MICROBIOLOGÍA

Evaluación del fijador-colorante azul de metileno para el diagnóstico directo de Trichomonas vaginalis

Sixto Raúl Costamagna¹, Javier Dupin², Susana Vaylet³, Patricia Pellegrino³

1. Doctor en Bioquímica, Profesor Adjunto a cargo de la Cátedra de Parasitología Clínica. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia. Universidad Nacional del Sur. Bahía Blanca, Argentina.
2. Bioquímico. Ayudante de docencia, Cátedra de Parasitología Clínica. Universidad Nacional del Sur. Bahía Blanca.
3. Bioquímico. Servicio de Laboratorio. HIGA Dr José Penna. Bahía Blanca

Resumen

El diagnóstico de laboratorio del parásito Trichomonas vaginalis, sigue siendo objeto de nuevos estudios. Así, Mendez y col., sugieren la utilización de un fijador-colorante con azul de metileno para el diagnóstico directo de este flagelado. En el presente trabajo se efectuó la validación de la mencionada propuesta frente al examen en fresco. Se analizaron cien flujos vaginales, obtenidos de fondo de saco, de pacientes a las cuales se les había solicitado examen microbiológico de flujo vaginal. Las muestras fueron recolectadas y procesadas siguiendo la técnica de fijador-colorante con azul de metileno, efectuándose, además, un examen en fresco del material obtenido, sin coloración, entre porta y cubreobjetos, antes de transcurrida la hora de la obtención. El análisis de los resultados fue realizado mediante el software EpiDat de la OPS/OMS. La sumatoria de los positivos por ambas pruebas fue considerada como prueba de referencia.  Los resultados, para un nivel de confianza del 95%, fueron, para el examen en fresco: Sensiblidad (S) 66,6%, Especificidad (E) y valor predictivo del resultado positivo (VPRP) 100%, valor predictivo del resultado negativo (VPRN) 93,93%, Valor global de la prueba (VGP) 94,59% y Razón de verosimilitud negativa (RVN) 0,33. Para el fijador-colorante con azul de metileno. S, E, VPRP, VPRN y VGP 100%; RVN 0 (cero). De acuerdo con los resultados obtenidos, se puede señalar que el fijador-colorante evaluado, en base a su especificidad, sensibilidad diagnóstica, VPRP y VPRN es recomendable para el diagnóstico directo de T. vaginalis en flujo vaginal, en reemplazo del examen en fresco, o como segundo test.

Palabras clave: Trichomonas vaginalis; Trichomonosis; Parásito; Diagnóstico.

Summary

Evaluation of metilene blue staining-fixing technique for diagnosis of Trichomonas vaginalis

Trichomonas vaginalis laboratory diagnosis is still the focus of attention of several research studies. Mendez et al have proposed a staining-fixing technique for the wet mount examination of this flagellate. The purpose of the present study is to examine the validity of such proposal against the conventional wet mount examination. For this purpose, a hundred vaginal secretions were analyzed. They were obtained from the vaginal cavity of female subjects to whom a microbiological examination had been requested. Samples were collected and processed following Méndez et al's technique. In parallel, and before an hour of obtention had elapsed, a conventional wet mount examination of the obtained material was carried out between the slide and cover glass and with no staining solution. The results obtained were analyzed with EpiDat Software from PAHO/WHO. The total of positive results in both tests was considered as reference test. The results derived from the present study with a 95% confidence level were, for conventional wet mount examination: Sensitivity 66.6%, Specificity 100%, Predictive Value of Positive Result (PVPR) 100%, Predictive Value of Negative Result (PVNR) 93.93% and Global Value of the Test 94.59% and ratio of verisimilitude negative 0.33. For the staining-fixing technique, Sensitivity, Specificity, PVPR, PVNR, Global Value of the Test were 100% and ratio of verisimilitude negative was 0.00. Based on its specificity, diagnostic sensitivity, PVPR, and PVNR, and in view of our results, it can be concluded that staining-fixing technique could be recommended either as a second test or instead of the conventional wet mount examination for the direct diagnosis of T. vaginalis in vaginal secretions.

Key words: Trichomonas vaginalis; Trichomonosis; Parasite; Diagnosis.

Introducción

   Si bien existen métodos muy específicos y sensibles que utilizan las herramientas que proporciona la Biología Molecular y la Inmunología para el diagnóstico de laboratorio del parásito Trichomonas vaginalis, en la actualidad continúan los estudios, ya que los costos y la complejidad de los exámenes no siempre los colocan al alcance del paciente y de los laboratorios (1-5). En la búsqueda de métodos de diagnóstico sensibles, específicos y de muy bajo costo, Mendez y col. (6) sugirieron la utilización de un fijador-colorante para el diagnóstico directo de este flagelado. En el presente trabajo se efectuó la validación de la mencionada propuesta, frente al examen en fresco, por ser el método en cuestión el más utilizado en este medio para el diagnóstico de T. vaginalis en el laboratorio de análisis clínicos.

Materiales y Métodos

   Se analizaron 100 muestras de flujo vaginal, obtenidos de fondo de saco, de pacientes que concurrieron al servicio de laboratorio del HIGA Dr. José Penna, a las cuales se les había solicitado examen microbiológico de flujo vaginal. Las muestras fueron procesadas simultáneamente por dos métodos: examen en fresco y coloración-fijación con azul de metileno (6).
   El examen en fresco se realizó diluyendo el flujo vaginal con una gota de solución de ClNa 0,9%, observándose cada muestra entre porta y cubreobjeto al microcopio óptico, durante 5 min, con objetivo de 40X.
   El colorante-fijador evaluado fue preparado de acuerdo con la propuesta original (6). La solución de trabajo fue preparada y utilizada en el día, mezclando en partes iguales las soluciones SAF y Azul de Metileno. A un mL de esta solución se le agregó el flujo vaginal recientemente obtenido, se homogeneizó adecuadamente y se tapó hasta su procesamiento.
   Una vez en el laboratorio se procedió a la centrifugación de este material a 2000 rpm durante 5 min. A continuación se descartó el sobrenadante y se observó el sedimento al microscopio óptico, entre porta y cubreobjetos, con objetivos de 10X y 40X, durante 5 min cada uno.
   Para cada método validado se determinó sensibilidad diagnóstica (SD), especificidad (E), valor predictivo del resultado positivo (VPRP) y negativo (VPRN), valor global de la prueba (VGP) y razón de verosimilitud negativa (RVN).
   La SD se definió como el número de casos detectados por cada método, dividido por el número total de detectados por todos ellos, razón por la cual las sensibilidades podrían llegar a estar sobreestimadas.
   El VPRP se definió como la probabilidad de que un paciente efectivamente padezca la enfermedad cuando el resultado del examen es positivo.
   El VPRN fue definido como la probabilidad de que un paciente no presente la enfermedad cuando el resultado de la prueba es negativo.
   Especificidad fue definida como la proporción de sanos que tienen una prueba negativa.
   Valor global de la prueba fue definido como la probabilidad de que un individuo sea clasificado correctamente por la prueba.
   Razón de verosimilitud negativa fue considerada a la probabilidad de encontrar una prueba negativa en presencia de la enfermedad, dividida por la probabilidad de una prueba negativa en ausencia de enfermedad.
   El análisis de los resultados fue realizado mediante el Software EpiDat de la OPS/OMS. Como prueba de referencia se consideró a la sumatoria de los positivos por ambas pruebas.

Resultados

   Los resultados de las experiencias, para un nivel de confianza del 95% se muestran en la Tabla I.

   Todas las muestras que fueron positivas al examen en fresco también lo fueron con el fijador-colorante azul de metileno, mientras que lo inverso no fue observado.

Discusión y Conclusiones

   De acuerdo con los resultados expuestos se puede señalar que el fijador colorante con azul de metileno (6), teniendo en cuenta a su especificidad, sensibilidad diagnóstica, VPRP, VPRN, VGP y RVN,  es recomendable para el diagnóstico de T. vaginalis en flujo vaginal. Estos resultados sugieren, de acuerdo con datos obtenidos por Costamagna y col. (5)(7), que el fijador-colorante validado en el presente trabajo, se podría utilizar en reemplazo de la coloración de May Grunwald-Giemsa, habitualmente usada para estos fines, ya que ambas presentan sensibilidades semejantes, pero con un mejor valor predictivo del resultado negativo a favor de la coloración con azul de metileno. Además, el método validado precedentemente permite el procesamiento del material mucho tiempo después de obtenido, inclusive meses. El aumento de sensibilidad respecto del examen en fresco, se debe a que en esta propuesta se efectuó una concentración del material, antes de su observación (6). Como queda demostrado, ningún examen en fresco arrojó resultado positivo y coloración-fijación con azul de metileno negativa, mientras que, a la inversa, todos los estudios resultaron positivos con el azul de metileno, por lo que se considera pertinente el reemplazo del examen en fresco por el fijador-colorante o azul de metileno para el diagnóstico directo de T. vaginalis por el laboratorio microbiológico.

AGRADECIMIENTOS

   Los autores agradecen muy especialmente a la Técnica de Laboratorio ELIDA SÁNCHEZ, del Servicio de Laboratorio del HIGA Dr. José Penna, por su invalorable y desinteresada colaboración.

CORRESPONDENCIA

Dr. SIXTO RAÚL COSTAMAGNA
Cátedra de Parasitología Clínica
Departamento de Biología,
Bioquímica y Farmacia
Universidad Nacional del Sur
San Juan 670
8000 BAHÍA BLANCA
Argentina.
E-mail: rcostama@criba.edu.ar

Referencias bibliográficas

1.   Smith R. Detection of Trichomonas vaginalis in vaginal specimens by Direct Immunofluorescence Assay. J Clin Microbiol 1986; 24: 1107-8.
2.   Gambosova A, Valent M. Dot-immunobinding assay with monoclonal antibody for detection of Trichomonas vaginalis in clinical specimens. Genitourin Med 1990; 66: 447-50.
3.   Rubino S, Muresu R, Rappelli P. Molecular probe for identification of Trichomonas vaginalis DNA. J Clin Microbiol 1991; 29: 702-6.
4.   Okuyama T, Takahashi R, Mori M. Polymerase chain reaction amplification of Trichomonas vaginalis DNA from Papanicolaou-stained smears. Diagn Cytopathol 1998; 19: 437-40.
5.   Costamagna SR, Vaylet S, Prado M, Mezquita L. Trichomonosis: validación de tres pruebas diagnóstico de laboratorio. Parasitol al Día1997; 21: 61-5.
6.   Méndez O, Menghi CI, Famiglietti A. Propuesta de un fijador-colorante para el diagnóstico de Trichomonas vaginalis. Acta Bioquím Clín Latinoam 2000; 34: 425-9.
7.   Costamagna SR, Soria O, Vaylet S, Prat MI, Saint Pierre P, Martínez D. Algunas consideraciones sobre el examen en fresco en el diagnóstico de Trichomonas vaginalis. Parasitol al Día 1997; 21: 66-8.        [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]

Aceptado para su publicación el 6 de julio de 2004