IRAM

Determinación de cotinina y exposición a tabaco

Cotinine detection and tobacco smoke exposure

Marta Noemí Vacchino^1*,**, Susana María Velurtas^2*, Guillermo Pablo Salinas^3***, Héctor Hugo Garcialoredo^4****

^1. Doctora en Ciencias Químicas. Master en Epidemiología.
^2. Licenciada en Bioquímica.
^3. Bioquímico.
^4. Técnico Químico.

* Departamento de Química, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata.
** Departamento de Investigación, Instituto Nacional de Epidemiología "Dr. Juan H. Jara", Mar del Plata, Argentina.
*** Laboratorio BAS, Mar del Plata.
**** Instituto Nacional de Epidemiología "Dr. Juan H. Jara", Mar del Plata, Argentina.

Resumen

La exposición a tabaco es una de las causas prevenibles de morbilidad y mortalidad prematura más importante. Se describe un método simple y rápido de detección de cotinina (principal metabolito de nicotina) en orina humana. Se utilizó cromatografía gas-líquido (CGL) con un detector de ionización de llama (FID). Se realizó una extracción líquido-líquido con cloroformo en medio alcalino; el extracto fue secado a 37 °C y redisuelto en 100 µL de solución alcohólica con estándar interno piridina. Se analizó la orina de personas que declararon ser fumadoras y no fumadoras. Mediante la construcción de dos curvas de calibración se cubrió un rango de linealidad de 3 a 5.000 ng/mL. Los fumadores presentaron una mediana y cuartiles (Q) de concentración de cotinina: 255,4 ng/mL, 15,9 ng/mL (Q1) - 1.050,2 ng/mL (Q3), respectivamente, y los no fumadores 15,8 ng/mL, 4,1 ng/mL (Q1) - 38,4 ng/mL (Q3). Wilcoxon sumrank: z = 4,865 p < 0,01. La concentración de cotinina se incrementó con el número de cigarrillos fumados (rho de Spearman = 0,5672 p < 0,001. El límite de detección fue 3,1 ng/mL y permitió la diferenciación entre los no fumadores, fumadores pasivos y activos usando el valor de corte de 10-15 ng/mL de cotinina en orina, frecuentemente utilizado en los estudios epidemiológicos.

Palabras clave: cotinina * exposición al tabaco ambiental * fumador pasivo * estudios epidemiológicos

Summary

Tobacco is one of the major preventable causes of morbidity and premature mortality in the world. A simple, rapid method for determination of cotinine, major metabolite of nicotine in urine, is described. The assay involves a fast liquid-liquid extraction with chloroform as a solvent in alkaline environment. The extract was dried at 37 °C and the residue was dissolved in 100 µL of standard internal of pyridine in methanol solution, and an aliquot was analyzed by gas-liquid chromatograph equipped with a flame –ionization detector. This technique was performed to test urine of a sample of smokers and non-smokers who were previously asked about their smoking habit. The limit of detection was 3.1 ng/mL, and using two calibration curves, a linearity range from 3 a 5.000 ng/mL was covered.
The median and quartiles (Q) of cotinine in smokers were 255.4 ng/mL, 15.9 ng/mL (Q1) -1050.2 ng/mL (Q3) ng/mL and in non-smokers 15.8 ng/mL, 4.1 ng/mL (Q1) - 38.4 ng/mL (Q3). Wilcoxon sumrank: z = 4.865 p < 0.01. There was a relationship between cotinine concentration in urine and number of smoked cigarettes. Spearman's rho = 0.5672 (p < 0.001). This technique could identify smokers, second hand smokers and non-smokers using cut-off of 10-15 ng/mL of cotinine in urine, usually adopted in epidemiological studies.

Key words: cotinine * environmental tobacco smoke * second hand smoker * epidemiological studies

INTRODUCCIÓN

El consumo de tabaco es la causa de morbilidad y mortalidad prematura más importante en el mundo sobre la cual se puede impactar con medidas preventivas. Las consecuencias de fumar son bien conocidas; incluyen un aumento de riesgo de contraer cáncer, enfisema y enfermedad cardiovascular. El tabaco ambiental es reconocido como carcinógeno y la exposición persistente al mismo está asociada con mayor riesgo de sufrir cáncer de pulmón y otras enfermedades. Los niños especialmente pueden exacerbar sus problemas asmáticos e incrementar la frecuencia de enfermedades del tracto respiratorio bajo, como bronquitis y neumonía (1).
En general, tanto la condición de fumador activo como pasivo ha sido determinada a través de cuestionarios o por análisis bioquímico de muestras biológicas: suero, saliva, orina o análisis químico del aire.
Las medidas de marcadores apropiados son útiles en los estudios epidemiológicos para mejorar la clasificación de la exposición al tabaco. Entre los marcadores de exposición al tabaco se incluyen carboxihemoglobina, ion tiocianato, nicotina y cotinina.
La cotinina es el principal metabolito de la nicotina (Fig. 1) y es corrientemente considerada el mejor biomarcador de consumo de tabaco en fumadores activos y de exposición ambiental al tabaco en los no fumadores (2) porque tiene una vida media de 18 a 20 horas, mientras que la nicotina tiene una vida media de 1 a 2 horas. Por otro lado, la cotinina puede ser detectada en distintos fluidos biológicos.
Muchos métodos han sido descritos para medir cotinina en orina (3-6). Estos análisis utilizaron para su cuantificación en su mayoría cromatografía gas-líquido (CGL) con detector de ionización de llama (FID), cromatografía gas-líquido con detector de ionización de llama nitrógeno selectivo (CG-NPD), también CGL acoplada a espectroscopia de masa (CG-MS). Otros métodos usados son cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detector ultravioleta (UV), o radioinmunoensayo (RIA).
En este trabajo se presenta una determinación de cotinina en orina humana por CGL accesible a laboratorios de mediana complejidad con sensibilidad suficiente para detectar concentraciones mayores de 3 ng/mL de manera de posibilitar la clasificación tanto de los fumadores activos como de los fumadores pasivos que resultan de la exposición al humo ambiental y que mostró buena correlación con el número de cigarrillos fumados declarados por los primeros.

Figura 1. Principales metabolitos de la nicotina.

MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos

Cotinine [(-)-cotinine, 98%] Sigma-Aldrich Argentina, lote 04913T1 CAS [486-56-6]. NaOH, NaCl, cloroformo y metanol Mallinckrodt p.a. Se utilizó piridina Merck p.a. (ACS) como control interno y gas nitrógeno de alta pureza como portador.

Soluciones estándares

Se prepararon tres soluciones metanólicas de cotinina (estándar externo) de 4,018 x 10^-4 g/mL, 4,018 x 10^-6 g/mL y 4,018 x 10^-8 g/mL con el fin de obtener el tiempo de retención en forma experimental mediante inyección manual de las muestras.
Se usó como estándar interno una solución de piridina 1,638 x 10^-4 g/mL en metanol.
Se obtuvieron cuatro soluciones testigo negativo a partir de orinas provenientes de individuos no fumadores, que no frecuentaban ambientes de fumadores, de diferentes edades, tratadas como las muestras de orina.
Con estas soluciones testigo negativo se elaboró un pool utilizado para preparar cinco muestras testigo: 2,308 x 10^-6; 5 x 10^-6; 5 x 10^-7; 2,308 x 10^-8; 5 x 10^-8 g/mL de cotinina mediante el agregado artificial de cotinina en diferentes proporciones previo al proceso de extracción, recibiendo el mismo tratamiento que las muestras.

Población de estudio

Grupo de 146 estudiantes de la Universidad de Mar del Plata que aceptaron participar del estudio (52 varones [35,9%] y 93 mujeres [64,1%]). Se realizó a cada alumno una encuesta epidemiológica para conocer datos demográficos y status de exposición a tabaco y se solicitó una muestra de orina.

Preparación de las muestras biológicas

Se solicitó la recolección de aproximadamente 50 mL de la primera orina de la mañana a cada participante, que fue colocada en un envase especial en forma aséptica. Las muestras de orina se conservaron en freezer a –70 °C hasta su análisis. Se procesaron colocando 25 mL en un tubo de centrifuga con el agregado de 1 mL NaOH 5M, 8,5 g de NaCl y 5 mL de cloroformo. Los tubos se agitaron en un vortex durante 5 min y luego se centrifugaron 10 min a 1.000 rpm. Se tomaron 4 mL de la fase clorofórmica, se colocaron en viales y se evaporaron a sequedad en ausencia de luz a 37 °C en estufa seca. La cotinina ha demostrado ser estable a esta temperatura (3). Para su inyección en el cromatógrafo el extracto se redisolvió con 100 µL de la solución metanólica del estándar interno.

Instrumentación

Se utilizó CGL (cromatografía gas-líquido) en un SHIMADZU CLASS-GC-17A (Kyoto, Japón) equipado con un detector de ionización de llama (FID). Columna capilar DB-5 (J&W). Longitud = 30 m. Diámetro interno = 0,253 mm. Modo split. El programa de temperaturas empleado consistió en: temperatura inicial 95 °C; temperatura final 290 °C con un gradiente de temperatura de: 20 °C/min. Temperatura del inyector 250 °C. Temperatura del detector 300 °C. Tiempo total de corrida 36,75 min.

Análisis estadístico

Se utilizó software SHIMADZU CLASS-GC-17A y Stata 7. Pruebas no paramétricas Sumrank de Wilkoxon y coeficiente de correlación rho de Spearman para datos que no siguen la distribución normal.

RESULTADOS

Esquema analítico

Utilizando los estándares externos de cotinina se determinó el tiempo de retención, que en estas condiciones de corrida fue de 11,40 a 11,44 min.
El rango de concentraciones de cotinina en orina, esperable en estudios epidemiológicos, comprende varios órdenes de magnitud, dado que muchas veces se estudian simultáneamente tanto a los fumadores activos como a los fumadores pasivos. Se esperan concentraciones menores de 15 ng/mL en fumadores pasivos mientras que en fumadores activos pueden alcanzarse concentraciones de 1.000 ng /mL o mayores. Por ello, utilizando la información de la encuesta epidemiológica, se procesaron primero los no fumadores y luego los que declararon ser fumadores, para minimizar los procesos de arrastre. Aproximadamente el 30% del grupo estudiado declaró ser fumador. Luego de la categorización de las muestras, se realizó la extracción y el análisis como se describió previamente.
En la confección de una única curva de calibración se percibió el problema del amplio rango de concentraciones a determinar, por lo que se consideró apropiada la construcción de dos curvas de calibración, a fin de minimizar los errores.
Para ello se trabajó con los estándares de concentraciones: 2,308 x 10^-8, y 2,308 x 10^-6 g cotinina /mL logrados mediante el agregado artificial de cotinina y sometidos a los mismos tratamientos que las muestras.
La muestra testigo de 2,308 x 10^-8 g/mL (23,08 ng/mL) representó una concentración baja posible para un fumador pasivo y la muestra testigo de 2,308 x 10^-6 g/mL (2.308 ng/mL), una concentración alta posible en un fumador activo.
La Relación de Área de Muestra (RAM) es el cociente del área bajo la curva del pico de cotinina sobre el área del pico de piridina (el estándar interno). Esta medida permite comparar diferentes corridas independizándose del error propio de la inyección manual. Los valores de RAM obtenidos se muestran en la Tabla I.

Tabla I. Relación de Área de Muestra (RAM) Promedio y Desviación Estándar.

Se confeccionaron las dos curvas de calibración utilizando regresión lineal basadas en 20 replicados, una para cubrir el intervalo de 3 a 100 ng/mL y la otra de 100 a 5.000 ng/mL.
Se obtuvieron las siguientes ecuaciones:

a) cotinina en no fumadores o fumadores pasivos,
Y = 574,12 X – 17,209 (r² = 0,9781, n= 20).

b) cotinina en fumadores, Y = 2.201,1 X – 129,27
(r² = 0,9999, n = 20)
Y = concentración de cotinina en ng/mL,
X = RAM obtenida en el cromatograma.

La medición del área bajo la curva que corresponde al tiempo de retención de cotinina del estándar negativo de orina (sin el metabolito) estableció el punto de corte a partir del cual se consideró como positiva de contenerlo. En todos los casos se observó un RAM similar, con un valor máximo de 0,0308 y un desvío estándar de 0,0045.
Se tomó en cuenta el mayor de los registros al que se le sumó el valor de un desvío estándar, es decir que se consideró como positiva la muestra que arrojó un valor de RAM mayor de 0,0353, lo cual equivale, según la ecuación para concentraciones bajas, a 3,1 ng/mL.

Correlación cotinina detectada y condición de fumador auto reportada

Se detectó cotinina en la orina del 79,2% de los no fumadores. La distribución de concentración de cotinina especialmente en fumadores fue asimétrica, por lo que la tendencia central fue mejor representada por la mediana y la dispersión por el rango intercuartílico como puede observarse en la Tabla II.
No hubo diferencias significativas en las medianas de cotinina entre sexos, ya sean las personas fumadoras o no fumadoras. Hubo diferencia estadísticamente entre las medianas de cotinina de fumadores y no fumadores. Wilcoxon sumrank: z = 4,865 p < 0,01. En la Figura 2 se puede observar la distribución de los valores de cotinina según cantidad de cigarrillos diarios promedio consumidos según declaración del encuestado.
Se observó, como sería esperable, correlación entre el número de cigarrillos fumados y la concentración de cotinina (rho de Spearman = 0,5672, p < 0,001).

Tabla II. Promedio, desvío estándar, mediana y cuartiles de cotinina considerando el status de exposición al tabaco (ng/mL).

Figura 2. Medianas y cuartiles de concentración de cotinina en orina según el número de cigarrillos fumados.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

El método CGL desarrollado presentó un límite de detección de cotinina de 3,1 ng/mL, el cual es bueno si se lo compara con el de 2,0 ng/mL obtenido mediante un equipo GC-MS e inyección automática (7), considerando que la orina es una matriz compleja. Este límite de detección permite la diferenciación entre los no fumadores y los fumadores activos o los no fumadores fuertemente expuestos en base a un valor cut-off de 10-15 ng/mL de cotinina en orina utilizado en los estudios epidemiológicos (8).
Los laboratorios de estudios ambientales en este país en general no cuentan con GC-MS o CG-NPD por lo que el método desarrollado es relativamente simple y podría ser utilizado con buenos resultados para estudios epidemiológicos de exposición ambiental.
Los estudiantes no fumadores estuvieron fuertemente expuestos a tabaco ambiental, presentando valores de cotinina mayores a los encontrados en adolescentes en otros estudios internacionales (9).
La exposición involuntaria al tabaco es un factor de riesgo evitable y se deben redoblar los esfuerzos para lograr la disminución de la prevalencia del hábito, y especialmente evitar fumar en espacios de estudio, laborales, o compartidos en todas sus formas, para disminuir el riesgo de exposición al tabaco ambiental.

Correspondencia

DRA. MARTA NOEMÍ VACCHINO
Charlone 172
(7600) MAR DEL PLATA, Buenos Aires, Argentina.
E-mail: vacchino@mdp.edu.ar

Referencias bibliográficas

1. Organización Panamericana de la Salud. La epidemia del tabaco. Publicación Científica N° 577. Washington, DC 20037, EUA. 2000. p. 23-31.
2. Benowitz N. Cotinine as a biomarker of environmental tobacco smoke exposure. Epidemiol Rev 1996; 18 (2): 188-203.
3. Bernert JTJra, Turner WE, Pirkle JL, Sosnoff CS, Akins JR, Waldrep MK, et al. Development and validation of sensitive method for determination of serum cotinine in smokers and nonsmokers by liquid chromatography /atmospheric pressure ionization tandem mass spectrometry. Clin Chem 1997; 43: 2281-91.
4. Preeti Dhar. Measuring tobacco smoke exposure: quantifying nicotine/cotinine concentration in biological samples by colorimetry, chromatography and immunoassay methods. J Pharm Biomed Anal 2004; 35 (1): 155-68.
5. Bazylak G, Brózik H, Sabanty W. HPTLC screening assay for urinary cotinine as biomarker of environmental tobacco smoke exposure among male adolescents. J Pharm Biomed Anal 2000; 24 (1): 113-23.
6. Kuo HW, Yang JS, Chiu MC. Determination of urinary and salivary cotinine using gas and liquid chromatography and enzyme-linked immunosorbent assay. J Chromatogr B Biomed Appl 2002; 768 (2): 297-303.
7. Skarping G, Willers S, Dalene M. Determination of cotinine in urine using glass capillary gas chromatography and selective detection, with special reference to the biological monitoring of passive smoking. J Chromatogr 1988; 454: 293-301.
8. Centers for Disease Control and Prevention. Third National Report on Human Exposure to Environmental Chemicals.2005. Available from: URL: http://www.cdc. gov/exposurereport/3rd/pdf/thirdreport.pdf(01/12/2005).
9. Bono R, Russo R, Scursatone E, Gilli G. Involuntary exposure to tobacco smoke in adolescents: urinary cotinine and environmental factors. Arch Environ Health 1996; 51 (2): 127-31.         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]         [ Links ]

Aprobado para su publicación el 28 de marzo de 2006