SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.40 número1La respuesta inmune innata entre los factores ambientales y el aborto.: Modelo de tolerancia al lipopolisacárido durante la gestaciónGuías del laboratorio para screening, diagnóstico y monitoreo de la injuria hepática índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Servicios Personalizados

Articulo

Indicadores

  • No hay articulos citadosCitado por SciELO

Links relacionados

  • En proceso de indezaciónCitado por Google
  • No hay articulos similaresSimilares en SciELO
  • En proceso de indezaciónSimilares en Google

Bookmark


Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. v.40 n.1 La Plata ene./mar. 2006

 

ENDOCRINOLOGÍA

Screening de macroprolactina con polietilenglicol: límite de corte*

Bibiana Raquel Fabre1, Laura Estela Boero1, Jenny Argibay1, Haydée Benencia2, Alberto Del Río3

1.1. Bioquímica. Especialista en Bioquímica Clínica - Área Endocrinología.
2. Bioquímica. Ex Profesora de Análisis Clínicos II - Área Endocrinología. Facultad de Farmacia y Bioquímica. U.B.A.
3. Dr. en Bioquímica. Profesor de Análisis Clínicos II - Área Endocrinología. Facultad de Farmacia y Bioquímica. U.B.A.

* Departamento de Bioquímica Clínica. Sector Endocrinología. Facultad de Farmacia y Bioquímica (U.B.A.) Hospital de Clínicas "José de San Martín". Córdoba 2250 - 1er. Piso. 2211 Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina.

Resumen

La prolactina (PRL), de acuerdo a su tamaño molecular, se puede encontrar en circulación como un monómero de 23 kDa (little PRL), un dímero de 45 kDa (big PRL) o como macroprolactina ( big-big PRL o MPRL). La MPRL, en la mayoría de los casos, está formada por una molécula monomérica y una inmunoglobulina G (IgG). La cromatografía por filtración en gel se considera el método patrón para determinar las diferentes formas moleculares. La precipitación con polietilenglicol (PEG) al 25% resulta un método alternativo para realizar el screening de MPRL. El objetivo de este trabajo fue establecer un valor de corte para determinar la presencia de MPRL utilizando PEG y el sistema IRMA DPC para dosar PRL. Se analizaron 172 sueros: 20 muestras con niveles de PRL menores a 18 ng/mL y 152 muestras con PRL mayores a 30 ng/mL. En los sueros con PRL menor a 18 ng/mL el porcentaje de recuperación de prolactina monomérica post PEG fue de 106 ± 11% (X ± 2 DE) y menor al 50% en el 23% de las muestras con PRL mayor a 30 ng/mL. Se cromatografiaron 6 muestras con porcentajes de recuperación de prolactina monomérica post PEG menor al 50% y 3 muestras con porcentaje de recuperación mayor al 50%. Recuperaciones de PRL monomérica menores al 50%, correspondieron a perfiles cromatográficos con incremento de la MPRL. Los resultados obtenidos permitieron establecer un valor de corte del 50% al precipitar con PEG. Sin embargo, por tratarse de un método inespecífico, recuperaciones de PRL monomérica entre 40% y 60% deberían confirmarse por cromatografía.

Palabras clave: macroprolactina * screening * heterogeneidad molecular

Summary

Screening of macroprolactin with polyethylene glycol: cut-off

The prolactin hormone (PRL) is a heterogeneous protein molecule found principally in three forms according to its size: monomeric (little PRL-23 kDa), dimeric form (big PRL-50 kDa) and macroprolactin (big-big PRL@ 150 - 170 kDa). The macroprolactin is formed, generally, by the association between the monomeric molecule and IgG immunoglobulins. The gel filtration chromatography (GFC) is considered the gold standard method for studying this macroprotein, but it is impractical and expensive. However, screening with precipitation with PEG 6000 is another method that is much more simple and inexpensive, but which needs to be previously validated by GFC. The objective of the authors was to establish a cut off to do the macroprolactin screening, using the precipitation with PEG and the DPC IRMA system. Twenty samples with serum levels of prolactin less than 18 ng/mL and 152 samples with serum prolactin levels greater than 30 ng/mL were analyzed. In patients with serum levels of PRL less than 18 ng/mL, the percentage of recovery of little PRL was 106 ± 11% (X ± 2 SD) and values lower than 50% were found in 23% of the samples with serum Prl greater than 30 ng/mL. In view of the percentage of recovery of PRL post precipitation with PEG, 6 samples with values of PRL lower than 50% of recovery post PEG and 3 greater than 50% were selected and chromatographed. In this work, a cut-off of 50% for the PEG method was found and GFC for all the samples between 40-60% of recovery is recommended.

Key words: macroprolactin * screening * molecular heterogeneity

INTRODUCCIÓN

La prolactina (PRL) es una hormona polipeptidica monocatenaria de 199 aminoácidos que presenta un peso molecular de 23 kDa. Es sintetizada y secretada principalmente por los lactotropos de la adenohipófisis (1). Originalmente se la conoció por su capacidad de estimular el desarrollo mamario y la lactación. Actualmente se le atribuyen más de 85 funciones biológicas en diversas especies de vertebrados (2).
El gen que codifica para PRL se encuentra en el cromosoma 6.
Presenta heterogeneidad molecular debido a modificaciones pretraduccionales originadas por splicing alternativos y postraduccionales provocadas por diferentes grados de glicosilación, dimerización, sulfatación, etc. (3).
En circulación se encuentra como prolactina nativa o little prolactina o PRL pequeña (23 kDa), con alta capacidad de unión a su receptor y bioactividad, PRL glicosilada (G1-PRL y G2-PRL), big PRL o PRL grande (50 kDa) compuesta por dímeros de la nativa (4)(5) y big-big PRL o MPRL (150 - 170 kDa) de escasa o nula bioactividad. Para la mayoría de los investigadores la MPRL es principalmente un complejo de PRL nativa con inmunoglobulina G pudiendo también ser agregados de la PRL de 23 kDa. Se desconocen aún los mecanismos que llevan a su producción (6).
Su presencia en circulación lleva a un cuadro bioquímico de hiperprolactinemia aparente, sin sintomatología clínica, debido a su menor actividad biológica. Puede atribuirse su baja bioactividad a la formación de un complejo Ag-Ac de alto peso molecular que no atravesaría los capilares sanguíneos impidiendo la unión de la hormona a su receptor (7). Sin embargo, otros autores hacen referencia a macroprolactinemias en pacientes con signos clínicos, contradiciendo la teoría de una actividad disminuida (8).
La cromatografía por filtración en geles se considera el método patrón para el estudio bioquímico de MPRL. Tiene la desventaja de ser una técnica poco práctica en el laboratorio clínico, lo que llevó a desarrollar un método de screening sencillo y económico, que se basa en la precipitación de la macromolécula con polietilenglicol (PEG) 6.000 al 25% P/V (9-11).
Determinar un valor de corte que permita discriminar con adecuada especificidad y sensibilidad la presencia o ausencia de MPRL es un problema aún no resuelto. Utilizando este método de screening Vieira J y col. (12) descartaron la presencia de macroprolactina con un valor de recuperación de PRL post precipitación con PEG mayor al 65%. Cattaneo F y col. (13) proponen un valor de corte de 50%, similar al propuesto por Fahie-Wilson MN y Olukoga AO (14)(15). Por otra parte, Leanos-Miranda A y col. (16) sugieren un valor de 58,4% y cromatografiar aquellas muestras con porcentaje de recuperación entre 50-58%. Leslie H y col. (17) establecen un predominio de MPRL cuando el valor es menor del 40%.
El objetivo de este trabajo fue establecer un valor de corte para determinar la presencia de MPRL, utilizando PEG como reactivo precipitante y el sistema IRMA DPC para dosar PRL.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras: Las muestras de sangre analizadas procedían de pacientes que concurrieron, por diferentes causas, al laboratorio de Endocrinología del Departamento de Bioquímica Clínica de la Facultad de Farmacia y Bioquímica, Hospital de Clínicas "José de San Martín" (UBA). Las mismas fueron obtenidas entre las 8 y 9 h y el suero fue almacenado a –20 ºC hasta su procesamiento.
Se analizó el suero de 172 pacientes.
1) 20 muestras controles con niveles de PRL menores de 18 ng/mL que correspondían a 12 mujeres (edad: 22 - 68 años) y 8 varones (edad: 21 - 70 años) libres de medicación.
2) 152 muestras con PRL sérica mayor de 30 ng/mL: 136 mujeres (edad 17 - 58 años) y 16 varones (edad 34 - 67 años).
Determinación de PRL: Para el dosaje de PRL se utilizó un inmunoensayo no competitivo, COAT-A-COUNT-Prolactin IRMA, DPC (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles. CA), con un límite de detección de 0,1 ng/mL y un coeficiente de variación (CV) intra e interensayo de 2,7% y 6,3%, respectivamente, para una dosis de 3,7 ng/mL.
Cromatografía: Se utilizó una columna de Sephadex G100 de 110 x 2 cm, equilibrada a temperatura ambiente con buffer fosfato salino 0,05 mol/L, de pH 7,5 con el agregado de azida sódica. El mismo buffer fue usado para la elución de la columna, la cual fue calibrada con Blue Dextran (PM: 2.000.000), albúmina humana (PM: 65.000) y Rojo Fenol (PM: 376,4). El volumen muerto (void volume) se determinó con Blue Dextran (51 mL). Se sembraron 1,5 mL de cada muestra a cromatografiar. Se recogieron alícuotas de 1,5 mL con un colector automático de fracciones (LKB. Bromma.2112 Redirac-Fraction Collector), a un flujo de 10-12 mL/h. Todas las fracciones fueron conservadas a –20 ºC hasta la realización del dosaje de PRL. Se calculó el área bajo la curva, para los diferentes picos obtenidos del perfil cromatográfico, con el programa GraphPad Prism.
Precipitación con polietilenglicol: A 0,3 mL de suero se le agregó igual volumen de una solución de PEG 6.000 (Carbowac. Stanton) en una concentración de 250 g/L, a temperatura ambiente. Se homogeneizó la mezcla durante un minuto en vortex y luego se centrifugó 30 min a 3.000 rpm. La PRL fue medida en el sobrenadante y se calculó el porcentaje de recuperación empleando la siguiente fórmula: (PRL post PEG/ PRL pre PEG) x 100. Los CV intra e interensayo para una dosis de 20 ng/mL fueron 3,1% y 5,4% respectivamente.
Análisis estadístico: Se aplicaron las siguientes pruebas estadísticas: correlación de Pearson y método de concordancia de Bland y Altman (18).

RESULTADOS

Precipitación con PEG: En los 20 sujetos con PRL menor de 18 ng/mL el porcentaje de recuperación de PRL luego de la precipitación con PEG se encontraba entre 95-117%.
Un porcentaje de recuperación menor al 50% se encontró en un 23% de las muestras que presentaban valores de PRL mayores de 30 ng/mL (n = 152).
Cromatografía en Sephadex G100: Teniendo en cuenta el porcentaje de recuperación de PRL postprecipitación con PEG, se seleccionaron y cromatografiaron 9 muestras.
La frecuencia de MPRL en la población estudiada fue de 23%.
En las Figuras 1-3 se puede observar los perfiles cromatográficos correspondientes a muestras que presentaron diferentes recuperaciones de PRL post PEG, hallándose una correlación estadísticamente significativa entre ambos tipos de recuperación.
La Figura 4 muestra la correlación entre los porcentajes de recuperación de PRL post precipitación con PEG y de MPRL obtenidos por cromatografía en Sephadex G-100.
El valor del coeficiente de Pearson (r) cuando se comparó PEG vs cromatografía fue de r = 0,9368 y el BIAS (análisis de concordancia de Bland y Altman) cuando se comparó cromatografía vs. precipitación con PEG fue de 12,4%.
En la Figura 5 se puede observar el análisis de concordancia de Bland y Altman (precipitación con PEG vs. cromatografía)


Figura 1. Perfil cromatográfico correspondiente al suero de un paciente que presentó una recuperación de PRL post precipitación con PEG de 105%. El porcentaje de formas monoméricas por cromatografía fue de 73%.


Figura 2. Perfil cromatográfico correspondiente al suero de un paciente que presentó una recuperación de PRL post precipitación con PEG de 19%. El porcentaje de formas monoméricas por cromatografía fue de 12%.


Figura 3. Perfil cromatográfico correspondiente al suero de un paciente que presentó una recuperación de PRL post precipitación con PEG de 4%. El porcentaje de formas monoméricas por cromatografía fue de 3%.


Figura 4. Correlación entre porcentaje de recuperación de PRL post precipitación con PEG y macroprolactina determinada por cromatografía en Sephadex G100.


Figura 5. Análisis de Concordancia de Bland y Altman. Precipitación con PEG vs. cromatografía en Sephadex G100.
*% MONO = Porcentaje de PRL monomérica por cromatografía.
*% PEG = Porcentaje de recuperación de PRL monomérica post precipitación con PEG.

DISCUSIÓN

En el presente estudio, los porcentajes de MPRL hallados al realizar la precipitación con PEG correlacionaron con los encontrados en el perfil cromatográfico. Los porcentajes de recuperación bajos de little PRL se corresponden con perfiles en los cuales se observa un incremento de la big-big PRL. Los resultados obtenidos permitieron establecer un valor de corte del 50% para el método de precipitación con PEG.
Estudios previos han demostrado que recuperaciones menores al 40% serían indicativas de presencia de MPRL (14)(15)(19).
Sin embargo, considerando que se trata de un método inespecífico y en base a los resultados encontrados, frente a recuperaciones entre 40% y 60%, se sugiere confirmar la presencia de MPRL realizando una cromatografía en gel.
Vieira J y col. (12) consideran una zona indeterminada de porcentajes de recuperación, entre 30% y 65%, que debe ser confirmada por el método patrón para convalidar o refutar la presencia de MPRL. En otros estudios se considera una zona de incertidumbre entre 40% y 50% de recuperación (17).
La frecuencia de un 23% de macroprolactina en las muestras hiperprolactinémicas estudiadas, confirma el hecho que no es tan poco usual encontrar la MPRL. Bjoro T y col. (20) reportaron una prevalencia semejante en una serie de 605 pacientes mientras que Fahie-Wilson MN y col. (14) demostraron una similar incidencia en un estudio de 69 muestras. Vieira J y col. (12) encontraron una prevalencia de MPRL del 36% en 1.279 muestras, mientras que Olukoga AO y col. (15), una incidencia de 15% en 188 pacientes.
En resumen, el uso de la precipitación con PEG permite contar en el laboratorio clínico, con un método práctico y económico para realizar el screening de MPRL. Utilizando esta técnica el 23% de las muestras presentaron predominio de MPRL. La detección de esta forma molecular de PRL, considerada biológicamente inactiva, sería útil en el manejo del paciente hiperprolactinémico sin sintomatología, evitando posiblemente, procedimientos invasivos y/o tratamientos innecesarios.
Cabe señalar que los resultados presentados en este trabajo son preliminares ya que las cromatografías solamente se realizaron en nueve muestras con distintos porcentajes de recuperación de PRL monomérica pos precipitación con PEG.

Agradecimiento

Trabajo realizado con fondos del Proyecto UBACyT B/53.

Correspondencia

PROF. DR. ALBERTO G. DEL RIO
Departamento de Bioquímica Clínica
Hospital de Clínicas "José de San Martín"
Córdoba 2250, 1° Piso
2211 CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES. Argentina

Referencias bibliográficas

1. Sinha YN. Structural variants of prolactin: ocurrence and physiological significance. Endocr Rev 1995; 16: 354-9.
2. Bole-Feysot C, Goffin V, Edery M, Binart N, Kelly P. Prolactin (PRL) and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout mice. Endocr Rev 1998; 19 (3): 225-68.
3. Suh HK, Frantz AG. Size heterogeneity of human prolactin in plasma and pituitary extracts. J Clin Endocrinol Metab 1974; 39: 928-35.
4. Garcia M, Diez H, Ciriza, Delgado G, Orejas G, Fernandez E, et al. Macroprolactina como causa de hiperprolactinemia. Método de detección y caracterización clínica de la entidad en 39 pacientes. Rev Clin Esp 2003; 203 (10): 459-64.
5. Markoff E, Lee D. Glycosilated prolactin is a mayor circulating variant in human serum. J Clin Endocrinol Metab 1987; 65: 1102-6.
6. Guyda HJ. Heterogeneity of human growth hormone and prolactin secreted in vitro: immunoassay and radioreceptor assay correlations. J Clin Endocrinol Metab 1975; 41: 953-67.
7. Malarkey WB, Jackson R, Wortsman J. Long-term assessment of patients with macroprolactinemia. Fertil Steril 1988; 50: 413-8.
8. Leite V, Cosby H, Sobrinho L, Fresnoza M, Santos M, Friesen H. Characterization of big, big prolactin in patients with hyperprolactinaemia. Clin Endocrinol (Oxf) 1992; 37: 365-72.
9. Kiefer K, Malarkey W. Site heterogenity of human prolactin in CFS serum. Experimental condition that alter gel filtration patterns. J Clin Endocrinol Metabol 1978; 46: 119-24.
10. Jordan R, Kendall J. Dissociation of plasma and CSF prolactin heterogeneity. Acta Endocrinol (Copenh) 1978; 89: 38-47.
11. Amadori P, Dilberis C, Marcolla A, Pinamonti M, Menapace P, Dal Bosco F. Macroprolactinemia: predictability on clinical basis and detection by PEG precipitation with two different immunometric methods. J Endocrin Invest 2003; 26 (2): 448-56.
12. Vieira J, Tachibana T, Obara L, Maciel R. Extensive experience and validation of polyethylene glycol precipitation as a screening method for macroprolactinemia. Clin Chem 1998; 44: 1758-9.
13. Cattaneo F, Kappler D, Muller B. Macroprolactinaemia, the major unknown in the differential diagnosis of hyperprolactinaemia. Swis Med Wkly 2001; 131: 122-6.
14. Fahie-Wilson MN. Polyethylene glycol precipitation as a screening method for macroprolactinemia (letter). Clin Chem 1999; 45 (3): 436-7.
15. Olukoga AO, Kane JW. Macroprolactinaemia: validation and application of the polyethylene glycol precipitation test and clinical characterization of the condition. Clin Endocrinol 1999; 51 (1): 119-26.
16. Leanos-Miranda A, Pascoe-Lira D, Chavez-Rueda K, Blanco Favela F. Detection of macroprolactinemia with the polyethylenglycol precipitation test in systemic lupus erythematosus patients with hyperprolactinemia. Lupus 2001; 10 (5): 340-5.
17. Leslie H, Courtney CH, Bell PM, Hadden DR, Mc Cance DR, Ellis PK, et al. Laboratory and clinical experience in 55 patients with macroprolactinaemia identified by a simple polyethylene glycol precipitation method. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86 (6): 2743-6.
18. Bland JM, Altman DG. Measuring agreement in method comparison studies. Statist Meth Med Res 1999; 8: 135-60.
19. Hattori N, Ishihara T, Ikekubo I, Moridera K, Hino M, Kurahachi H. Autoantibody to human prolactin in patients with idiopathic hyperprolactinemia. J Clin Endocrinol Metab 1992; 75 (5): 1226-9.
20. Bjoro T, Morkrid L, Wergeland R, Turter A, Kvistborg A, Sand T, et al. Frequency of hyperprolactinaemia due to large molecular weight prolactin (150-170 kD PRL) Scand J Clin Lab Invest 1995; 55 (2): 139-47.
        [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]

Aceptado para su publicación el 27 de diciembre de 2005