MICROBIOLOGÍA

Evaluación del ensayo de L-prolina iminopeptidasa para el diagnóstico de vaginosis bacteriana*

Emilio Rogelio Marguet¹, Pía Valeria Aloisi², Marisol Vallejo²

1. Doctor en Bioquímica.
2. Licenciada en Ciencias Biológicas.

* Facultad de Ciencias Naturales (Sede Trelew), Universidad Nacional de la Patagonia. Roca 115, 9100 Trelew. Argentina.

Resumen

La detección de enzimas específicas es potencialmente útil para el diagnóstico de vaginosis bacteriana (VB). La actividad de la L-prolina iminopeptidasa fue ensayada en muestras de exudados vaginales de 253 pacientes y estos resultados se compararon con los obtenidos por un método de examen microscópico basado en 6 grados de clasificación. En los 6 grados se halló una relación directa entre el número de casos con actividad enzimática y el cambio en la flora vaginal de morfotipos de Lactobacillus a una flora mixta compuesta principalmente por bacilos gram negativos, bacilos gram variables y bacilos gram negativos curvos. La especificidad y sensibilidad del método para la predicción de VB fueron 97,7% y 94, 8%, respectivamente, valores comparables con los hallados en evaluaciones previas. Los resultados de la evaluación sugieren que el ensayo de L-prolina iminopeptidasa es un método simple y rápido que puede ser utilizado como herramienta complementaria para el diagnóstico de VB.

Palabras clave: L-prolina iminopeptidasa; Vaginosis bacteriana.

Summary

Evaluation of L- proline iminopeptidase assay for the diagnosis of bacterial vaginosis

The detection of specific enzymes has potential use in the diagnosis of bacterial vaginosis (BV). L-proline iminopeptidase activity was assayed in vaginal fluid samples from 253 patients, and these results were compared to those obtained by a microscopic examination method based on 6 grades of classification. In the 6 grades a direct correlation between the numbre of the the cases with enzyme activity and the shift in the vaginal flora from Lactobacillus morphotypes to a mixed flora composed mainly of gram negative rods, gram-variable rods and curved gram negative rods, was found. The specificity and sensitivy of the assay for the prediction of BV were 97.7% and 94.8%, respectively, values that were comparable with those found in previus evaluations. The results of the evaluation suggest that L-proline imipeptidase assay is a simple and rapid method that can be used as a complementary toll for the diagnosis of BV.

Key words: L-proline iminopeptidase; Bacterial vaginosis

Introducción

   La vaginosis bacteriana (VB) se define como un síndrome marcado por el cambio de la flora normal, constituida principalmente por especies de Lactobacillus, por una flora mixta donde Gardnerella vaginalis, Mobiluncus spp Bacteroides y spp Prevotella spp son los géneros más frecuentemente hallados ⁽¹⁾.
   Además de relacionarse con la enfermedad inflamatoria pélvica y endometritis, en años recientes se ha postulado que la flora vinculada con VB puede ascender hasta el útero y desencadenar la liberación de mediadores inflamatorios que tendrían influencia durante el embarazo, adelantando la labor de parto ⁽²⁾.
   El diagnóstico clínico de VB generalmente se lleva a cabo utilizando los criterios de Amsel ⁽³⁾: a) flujo vaginal abundante o anormal, b) elevado pH vaginal (> 4,5), c) desprendimiento de aminas por tratamiento con OHK al 10% y d) presencia de células clave en la coloración de Gram; sin embargo, más de la mitad de las mujeres diagnosticadas según los criterios enunciados, no presentan síntomas.
   La observación de los extendidos coloreados con la técnica de Gram constituye una herramienta eficaz, rápida y de bajo costo para el diagnóstico de VB. Durante las últimas dos décadas y con el propósito de lograr unificar criterios que permitan comparar resultados entre distintos operadores o laboratorios, se han estandarizado metodologías de observación microscópica que asignan puntuaciones o grados según la flora dominante ⁽⁴⁾⁽⁵⁾.
   En la actualidad, la modificación de Hay ⁽⁶⁾ sobre los criterios de Spiegel ⁽⁴⁾ constituye uno de los métodos más difundidos para asignar distintos grados a la flora observada: normal (Lactobacillus como flora dominante), intermedio (disminución de Lactobacillus en combinación con otros morfotipos) y VB (ausencia o marcada disminución de Lactobacillus en combinación con morfotipos de Gardnerella spp). También en los últimos años se ha comenzado a aplicar con mayor frecuencia el sistema Nugent ⁽⁵⁾ que asigna valores de 0 a 10 según el número observado de Lactobacillus, bacilos gram negativos o gram variables y bacilos curvos gram negativos.
   Sin embargo, estos ensayos resultan subjetivos y requieren de observadores con considerable experiencia, razón por la cual se han desarrollado técnicas cuyos resultados no dependen del operador. Un ejemplo de esta tendencia, resulta el análisis de compuestos volátiles por cromatografía gas-líquido ⁽⁷⁾⁽⁸⁾, una técnica precisa para el diagnóstico de VB, pero lamentablemente de un grado de complejidad técnica que sólo permite ser realizada por laboratorios altamente especializados. Como consecuencia de esta situación, su práctica ha caído en progresivo desuso.
   En los últimos años se han desarrollado pruebas para detectar actividades enzimáticas en exudados vaginales, que resultan específicas para el diagnóstico de VB y además presentan la ventaja de ser fácilmente interpretables y no requerir equipos sofisticados ^(9)(10). En el presente trabajo se exponen los resultados de una evaluación donde se determinó la actividad de L-prolina iminopeptidasa ⁽¹⁰⁾ en exudados vaginales clasificados según una modificación del sistema de Nugent.

Materiales y Métodos

   Toma de muestras: se tomaron dos muestras de exudados vaginales de pacientes con edades comprendidas entre 20 y 40 años, que acudieron en forma espontánea a la consulta ginecológica y no se hallaban bajo tratamiento médico. Una de las muestras se utilizó para realizar la coloración de Gram y una preparación húmeda, y la restante para el ensayo enzimático.

   Criterios de clasificación: para la observación microscópica se tomó como referencia el sistema Nugent, reemplazando la escala original de 0 a 10, por una de 6 grados que contemplaba los siguientes criterios:

Grado 1: Lactobacillus como única flora.
Grado 2: Lactobacillus como flora predominante y escasos bacilos gram negativos o gram variables.
Grado 3: Lactobacillus y bacilos gram negativos o gram variables en poblaciones comparables.
Grado 4: bacilos gram negativos o gram variables como flora predominante y escasos Lactobacillus.
Grado 5: bacilos gram negativos o gram variables como única flora.
Grado 6: bacilos gram negativos o gram variables, bacilos gram negativos curvos y células clave.

   Fueron excluidas de este trabajo las muestras con presencia de Trichomonas vaginalis o levaduras.

   Determinación de la actividad de L-prolina iminopeptidasa: la muestra se suspendió en 0,5 mL de buffer imidazol 0,1M pH 6,8 mediante agitación con vortex durante 1 min. Posteriormente se adicionaron 50 µL de L-prolina b-naftilamina al 1% en agua destilada. La mezcla se incubó durante 2 h a 37 ºC y la presencia de b-naftilamina se reveló adicionando 50 µL de Fast Garnet al 0,2% en agua destilada. El desarrollo de color rosa o rojo se consideró como actividad enzimática positiva.

Resultados

   En la Tabla 1 se exponen los resultados obtenidos en la observación de los exudados vaginales coloreados por la técnica de Gram y la actividad de L-prolina iminopeptidasa. Desde el punto de vista epidemiológico los resultados son comparables con los hallados por otros autores (5)(10), que afirman que aproximadamente 2/3 de las pacientes presentan algún grado de vaginosis. En este trabajo, al considerar los grados 3 a 6, se encontró que 164 de un total de 253 muestras observadas (64,8%) exhibían una flora vinculada con VB. Las restantes 89 pacientes (grados 1 y 2) presentaban exudados vaginales considerados normales según los criterios descriptos en Materiales y Métodos, y también de acuerdo a los utilizados en trabajos previos  (Tabla I) ⁽⁴⁾⁽⁵⁾.

Tabla 1. Relación entre la actividad de L-prolina iminopeptidasa y el grado de la flora bacteriana hallada en la observación microscópica

	Grado
	1	2	3	4	5	6
n	65	24	34	32	51	47
positivo	1	1	13	26	47	46
negativo	64	23	21	6	4	1

   Sólo una muestra de las 65 clasificadas como grado 1 y una muestra de las 24 clasificadas como grado 2 desarrollaron actividad enzimática. En el otro extremo, 51 muestras fueron clasificadas como grado 5, y 47 como grado 6, exhibiendo 47 y 46 reacciones enzimáticas positivas, respectivamente. Los grados intermedios representados por 34 muestras clasificadas como grado 3, y 32 como grado 4, resultaron positivas en 13 y 26 casos, respectivamente.

Discusión y Conclusiones

   Las pacientes que padecen VB son frecuentemente asintomáticas y en consecuencia este desorden puede permanecer sin diagnóstico a menos que sea investigado en forma específica. La observación microscópica de exudados vaginales constituye, dentro los criterios de Ansel ⁽³⁾, la herramienta más utilizada para realizar el diagnóstico de esta patología.
   Sin embargo, debido a que es una prueba subjetiva, existen divergencias en su interpretación que conducen a resultados que afectan su reproducibilidad ^{(11) (12)}, aun en manos de operadores experimentados. Por consiguiente, existe la necesidad de evaluar métodos que resulten herramientas de diagnóstico accesibles y de sencilla instrumentación.
   En los 6 grados de clasificación fue posible asociar en forma directa el número de casos con actividad positiva con el nivel de colonización por bacilos gram negativos o gram variables y bacilos curvos gram negativos. La flora asociada a VB, especialmente Gardnerella vaginalis expresa una alta actividad de L-prolina iminopeptidasa ^(13)(14), mientras que en el género Lactobacillus esta enzima se manifiesta con una muy baja actividad ⁽¹⁵⁾.
   Al tomar en consideración los grados 1 y 2 como exudados normales y los grados 5 y 6 como VB, según lo sugieren los criterios establecidos en trabajos previos ⁽⁴⁾⁽⁵⁾, se encontró que la especificidad del ensayo es 97,7% y la sensibilidad 94,8%, resultados comparables con los hallados en otros estudios de evaluación ^(10)(13).
   La b-naftilamina liberada como producto de la acción de la L-prolina iminopeptidasa sobre el sustrato reacciona con Fast Garnet, dando una coloración que varía de rosa al rojo intenso permitiendo una fácil lectura y buena diferenciación con respecto al color amarillo o anaranjado desarrollado en aquellas muestras que no exhiben actividad enzimática.
   Durante los últimos años también se han desarrollado otros sistemas basados en la detección de enzimas bacterianas, destacándose el ensayo de sialidasa. Esta enzima está presente en Gardnerella vaginalis, Mobiluncus spp, Bacteroides spp, Prevotella spp,y su ensayo en exudados vaginales ha demostrado tener una alta sensibilidad y especificidad ^(9)(16). Sin embargo, la desventaja de esta prueba es el alto costo de su implementación, contrariamente a lo que sucede con L-prolina iminopeptidasa cuyo ensayo implica el uso de sustratos económicos.
   Al analizar los resultados obtenidos en esta evaluación se puede concluir que la determinación de la actividad enzimática de L-prolina iminopeptidasa constituye una prueba de bajo costo, sencilla implementación, fácil interpretación, con una sensibilidad y especificidad que la transforman en una herramienta útil para ser utilizada, en forma complementaria, en el diagnóstico de VB.

CORRESPONDECIA

Dr. EMILIO R. MARGUET
Facultad de Ciencias Naturales (Sede Trelew)
Universidad Nacional de la Patagonia
Roca 115
9100 TRELEW
Argentina

Referencias bibliográficas

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Aceptado para su publicación el 28 de junio de 2004