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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. v.39 n.3 La Plata jun./sept. 2005

 

BIOQUÍMICA CLÍNICA

Apolipoproteína A-I en nefropatías: su relación con el status renal y las microproteínas urinarias*

Leticia Bibiana Madalena1, María Laura Facio1, Pablo Diego Bresciani1, Mariel Emilce Alejandre1, Gabriela Alicia Berg2, Margarita Angerosa2, Marco Antonio Pizzolato2

1. Bioquímicos.
2. Doctor en Bioquímica.

* Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Hospital de Clínicas "José de San Martín", Universidad de Buenos Aires.

Resumen

El objetivo del presente estudio fue identificar la relación entre la presencia de Apolipoproteína A-I en orina y: a) el daño funcional renal tanto en patología predominantemente glomerular así como túbulo-intersticial; y b) los valores de alfa 1-microglobulina y beta 2-microglobulina, como marcadores de compromiso tubular. Se procesaron 97 orinas de 24 h de recolección. Se determinaron proteínas totales (Exton), alfa 1-microglobulina y beta 2-microglobulina (Inmunoturbidimetría, Roche, USA). Se realizó la técnica de SDS-PAGE, el uroproteinograma con tinción argéntica y el inmunobloteo con anticuerpo anti ApoA-I según procedimientos habituales. Se observó una asociación estadísticamente significativa entre la presencia de ApoA-I y los valores de proteinuria mayores a 3 g/L (p < 0,0001) y el perfil de eliminación glomérulo-tubular (p < 0,01). En los pacientes con insuficiencia renal (33) la asociación de ApoA-I con los valores alfa 1-microglobulina y beta 2-microglobulina fue estadísticamente no significativa, mientras que se halló una correlación entre ambas microproteínas y el clearence de creatinina (r = –0,48, p < 0,001 y –0,33, p < 0,05). La pérdida en orina de ApoA-I sería función de la alteración de la selectividad glomerular. Su utilidad como proteína marcadora de hematuria post-renal debe ser analizada en el contexto del perfil proteico evidenciado en el SDS-PAGE.

Palabras clave: apolipoproteína A-I * alfa 1-microglobulina * beta 2-microglobulina * insuficiencia renal * hematuria * proteinuria

Summary

Apolipoprotein A-I in nephropathy[/title]:[subtitle]the relation with renal status and urinary microproteins

The objective of the present study was to identify the relationship between the presence of ApoA-I in urine and: a) the renal functional in damage predominantly glomerular as well as in tubulointersticial pathology b) the alpha 1-microglobulin and beta 2-microglobulin levels as markers of tubular dysfunction. Twenty-four hour collection urine was processed (97). Total protein (Exton), alpha 1-microglobulin and beta 2-microglobulin (Immunoturbidimetry, Roche, USA) quantitation were performed. SDS-PAGE, electrophoresis on cellulose acetate with silver stain, and immunobloting were performed according to habitual procedures. A statistically significant association between the presence of ApoA-I and proteinuria values greater than 3g/L (p < 0.0001) and a glomerulo-tubular profile (p < 0.01) was observed. In patients with renal failure (33), the association between the presence of ApoA-I and alfa 1-microglobulin and beta 2-microglobulin was statistically non-significant, while a correlation was found between both low molecular weight proteins and the clearence of creatinine (r = –0.48, p < 0.001 y –0.33, p < 0.05 respectively). Then, the ApoA-I loss could be a function of the glomerular selectivity. Its utility as a protein marker of post-renal hematuria and proteinuria must be analyzed in the context of the protein profile in the SDS-PAGE.

Key words: apolipoprotein A-I * alpha 1-microglobulin * beta 2-microglobulin * renal failure * haematuria * proteinuria

INTRODUCCIÓN

La Apolipoproteína A-I (ApoA-I), principal constituyente proteico de las lipoproteínas de alta densidad (HDL), es una microproteína de 28 KDa, característica que permitiría su filtración glomerular y el subsecuente catabolismo a nivel tubular como ocurre con el resto de las proteínas de bajo peso molecular. Su determinación ha sido propuesta recientemente para mejorar la exactitud en el diagnóstico de hematuria post-renal en orinas con niveles de proteínas totales mayores a 0,3 g/L. Para este tipo de proteinuria, se ha sugerido la existencia de un perfil electroforético en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) caracterizado por la presencia de albúmina, transferrina, ApoA-I y proteínas de alto PM (> 150 KDa) (1).
Se ha postulado que es baja la probabilidad de observar a la ApoA-I disociada de lípidos (fracción libre) en circulación; de ser así, podría atravesar sin dificultad la barrera de filtración glomerular (2). La filtración de holo-partículas de HDL en el riñón normal es también incierta. En teoría, las HDL3 pequeñas con un diámetro de 7-8 nm deberían ser capaces de pasar la barrera de filtración glomerular, que es permeable a sustancias de PM entre 80-100000 Da y de 8 nm de diámetro. El túbulo proximal de la corteza renal es el principal sitio para la reabsorción de ApoA-I y de muchas otras proteínas que filtran por el glomérulo, mediante los receptores cubilina y megalina altamente expresados en la zona apical de las células tubulares. Estos receptores unen distintos grupos de ligandos y aunque estructuralmente son muy diferentes estarían relacionados funcionalmente ya que la interacción megalina-cubilina parece ser importante en la endocitosis y reciclado de cubilina. La filtración renal y la subsecuente captación de ApoA-I por intermedio de cubilina y megalina es un factor potencial en el mantenimiento del equilibrio entre la producción hepática e intestinal de ApoA-I y su catabolismo. El rol fisiológico que cumplirían en este último se evidencia por el incremento en la excreción urinaria de ApoA-I, en casos de deficiencia funcional de cubilina (3).
Algunos autores han planteado la hipótesis de que el metabolismo de la molécula de ApoA-I ocurre durante la filtración glomerular de la fracción libre, puesto que la HDL es generalmente retenida en esta estructura. Es por ello que refieren que la ApoA-I está generalmente ausente en el perfil de SDS-PAGE de proteinurias renales, aunque es visible en los inmunobloteos de hematurias renales; de allí que, sólo con reservas, puede ser considerado un marcador de hematuria post-renal y proteinuria (4). Sin embargo, Eeichl y Beetham demostraron que era improbable que ocurriera en humanos un metabolismo significativo de ApoA-I a través de los mecanismos antes mencionados, determinando su concentración en orina en situaciones en las cuales la reabsorción tubular de otra proteína metabolizada de esta manera, la retinol binding protein (RBP), estaba comprometida (5).
Se utilizó la separación de proteínas mediante SDS-PAGE para caracterizar los perfiles urinarios, por la posibilidad de brindar una información muy útil sobre el problema renal subyacente que ofrece esta técnica (6).
El objetivo del presente estudio fue identificar la relación entre la presencia de ApoA-I en orina y: a) el daño funcional renal tanto en patología predominantemente glomerular así como túbulo-intersticial; y b) los valores de alfa 1-microglobulina (A1m) y beta 2-microglobulina (B2m), como marcadores de compromiso tubular.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se estudió la orina de 24 h de recolección de 97 pacientes internados con pedido de clearance de creatinina. Se registró la evaluación clínica de cada paciente que incluía el diagnóstico presuntivo, la medicación indicada y se agrupó a los pacientes según presentaran enfermedades, predominantemente glomerulares o túbulo-intersticiales. Las muestras se almacenaron a –70 ºC (7). Se determinaron proteínas totales por el método de Exton (ácido sulfosalicílico 3%), alfa 1-microglobulina y beta 2-microglobulina (Inmunoturbidimetría, Tina Quant, Roche, USA). Se llevó a cabo la técnica de SDS-PAGE, al 12%, de acuerdo a procedimientos reportados en la literatura (8). Brevemente, se realizó la electroforesis en buffer Tris-glicina pH ~ 8,3 a 200 V durante 40 min y se sembraron 10 µL de orina diluida en una relación 1/1 en buffer muestra. Se utilizó el SDS-PAGE para identificar los perfiles: glomerulares (G), con aparición de bandas en PM 160, 90, 70 y 45 KDa; tubulares (T) con bandas en PM 45, 30, 25, 20 y 12 KDa; y mixtos glomérulo-tubulares (G/T), cuando se observa la combinación de ambos. La electroforesis en acetato de celulosa gelatinizado (Biosystem, Spain) con posterior tinción argéntica se desarrolló de acuerdo a los procedimientos previamente descriptos (9). El inmunobloteo se llevó a cabo según las técnicas habituales y se reveló con antisuero anti ApoA-I (Kallestad, USA) como primer anticuerpo y posterior revelado con antisuero anti inmunoglobulina de cabra marcado con peroxidasa de rábano (DAKO, Denmark) como segundo anticuerpo.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos fueron transformados a logaritmos. Se realizaron los siguientes tests de análisis:
– Coeficiente de correlación de Pearson entre los valores de las distintas microproteínas urinarias (MU).
test de independencia de variables: test de la G, test exacto de Fisher. GraphPad. InStat.

RESULTADOS

Clasificados de acuerdo a su perfil proteico en SDS-PAGE, el 52,6% de los pacientes presentó un cuadro uroproteico glomérulo-tubular, el 25,7% un cuadro tubular y el 14,4% un cuadro fisiológico; los perfiles de "Tipo Mielomatoso" Bence Jones positivo y glomerular correspondieron a los menores porcentajes (3,0 y 4,1%, respectivamente). El valor de proteinuria promedio fue de 3,5 g/L (entre un valor de proteinuria negativo y 42,1 g/L), con una mediana de 0,68 g/L. Un 34% presentó valores de proteinuria por encima de 3,0 g/L (33 pacientes).
Mediante el test de independencia de variables se demostró una asociación estadísticamente significativa entre los valores de proteinuria elevados (proteinurias mayores de 3 g/L) y la presencia de un perfil proteico urinario correspondiente a una lesión mixta glomérulo-tubular (p < 0,0001) (Fig.1).


Figura 1. Análisis de Distribución de Frecuencias para la presencia de proteinuria y el perfil en SDS-PAGE (PN-: proteinuria < 3 g/L. PN+: proteinuria > 3 g/L. G/T perfil glomérulo-tubular).

Los pacientes con proteinuria menor a 3 g/L presentaron en su mayoría perfiles proteicos de eliminación de tipo tubular (37,5%), fisiológico (25,0%) o glomérulo-tubular (22,5 %).
De los 97 pacientes analizados, 26 fueron positivos para la presencia de ApoA-I en orina (26,8%), 17 de los cuales presentaban proteinurias mayores a 3 g/L (65,4%). El estudio estadístico mostró una asociación significativa entre la presencia de ApoA-I y los valores de proteinuria mayores a 3 g/L (p < 0,0001) (Fig. 2A) y el perfil de eliminación glomérulo-tubular (p < 0,01) (Fig. 2B).


Figura 2A. Análisis de Distribución de Frecuencias para la presencia de ApoA-I y una proteinuria mayor a 3 g/L (PN-: proteinuria < 3 g/L. PN+: proteinuria > 3 g/L. ApoA-I+: presencia de lipoproteína ApoA-I identificada por inmunobloteo. ApoA-I-: ausencia de lipoproteína ApoA-I identificada por inmunobloteo).


Figura 2B. Análisis de Distribución de Frecuencias para la presencia de ApoA-I y el perfil proteico urinario en SDS-PAGE.
ApoA-I: presencia de lipoproteína ApoA-I identificada por inmunobloteo; ApoA-I-: ausencia de lipoproteína ApoA-I identificada por inmunobloteo.
G/T: perfil glomérulo /tubular. T: perfil tubular; n = 76.

Las características clínicas de los pacientes con presencia de ApoA-I se resumen en la Tabla I. La Figura 3 muestra los distintos perfiles de eliminación en SDS-PAGE con tinción argéntica y el inmunobloteo para ApoA-I de las mismas muestras.
Los pacientes con insuficiencia renal (33) se estudiaron mediante la cuantificación de microproteínas urinarias (MU), el valor medio de A1m fue de 48,37 mg/L con una mediana de 37,5 mg/L (rango entre 4,0 y 191,0), el valor medio de B2m fue de 4,39 mg/L, con una mediana de 1,81 mg/L (rango entre 0,03 y 19,22) y el valor medio del clearence de creatinina fue de 29,4 mL/min/1,73 m2 con una mediana de 27,0 mL/min/ 1,73 m2 (rango entre 4,2 y 60). La proteinuria osciló entre un valor negativo y 7,5 g/L, con una media de 1,35 g/L y una mediana de 0,48 g/L. Se halló una correlación estadísticamente significativa entre los valores A1m, B2m y el clearence de creatinina (r = –0,48, p < 0,001 y –0,33, p < 0,05, respectivamente) y entre ambas microproteínas y los valores de proteinuria hallados (r = 0,56, p < 0,0001 y 0,32, p < 0,05, respectivamente). El 68% presentó valores de A1m por encima del límite superior normal (23 pacientes), tres pacientes presentaron valores de proteinuria en rango nefrótico, en tanto que el único paciente que resultó positivo en la identificación inmunológica para la presencia de ApoA-I, presentó una proteinuria de 0,75 g/L, un perfil de tipo glomérulo-tubular, un clearence de 35 mL/min/1,73 m2 y un cuadro de infecciones urinarias a repetición. El test exacto de Fisher demostró que la asociación entre la presencia de ApoA-I y ambas microproteínas fue estadísticamente no significativa.

Tabla I. Pacientes positivos para ApoA-I.


Figura 3. SDS-PAGE e Inmunobloteo de ApoA-I.
PM: control de Peso Molecular; 1: perfil glomérulo-tubular; 2: perfil fisiológico; 3: perfil tubular; 4: control sérico de ApoA-I (153 mg/dL). (1',4': presencia de ApoA-I).

DISCUSIÓN

En el presente trabajo se encontró un alto nivel de asociación entre la presencia de ApoA-I y los valores de proteinuria superiores a 3 g/L. Cuando se analizó el perfil urinario en SDS-PAGE se observó, con significancia estadística, que el cuadro glomérulo-tubular se asoció con esos valores de proteinuria. Dentro del grupo que presentó clearence de creatinina menores a 60 mL/min/ 1,73 m2, se evidenció el compromiso túbulo-intersticial expresado a través de la determinación de las microproteínas urinarias que acompañaron la caída de la función renal; sin embargo, sólo un paciente presentó ApoA-I en orina, con un cuadro de infecciones a repetición. Los resultados estarían de acuerdo con los reportados por Poliaakov y col., quienes encontraron aumentada la cantidad de ApoA-I urinaria en pacientes con glomérulonefritis crónica (10). En los casos en los que se encontró ApoA-I en la orina se debió a un previo pasaje de la HDL, es decir, no filtró libremente; se detectó su presencia principalmente en algunas orinas diagnosticadas como predominantemente mixtas (G/T); esto implica que su utilidad como proteína marcadora post-renal debe ser analizada en el contexto del perfil proteico evidenciado en el SDS-PAGE. También Gomo y col., mediante el uso de ultracentrifugación y posterior inmunotinción, confirmaron la presencia de HDL en orina de sujetos normales hallando niveles de ApoA-I significativamente altos en pacientes con proteinuria glomerular, con un alto nivel de asociación entre el índice de selectividad y la HDL urinaria y también entre la ApoA-I y la proteína total perdida (11). Se postula entonces que la pérdida en orina de ApoA-I sería función de la alteración de la selectividad glomerular puesto que, en las proteinurias tubulares con cleareances de creatinina bajos y niveles de MU elevados, no se detectó la presencia de dicha proteína. No se detectó tampoco asociación con la B2m ni con la A1m, proteína ampliamente utilizada como marcadora de lesión tubular (12). De acuerdo con Moestrup y col., probablemente la regulación del catabolismo renal sería secundaria a factores como la disminución de tamaño de la HDL, porque el tamaño pequeño no sólo favorece la filtración renal de HDL sino también la disociación de la ApoA-I de dicha partícula que filtra fácilmente (3). Se postula que los rangos en que se encuentra la ApoA-I en la orina de los pacientes con síndrome nefrótico indican un aumento tanto en la producción de ApoA-I como en la pérdida urinaria de HDL de bajo PM. Su detección aislada llevaría a una interpretación errónea del mecanismo que origina la proteinuria.

Agradecimientos

El presente trabajo fue realizado con el Subsidio de la UBA (B008).

Correspondencia

Dra. LETICIA B. MADALENA
Departamento de Bioquímica Clínica
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Junín 956
1113 CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES, Argentina

Referencias bibliográficas

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Aceptado para su publicación el 15 de julio de 2005