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PUNTOS CLAVE
Conocimiento actual
• La Fiebre Hemorrágica Argentina se caracteriza por presentar un área endémica en continua expansión hacia nuevas áreas y reemergencia de casos en áreas antiguas. La vigilancia ecoepidemiológica en roedores permite evaluar la evolución de la misma e investigar la presencia de otros mammarenavirus.
Contribución
• Estos resultados demuestran la circulación del virus Junin en Calomys musculinus en un área histórica, y contribuyen así al fortalecimiento de las medidas de prevención y control de la enfermedad. Asimismo, de mostramos la co-circulación espacio temporal del virus de la coriomeningitis linfocitaria y del virus Latino.
El género Mammarenavirus (familia Arenaviridae) se divide en dos grupos principales en base a relaciones antigénicas, genómicas y geográficas1,2: el complejo LCM-Lassa en el Viejo Mundo y el complejo Tacaribe en el Nuevo Mundo. Este último contiene virus patogé nicos para humanos: Junin, Guanarito, Sabiá, Machupo y Chapare cuyos reservorios naturales son roedores de la familia Cricetidae, subfamilia Sigmodontinae. Dentro de los mammarenavirus del Viejo Mundo se encuentra el virus de la coriomeningitis linfocitaria, cuyo reservorio es el roedor Mus musculus (familia Muridae, subfamilia Murinae) con distribución mundial.
Los mammarenavirus inducen infecciones persisten tes en sus reservorios, frecuentemente asintomáticas, caracterizadas por viremia crónica, viruria e infección en cerebro3-5. La transmisión al hombre se produce princi palmente por inhalación de partículas virales aerosoliza das provenientes de las excretas de los roedores o por contacto directo con la mucosa conjuntival, o a través de escoriaciones en la piel3-6.
En la década del 50 se identificó el virus Junin (JUNV), agente etiológico de la Fiebre Hemorrágica Argentina (FHA), una enfermedad viral aguda caracterizada por alteraciones vasculares, renales, hematológicas, neuroló gicas e inmunológicas con una letalidad inicial del 15-30% que disminuye a menos del 1% en pacientes tratados con plasma inmune de personas convalecientes7. La incidencia es variable en tiempo y espacio y disminuyó en los últimos 30 años con la administración de la vacuna a virus vivo atenuado Candid#1 cuya inocuidad, inmunogenicidad y eficacia protectora ha sido demostrada8. Los primeros re gistros de la enfermedad se documentaron en el norte de la provincia de Buenos Aires9 y luego fue expandiéndose, de modo lento pero progresivo, en las provincias de Córdoba, Santa Fe y La Pampa. En los últimos 10 años se observó una expansión hacia el noroeste (Fig. 1) y reemergencia en áreas geográficas después de 15-20 años sin registro de casos. Por ser una zoonosis, la FHA es una enfermedad controlable pero no erradicable. El roedor Calomys muscu linus es el reservorio natural del JUNV3,10,11 que produce en el roedor una infección asintomática con eliminación de virus por saliva y orina. La transmisión del virus entre roedores es principalmente horizontal y se produce durante encuentros agresivos entre los individuos machos.
Fig. 1 Expansión del área endémica de la Fiebre Hemorrágica Argentina en los últimos 10 años (2011-2020)
En Argentina, ha sido documentada la actividad de otros dos mammarenavirus: el virus de la coriomeningitis linfocitaria (LCMV) y el virus Latino (LATV). El LCMV fue identificado a partir de casos humanos en base al diag nóstico diferencial con la FHA y también de roedores de la especie Mus musculus, de zonas rurales y urbanizadas del área endémica de FHA en donde inicialmente se lo identificó en la década del 7012-15. También en zonas urbanas, Riera et al14 registraron actividad del LCMV en M. musculus y humanos en un estudio longitudinal realizado en la ciudad de Rio Cuarto. La enfermedad en humanos se presenta como un cuadro febril leve, aunque los principales signos y síntomas de la infección son en especial de orden neurológico16. Las formas clínicas más graves de la enfermedad por el LCMV17 se registran en la infección prenatal y pacientes trasplantados en los que provoca una insuficiencia multisistémica18. El LATV, originalmente caracterizado en Bolivia en el roedor Ca lomys callosus, fue identificado en Argentina en roedores Calomys fecundus de la provincia de Jujuy
(Calderón G et al. Isolation of Latino virus (Arenaviri dae: Arenavirus) from Calomys fecundus captured in Jujuy province, northwestern of Argentina. 59 th Annual Meeting of Wildlife Disease Association. 2010; 30 de mayo al 4 de Junio. Puerto Iguazú, Misiones) y en la región central de Argentina, parte de la cual se superpone con la zona endémica de FHA, en individuos de la especie Calomys venustus19. El LATV no ha sido aún asociado a enferme dad en humanos20.
En el marco del Programa Nacional de Control de la FHA21, realizamos anualmente la vigilancia ecoepidemio lógica de C. musculinus a fin de evaluar la evolución del área endémica de la infección como insumo estratégico para las actividades de prevención y control de la FHA. En este sentido, seleccionamos el departamento Río Cuarto en la provincia de Córdoba, una región histórica dentro del área endémica de la FHA, sin registro de casos confirmados desde la década del 90, con el objetivo de evaluar la presencia de C. musculinus, estudiar la activi dad del JUNV y la circulación de otros mammarenavirus presentes en la región.
Materiales y métodos
El área de estudio seleccionada fue la zona rural de la loca lidad de Chucul, Río Cuarto, (33° 01’ 26”S y 64° 10’ 16” W). El clima del área es templado con marcada estacionalidad22. La zona rural está constituida por una matriz de campos de cultivo, con remanentes de vegetación prístina y malezas distribuidas en sus bordes23. El área se caracteriza por la actividad agrícola-ganadera, donde los lotes de cultivo se en cuentran delimitados por alambrados circundados por bordes enmalezados y, en algunas ocasiones, por árboles.
El estudio se realizó en las estaciones de verano, otoño y primavera de 2016 y verano-otoño de 2017. En los bordes con malezas se instalaron líneas de 20 trampas de captura viva distanciadas cada 6 metros y se mantuvieron activas durante 4 noches consecutivas. El sistema empleado con sistió en la captura, marcación, liberación y recaptura y se obtuvo una muestra de sangre al momento de la captura. No se tomó muestra de sangre a los animales recapturados en el mismo período de muestreo a fin de no alterar la volemia y la sobrevida de los animales.
Las trampas fueron cebadas con una mezcla de grasa vacuna, pasta de maní y esencia de vainilla. Los roedores cap turados fueron trasladados a un laboratorio de campo donde fueron procesados, previa anestesia profunda con isoflurano, siguiendo los procedimientos de bioseguridad establecidos24. Todos los animales recibieron un tratamiento humanitario de acuerdo a la legislación vigente en Argentina (Ley 14346). La identificación de las especies de los roedores capturados se realizó en el campo por morfometría. Se obtuvo una muestra de sangre en la primera captura del individuo, la cual se man tuvo en nitrógeno líquido hasta su arribo al Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas donde fueron conservadas a -70 °C hasta su procesamiento25.
Se determinaron los valores de éxito de captura como una estimación de la abundancia relativa expresada como: IDR= (número de capturas / número de trampas x noches) x 100, donde el número de capturas tiene en cuenta los animales capturados sin marcar y los recapturados (marcados) una sola vez en cada sesión de muestreo, dado el método de muestreo utilizado (CMR).
La búsqueda de anticuerpos de tipo IgG se realizó me diante la prueba de inmunoensayo ligado a enzima (ELISA) utilizando antígenos específicos para JUNV, LCMV y LATV, siguiendo protocolos previamente publicados14,26 (Levis S. Comunicación personal).
La identificación molecular de las especies de roedores se realizó mediante la secuenciación del gen mitocondrial cito cromo b. La extracción de ADN se realizó con el kit DNeasy Blood &Tissue de Qiagen Inc (Alemania). El gen citocromo b fue amplificado con los primers Mus 14095 F (5’-GACATGA AAAATCATCGTTGTAATTC-3’) y Mus 15398 R (5’-GAATAT CAGCTTTGGGTGTTGRTG-3´)27. La reacción de amplificación se realizó siguiendo las condiciones descriptas por Gonzalez Ittig et al.28. La secuenciación se realizó empleando el equipo ABI PRISM3100 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Los análisis filogenéticos se realizaron con el programa PAUP *4.0b1029. Se realizaron búsquedas heurísticas para hallar los árboles de máxima parsimonia (MP) los soportes de los nodos fueron estimados mediante el método de bootstrap con 1000 réplicas para obtener un árbol consenso de mayoría. Se utilizó una matriz para cada género, de esta manera se utilizaron secuencias de referencia para la identificación de individuos de las distintas especies.
Para detectar el genoma viral, se utilizaron todas las mues tras de sangre disponibles de C. musculinus y M. musculus y una submuestra (70.7%) de C. venustus adsorbidas30 en tarjetas FTA. La extracción del ARN se realizó utilizando el kit Qiamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen Inc., Alemania) según protocolo del fabricante. Para amplificar el genoma viral se utilizó una RT-PCR anidada utilizando en la primera corrida oligonucleótidos genéricos para mammarenavirus que amplifi can un fragmento de 600 nucleótidos (nt) de la nucleoproteína de los virus circulantes en Argentina31 y el 16V (GGMA YWGWDCCRAAYTGATT). Para la segunda amplificación se utilizaron oligonucleótidos específicos para JUNV: 3181V (CTT GGTTGAAGTCAATGCTGTCAG) y 3309C (GATCTTCTGG CATGGCACACTC) y para LCMV: 2835V (CCCAAACYCTTAC CACACCACTTG) y 3194C (ATGCAACCAACCTTCTRAATGG) (Calderón G, Weaver S, comunicación personal) que ampli fican un fragmento de 150 y 380 nt, respectivamente. Para el LATV, se diseñaron oligonucleótidos específicos para utilizar en una RT-PCR que amplifica un fragmento de 660 nt de la nucleoproteína: 142V (TGCCACCYTTCT TCTTTC) y 930C (TGCWTGYYTGGTKGATGG) y para la segunda amplificación: 267V (GGMRATGTCWGGTCTYCC) y 930C.
Los amplicones obtenidos fueron purificados con el kit QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen Inc., Alemania) siguiendo las recomendaciones del fabricante y secuenciados con un equipo 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Los electroferogramas obtenidos fueron revisados con Chro mas y las secuencias fueron alineadas por la herramienta Clustal Wallis implementada en BioEdit 7.2.015.
Para la asignación del genotipo viral, se realizó un análisis por Neighbour Joining con el programa MEGA-X (versión 10.2.6)32. Para la comparación se utilizaron genotipos publicados en el GenBank y el soporte estadístico fue realizado por análisis de bootstrap con 1000 replicados.
Resultados
Durante los cinco muestreos estacionales realizados en los dos años de estudio se realizó un esfuerzo de captura de 11 340 trampas. Se capturaron 857 roedores corres pondientes a 8 especies (Akodon azarae, Calomys laucha, Calomys musculinus, Calomys venustus, Mus musculus, Oligoryzomys flavescens, Oxymycterus rufus y Rattus rattus) pertenecientes a 6 géneros y 2 familias (Cricetidae y Muridae), y se obtuvieron 629 muestras de sangre.
En base a los objetivos planteados en este trabajo, los resultados se centraron en las especies C. musculinus, M. musculus y C. venustus que actúan como reservorio de los mammrenavirus JUNV, LCMV y LATV en Argentina. Los roedores de estas tres especies representaron el 57.3% (491/857) del total de capturas.
Los índices de abundancia relativa de C. musculinus y C. venustus se muestran en la Figura 2; M. musculus no está representado debido a la escasa captura obte nida (n = 3).
Fig. 2 Índices de abundancia relativa de Calomys musculinus y Calomys venustus, por estación durante 2016-2017, área rural Chucul (Provincia de Córdoba)
Calomys musculinus fue capturado mayo ritariamente en otoño y verano, con valores bajos en la primavera. Calomys venustus mostró valores menores de abundancia en todos los períodos de muestreo, re gistrando un ascenso hacia el final del estudio (Fig. 2).
La determinación de la infección por JUNV y LCMV se realizó en 257 muestras de sangre (254 de C. musculinus y 3 de M. musculus) mediante pruebas de ELISA IgG y RT-PCR. La prevalencia total de infección fue 3.5 % (9/254) para JUNV y 100% (3/3) para LCMV. La prevalencia de infección para LATV se realizó en las muestras de sangre de C. venustus y fue 20.3 % (25/123 muestras estudiadas) por ELISA IgG, y 24.1% (21/87 muestras estudiadas) por RT-PCR. De los individuos positivos, algunos presentaron solo anticuerpos; otros solo genoma viral y en 7 detectamos la presencia simultánea de genoma viral y anticuerpos (Tabla 1).
Tabla 1 Infección por JUNV, LCMV y LATV en Calomys musculinus, Mus musculus y Calomys venustus, respectivamente, por ELISA IgG y RT-PCR específicas, distribuidas por estación y por año. Localidad de Chucul, Río Cuarto, Córdoba, 2016-2017
La infección por JUNV en C. musculinus y LCMV en M. musculus, se registró en el verano de los dos años de estudio y en el otoño de 2017, y varió entre 1.6% y 8.1% por ELISA IgG, y entre 1.6% y 2.2% por RT-PCR para JUNV. Respecto de la infección por LCMV en M. musculus, los tres ejemplares capturados fueron positi vos, ya sea por una sola o por ambas técnicas RT-PCR y ELISA IgG. La infección por LATV se registró en todas las estaciones estudiadas y con alta tasa de infección, con variación por ELISA IgG entre 6.6% y 30.4%, y por RT-PCR entre 7.7% y 40.7%.
En tres (veranos 2016-2017 y otoño de 2017) de los cinco muestreos demostramos la co-circulación espacio temporal de los tres mammarenavirus y logramos am plificar el genoma de estos tres agentes virales. En los muestreos de otoño y primavera de 2016 solo registramos infección por LATV.
El análisis de las secuencias de un fragmento de 350 nt correspondiente al gen N de las 3 cepas de LCMV amplificadas, mostró una identidad del 85% a nivel nu cleotídico con la cepa LCMV 811316 de Massachusets, EE.UU.33. Los fragmentos amplificados de 380 nt de LATV agruparon en el grupo C de mammarenavirus, más relacionado con el LATV. Los fragmentos de 150 nt del JUNV presentaron una similitud del 93% con otras cepas de JUNV de nuestro laboratorio y del GenBank.
Los análisis filogenéticos (no mostrados) en base al gen citocromo b permitieron identificar los 6 individuos del género Calomys infectados con JUNV y LATV. Se identificaron por RT-PCR 4 C. musculinus (GenBank: OK075110 al OK075113) positivos para JUNV y 2 C. venustus (GenBank: OK075114 y OK075115) que pre sentaron anticuerpos de tipo IgG por ELISA para LATV.
Discusión
En estudios previos34 habíamos registrado la presencia de C. musculinus en la ciudad de Río Cuarto (160 000 habitantes), lo que indica un potencial riesgo de introduc ción del JUNV en zonas urbanas. En el presente trabajo demostramos la circulación del JUNV en C. musculinus capturados en una localidad distante 22 km de la ciudad de Río Cuarto, en cuyo departamento homónimo no se registran casos confirmados de FHA desde la década del 90.
De todas las especies capturadas, C. musculinus fue la especie más abundante, con altos valores en el verano tardío y otoño que disminuyeron hacia la primavera, de acuerdo a lo descripto por otros autores35.
La prevalencia de infección del JUNV detectada fue alta al comienzo del estudio (8.1%) y disminuyó hacia el final del mismo, la prevalencia total de infección fue 3.5%, similar a la registrada en localidades con alta incidencia de casos de FHA en la década del 9036,37. La ausencia de infección en el otoño de 2016 podría estar asociada a una marcada baja en la captura de C. musculinus. Debido a la ausencia de una muestra de cerebro como consecuencia del sistema de captura, marcación y liberación de los animales, conjeturamos que la prevalencia de infección podría ser aún mayor considerando la capacidad del JUNV de producir in fección persistente en C. musculinus con viremias pro longadas, persistencia de virus en cerebro y presencia o ausencia de anticuerpos (Calderón GE. Desarrollo de indicadores de riesgo de contraer la Fiebre Hemo rrágica Argentina (FHA) por medio del estudio de los roedores que actúan como reservorio de los Arenavirus en Argentina. Tesis doctoral. Universidad Nacional del Litoral, 2004).
Estos resultados contribuyen a la ampliación del área endémica de la enfermedad y demuestran la necesidad de reforzar las estrategias de vacunación de la población con la vacuna Candid#1.
La circulación del LCMV en ambientes rurales fue re gistrada por primera vez en Argentina en la década del 60 en M. musculus12 y más adelante en trabajadores rurales del área endémica de FHA38. En este estudio, la infección de los tres M. musculus capturados, indicaría una alta tasa de infección, no cuantificable por el escaso número de animales. Estos resultados junto a los obtenidos por otros autores15 demuestran que el LCMV continúa circulando en la región central de Argentina. Considerando que M. musculus es una especie predominantemente comen sal, que alcanza sus máximos valores de abundancia dentro de edificaciones humanas o cerca de ellas, es de fundamental importancia la información epidemiológica obtenida al momento de la consulta médica para evaluar el probable contacto con roedores o sus excretas que contribuya al diagnóstico diferencial de LCMV en las meningitis asépticas de origen viral.
En relación al LATV, la mayor tasa de infección obtenida fue en C. venustus y se registró en todas las estaciones del año. Teniendo en cuenta que por RT-PCR solo se estudió una muestra del total de roedores cap turados, consideramos que existiría una alta prevalencia de infección natural producida por este agente viral cuya patogenicidad en humanos es desconocida.
Estudios de Sabattini et al39 registraron circulación simultánea de JUNV y LCMV en el área endémica de FHA. En el presente trabajo demostramos la cocircula ción espacio-temporal de JUNV, LCMV y LATV en una localidad fuera del área endémica de FHA.
En conclusión, la circulación de JUNV detectada más allá del área endémica de FHA, constituye un aporte de fundamental importancia para el fortalecimiento de las actividades del Programa Nacional de Control de la FHA, como es la prevención y control mediante va cunación de la población con la vacuna Candid#1 con eficacia de 95.5% e inmunogenicidad de 90%. Demos tramos la circulación de LCMV en su reservorio natural, lo que indica la necesidad de continuar con la vigilancia ecoepidemiológica de M. musculus y la vigilancia en humanos en la región y en otras áreas geográficas a fin de establecer su distribución real e impacto en la salud pública. La circulación de LATV y la alta prevalencia de infección hallada sugieren la necesidad de realizar estu dios de laboratorio para evaluar el potencial patogénico para humanos. Asimismo, aportamos información que contribuye a la distribución de los mammarenavirus en sus reservorios naturales más allá del área endémica de la FHA y demostramos la cocirculación temporo-espacial de los mammarenavirus JUNV y LCMV patogénicos para humanos y LATV de patogenicidad desconocida.
