarar.

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