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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. v.38 n.3 La Plata jul./sept. 2004

 

SECCIÓN PERMANENTE LATINOAMERICANA

Eletroforese de proteínas de membrana eritrocitária no diagnóstico de doença hemolítica por defeito de membrana*

Paulo Roberto Favero1, Maria Suely Soares Leonart2, Aguinaldo José do Nascimento3

1. Professor Adjunto do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Estadual de Ponta Grossa - PR.
2. Professora Titular do Departamento de Patologia Médica da Universidade Federal do Paraná.
3. Professor Adjunto do Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Paraná.

*   Trabalho realizado no Laboratório de Citologia e Hematologia do Curso de Farmácia da Universidade Federal do Paraná,como parte de Dissertação de Mestrado do Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Paraná, Curitiba - PR; Apoio: CAPES e UFPR.

Este trabajo ha sido publicado en la Revista Brasilera de Análises Clinicas, 2003; 35(1): 45-7. 

Como consecuencia de la política de integración de la Confederación Latinoamericana de Bioquímica Clínica-COLABIOCLI- en el área científica, el Comité de Redacción de Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana ha concretado la iniciativa creando la Sección Permanente Latinoamericana, con los trabajos más relevantes de las distintas publicaciones de la región. La reimpresión de los mismos ha sido autorizada por el Consejo Editorial de las respectivas publicaciones oficiales.

Resumo

A membrana eritrocitária contém as proteínas do citoesqueleto, e proteínas integrais, imersas na bicamada lipídica, todas importantes para a manutenção da integridade e da forma celular. Neste trabalho, estudou-se 14 pacientes portadores de doença hemolítica, atendidos no Centro de Hematologia e Hemoterapia do Paraná (HEMEPAR) em relação a grupo controle de 20 voluntários saudáveis. Amostras de sangue venoso foram coletadas em citrato-fosfato-dextrose (CPD). Após o isolamento das membranas [Dodge et al., Arch. Biochem. Biophys. 100:199, 1963] e a determinação da concentração de proteínas [Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265, 1951], as proteínas foram submetidas à eletroforese vertical em SDS-Page [Laemmli, Nature 227: 680, 1970]. Os valores obtidos no grupo controle (%; n = 10), foram: espectrinas = 29,67 ± 4,14; anquirinas = 3,97 ± 1,84; banda 3 = 38,70 ± 4,96; banda 4.1 = 6,79 ± 1,60; banda 4,2 = 5,00 ± 1,43; banda 4.5 = 1,89 ± 0,96; banda 4,9 = 1,83 ± 1,22; banda 5 = 6,54 ± 3,13; banda 6,0 = 2,70 ± 1,24; banda 7,0 = 2,36 ± 1,33. Os valores médios para os portadores de esferocitose foram 24,4% para espectrina e 35,8% para banda 3 (teste t; p < 0,05). A observação de esferócitos ou eliptócitos no sangue periférico, associados a um perfil eletroforético com deficiência de espectrina e/ou proteína 3 sugere esferocitose ou eliptocitose hereditária, respectivamente. Portadores assintomáticos de defeitos moleculares de membrana eritrocitária podem ser também detectados através de SDS-Page.

Palavras chave: Proteínas de membrana eritrocitária; Eliptocitose hereditária; Esferocitose hereditária; Morfologia eritrocitária; Doenças hemolíticas.

Summary

Electrophoresis of erythrocyte membrane and hemolytic diseases caused by membrane abnormalities

The erythrocyte membrane contains a net of proteins, forming the cell backbone, and the integral proteins, immerging in the lipid bilayer, both important for the integrity maintenance and for the cellular activity. We studied 14 patient carriers of hemolytic diseases, assisted in the Centro de Hematologia e Hemoterapia do Paraná (HEMEPAR) in relation to control group of 20 healthy volunteers. Samples of venous blood were collected in citrate-phosphate-dextrose (CPD). The membranes were isolated [Dodge et al., Arch. Biochem. Biophys. 100:199, 1963], the protein concentration was determined [Lowry et al., J.Biol.Chem. 193: 265, 1951] and were submitted to the vertical electrophoresis (SDS-Page) [Laemmli, Nature 227: 680, 1970]. The values obtained in the control group (%; n = 10) were: spectrins = 29.67 ± 4.14; ankyrins = 3.97 ± 1.84; band 3 = 38.70 ± 4.96; band 4.1 = 6.79 ± 1.60; band 4.2 = 5.00 ± 1.43; band 4.5 = 1.89 ± 0.96; band 4.9 = 1.83 ± 1.22; band 5 = 6.54 ± 3.13; band 6.0 = 2.70 ± 1.24; band 7.0 = 2.36 ± 1.33. The mean value for the spherocytosis carriers was 24.4% for spectrin and 35.8% for band 3, (t tests; p <.0.05). The observation of blood spherocytes or elliptocytes, associated to an electrophoretic profile with deficiency of spectrin or band 3 suggests spherocytosis or hereditary elliptocytosis, respectively. Assimptomatic carriers of erythrocyte membrane molecular abnormalities can also be detected through SDS-Page.

Key words: Red blood cell membrane proteins; Hereditary elliptocytosis; Hereditary spherocytosis; Red blood cell morphology; Hemolytic diseases.

Introduçao

 Dentre as anormalidades intrínsecas que acometem o eritrócito, os defeitos da membrana eritrocitária mais conhecidos incluem a esferocitose hereditária (HS), a eliptocitose hereditária (HE), a piropoiquilocitose hereditária (HPP) a acantocitose hereditária e a estomatocitose hereditária. O diagnóstico presuntivo de tais condições em geral se baseia em: exame clínico, anamnese e sinais de hemólise no hemograma, além da presença das formas eritrocitárias correspondentes e outras alterações da morfologia eritrocitária. No caso da HS há um aumento da fragilidade osmótica, em especial pela pre sença de esferócitos no sangue periférico. Nenhum destes dados laboratoriais, contudo, é tão específico que permita a confirmação do diagnóstico (Erslev, 1995).
 A membrana eritrocitária contém uma rede de proteínas em unidades hexagonais, que formam o citoesqueleto, e as proteínas integrais imersas na bicamada lipídica, todas de fundamental importância para a manutenção da integridade e da forma celular, e classificadas pela sua mobilidade eletroforética em gel de poliacrilamida (Bennett, 1981; Palek e Lux, 1983).
 Este trabalho teve o objetivo de estudar alterações quali e quantitativas das proteínas da membrana eritrocitária em indivíduos com diagnóstico presuntivo de HS e HE.

Material e Métodos

 Foram selecionados para estudo, através de critérios clínicos e laboratoriais, 14 pacientes com idades entre 3 e 50 anos, atendidos no Centro de Hematologia e Hemoterapia do Paraná (HEMEPAR), com história de doença hemolítica própria e/ou de seus familiares, que apresentavam uma oMzatezu mais das seguintes características: elevados níveis sorológicos de bilirrubina indireta, presença de eritroblastos no sangue periférico, reticulocitose, fragilidade osmótica alterada e anemia O grupo controle foi constituído por 20 voluntários considerados saudáveis, com idades entre 20 e 50 anos.
 As amostras de sangue venoso foram coletadas em Citratofosfato-dextrose (CPD), (Erslev, 1995), e as membranas isoladas segundo (Dodge et al., 1963), como segue: os eritrócitos foram lavados três vezes em NaCl 155mM, a 4 °C. (centrífuga Sorvall RC2B). O sedimento foi diluído a 1:40 em tampão fosfato 5mM contendo fluoreto de fenil metil sulfonil (PMFS) 200mM em etanol, como inibidor de proteases. Os eritrócitos foram lisados por agitação enérgica e centrifugados a 12000 x g a 4 °C durante 10 min, lavandose o estroma várias vezes até se obter sedimento de cor branca opaca. A concentração das proteínas de membrana foi determinada pelo método de Lowry et al. (1951). O sedimento final foi solubilizado com solução de Laemmli (1970) na proporção de 2:1, fracionado em pequenas alíquotas e congelado a 20 °C.
 As membranas eritrocitárias foram submetidas à eletroforese vertical em gel de poliacrilamida dodecil-sulfato sódio (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970). A confecção das placas de gel foi realizada em um molde formado por duas placas de vidro e separadores de acrílico. O molde foi preenchido até 1 cm da borda superior com solução de acrilamida a 12% (gel de corrida) e após a polimerização, completado com acrilamida a 4% (gel de alinhamento), no qual foram moldadas cavidades para aplicação de amostras de 100 mg de proteína. A corrida eletroforética foi de 18 h, em cuba vertical de acrílico (Permatron) contendo tampão Tris Glicina 50mM, pH 8,3, sob tensão de 25 volts e corrente de 15mA (Laurent, 1963; Davis, 1962; Weber, 1975; Sauberman, 1979). As placas de gel foram coradas com Coomassie Blue (Brilliant Blue R Sigma B 0630), 1 g; ácido acético glacial, 200 ml; álcool isopropílico, 300 ml; água bidestilada, 1.300ml durante 1 h em estufa a 56°C, descoradas em ácido acético a 10% (v/v), e conservadas em água destilada e as bandas protéicas, quantificadas por densitometria (Zênite Z-30 Turbo).
 Os resultados obtidos foram comparados aos do grupo controle (teste t, nível de significância de 5%).

Resultados

 A Figura 1 apresenta a eletroforese em gel de poliacrilamida, realizada com as membranas eritrocitárias de indivíduos do grupo controle. Os valores de referência das frações protéicas obtidos foram (%; n = 10): espectrinas = 29,67 ± 4,14; anquirinas = 3,97 ± 1,84; banda 3 = 38,70 ± 4,96; banda 4.1 = 6,79 ± 1,60; banda 4.2 = 5,00 ± 1,43; banda 4.5 = 1,89 ± 0,96; banda 4.9 = 1,83 ± 1,22; banda 5 = 6,54 ± 3,13; banda 6.0 = 2,70 ± 1,24; banda 7.0 = 2,36 ± 1,33. Os valores médios para os portadores de esferocitose foram 24,4% para espectrina e 35,8% para banda 3 (teste t; p < 0,05).

 A Tabela I apresenta as alterações quantitativas, caracterizadas por aumento ou diminuição em relação ao controle, para cada fração protéica da membrana eritrocitária, nos eritrócitos dos pacientes estudados.

Tabela I. SDS-Page de proteínas de membrana de eritrócitos de portadores de esferocitose (HS) e eliptocitose hereditárias (HE). Variações estatísticamente significativas em relação ao grupo controle

 As Figuras 2 e 3 apresentam fotomicrografias eletrônicas de varredura dos eritrócitos de pacientes com diagnósticos presuntivos de HE e de HS, respectivamente.

Discussão

 A eletroforese de proteínas de membrana em gel de poliacrilamida tem sido indicada para o diagnóstico de doenças hemolíticas por defeito de membrana (Laemmli, 1970; Agre et al., 1985; Silveira, 1992).
 As alterações da morfologia eritrocitária observadas foram bastante variáveis. A presença de esferócitos na maioria dos pacientes com deficiência de espectrina e/ ou de proteína 3 sugere uma possível relação com a HS. Diversos autores propõem que a formação dos esferócitos está relacionada com a perda de lipídios e/ou proteínas de membrana, na forma de microvesículas (Rumsby et al., 1977; Shukla et al., 1978; Chasis et al., 1988). Outra hipótese sugerida para a formação de esferócitos afirma que uma deficiência de proteína 3 pode deixar espaços vazios na bicamada lipídica, levando a um desacoplamento das unidades do citoesqueleto protéico, liberando lipídios da membrana em forma de microvesículas (Jarolim et al., 1994). Um terceiro mecanismo estaria relacionado com o enfraquecimento da ligação da proteína 3 com as proteínas do citoesqueleto, com perda dessa proteína e dos lipídios que a rodeiam (Jarolim et al., 1994).
 Em alguns pacientes, observouse esferócitos associados à deficiência em espectrina e/ou banda 3 e de proteína 4.1, responsável pela estabilização do complexo juncional. Uma vez que cada dímero de espectrina se associa a uma molécula de proteína 4.1, a deficiência da primeira poderia acarretar a perda da segunda, aumentando a instabilidade da membrana, com formação de esferócitos (Cohen, 1983). Um dos pacientes apresentou 42% de esferócitos, com apenas 41,5% de proteína 3 em relação ao controle normal. Outro paciente, com 13,6% de esferócitos, apresentou espectrina normal, 91% do normal de proteína 3,86% de proteína 4.1 e 62% do normal de proteína 4.2, com fragilidade osmótica normal.
 Em eliptocitose, quando a eletroforese demonstra valores quantitativos normais, devese considerar a possibilidade de alterações apenas funcionais (Ideguchi et al., 1993).

Conclusões

 A análise do perfil eletroforético das proteínas de membrana eritrocitária em portadores de HS e HE, permite concluir que:
a) a SDSPAGE é útil para o diagnóstico de HS e HE;
b)   esferócitos ou eliptócitos no sangue periférico, associados à deficiência de espectrina e/ou proteína 3, sugere diagnóstico de HS ou HE, respectivamente;
c) deficiência de espectrina se acompanha, em geral, de deficiência de proteína 3, independentemente do diagnóstico mais provável;
d)   devido às várias interações entre as proteínas do citoesqueleto, é possível que a deficiência de uma proteína possa causar a perda de outra proteína;
e) portadores assintomáticos podem ser detectados se apresentarem deficiências de proteínas integrais e/ou do citoesqueleto, associadas a alterações morfológicas de eritrócitos.

ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA

Profa Maria Suely Soares Leonart
Laboratório de Citologia e Hematologia do Curso de Farmácia da Universidade
Federal do Paraná - Curitiba, PR
E-mail: msue@ufpr.br

Referências

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